八寶丹抑制TNF-α誘導(dǎo)C2C12成肌細(xì)胞Atrogin-1表達(dá)的研究

趙棋琴，陳進(jìn)曉，沃 達(dá)，何 嘉，彭 軍，3，朱偉東，任丹妮，3*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化中心，福建福州 350122；3.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350122）

癌癥是全球主要死因之一［1］，50%的晚期癌癥患者都患有癌癥惡病質(zhì)［2］，癌癥惡病質(zhì)是癌癥患者死亡的主要原因［3］。骨骼肌萎縮是癌癥惡病質(zhì)最主要的臨床表現(xiàn)，其與患者器官功能障礙、生活質(zhì)量降低以及抗癌治療的耐受性和療效性降低相關(guān)［4］。目前缺乏治療肌肉萎縮的有效藥物，所以迫切需要研發(fā)新的藥物［5］。炎癥是骨骼肌萎縮的主要原因，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是重要的肌肉萎縮誘導(dǎo)因子［6］，核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路作為經(jīng)典炎癥信號通路，是炎癥因子誘導(dǎo)肌肉萎縮的一個重要步驟［7-8］，NF-κB 信號通路可被炎癥因子TNF-α激活，導(dǎo)致肌肉蛋白降解主要信號通路——泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）的關(guān)鍵組分泛素連接酶表達(dá)過度上調(diào)，最終使UPS 系統(tǒng)處于高度應(yīng)激狀態(tài)［9-10］，肌肉蛋白降解增多［11］。萎縮相關(guān)基因1（atrophy gene 1，Atrogin-1）是一種泛素連接酶，在骨骼肌中特異性表達(dá)，其過度表達(dá)會導(dǎo)致肌肉蛋白降解增多［12-13］。八寶丹（Babaodan，BBD）為我國經(jīng)典復(fù)方，臨床實(shí)踐證明BBD 作為多種晚期癌癥輔助用藥可提高患者生活質(zhì)量，緩解化療出現(xiàn)的不良反應(yīng)［14］，由此可見BBD 可以緩解晚期癌癥患者出現(xiàn)的不良狀態(tài)，但目前尚無BBD 治療癌癥惡病質(zhì)肌肉萎縮的相關(guān)研究。故本課題擬通過體外實(shí)驗(yàn)探討B(tài)BD 對TNF-α 誘導(dǎo)的NF-κB 信號通路及下游通路UPS 系統(tǒng)中Atrogin-1 表達(dá)的作用機(jī)制研究，為BBD 抑制肌蛋白降解相關(guān)通路提供了體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，也為治療癌癥惡病質(zhì)提供新的治療思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 C2C12 成肌細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫（目錄號：SCSP-505）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 BBD 購自廈門中藥廠股份有限公司（批號：190530）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 p-P65 抗體、p-IκB 抗體（美國CST公司，貨號：3033T、2859S）；GAPDH 抗體（美國Proteintech 公司，貨號：60004-1-Ig）；Atrogin-1 抗體（英國Abcam 公司，貨號：ab168372）；Goat-anti-Mouse-IgG、Goat-anti-Rabbit-IgG（美國Signaling Antibody公司，貨號：L3032、L3012）；DMEM 不完全高糖培養(yǎng)液（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，貨號：KGM12800 N-500）；胎牛血清（PEAK Serum 公司，貨號：S-FBSSA-015）；青霉素和鏈霉素混合液、0.4%臺盼藍(lán)染液、NP-40 裂解液（北京索萊寶科技有限公司，貨號：SV30010、C0040、N8032）；1×PBS 緩沖液（南京維森特生物技術(shù)有限公司，貨號：311-010-CL）；0.25%胰蛋白酶（美國Gibco 公司，貨號：25200072）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：AR0197）；MTT 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：C0009S）；蛋白酶抑制劑Cocktail、磷酸酶抑制劑Cocktail Ⅰ、磷酸酶抑制劑Cocktail Ⅱ（MCE公司，貨號：HY-K0010，HY-K0021、HYK0022）；SuperKineTM超敏型ECL 發(fā)光液（Abbkine 公司，貨號：BMU102-CN）；TNF-α 蛋白液（美國R&D Systems 公司，貨號：410-MT）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher 公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）；Countstar 全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher 公司）；干式恒溫金屬?。ㄉ虾Ｅ嗲嗫萍加邢薰荆?；SDS-PAGE 電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；Trans-Blot 小型轉(zhuǎn)膜槽轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；旋轉(zhuǎn)搖床（中國江蘇其林貝爾儀器有限公司）；超高靈敏化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 BBD藥液制備 稱取25 mg BBD溶于1 mL PBS緩沖液，制備成25 mg/mL BBD 藥液，儲存于-20 ℃冰箱中。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將C2C12 成肌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素混合液的DMEM 不完全高糖培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度至70%～80%進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，2 組比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。

2.4 MTT 法篩選BBD 干預(yù)細(xì)胞濃度 將C2C12 成肌細(xì)胞以3×103個/100 μL 的密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，待各組細(xì)胞匯合度至70%～80%，棄上清液，分別予0、0.125、0.25、0.5、0.75、1 mg/mL BBD 藥液干預(yù)48 h，每種濃度6 個復(fù)孔，48 h 后棄上清液，每孔加入濃度為0.5 mg/mL MTT 溶液100 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，每孔再加入100 μL Formazan 溶解液，適當(dāng)混勻，使用酶標(biāo)儀在570 nm 處測吸光度，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞活力。

MTT 法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度BBD 對C2C12成肌細(xì)胞活力無明顯影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果，最終選用0.75 mg/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)BBD的干預(yù)濃度［15］。

圖1 不同濃度BBD 對C2C12 細(xì)胞活力的影響

2.5 篩選TNF-α 上調(diào)p-P65 蛋白表達(dá)的濃度和時間 按3×105個/mL 的細(xì)胞密度，將對數(shù)生長期C2C12 成肌細(xì)胞接種于35 mm2培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞匯合度至70%～80%，分別加入0、1、10、50 ng/mL TNF-α 蛋白液干預(yù)C2C12 成肌細(xì)胞8 min。NP-40裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒定量，細(xì)胞總蛋白中加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（還原性，5×），再將其置于100 ℃干式恒溫金屬浴變性。20～30 μL 蛋白樣本經(jīng)聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝膠電泳完全分離后，TBST 洗膜3 次，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，TBST 洗膜3 次，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，TBST 洗膜，抗體p-P65（1∶1 000），GAPDH（1∶5 000）4 ℃孵育過夜，隨后TBST洗膜3 次，加Goat-anti-Mouse-IgG 或Goat-anti-Rabbit-IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST 清洗3 次，使用SuperKine?超敏型ECL 發(fā)光液顯色，將GAPDH作為總蛋白內(nèi)參，運(yùn)用Image J 軟件分析各目的蛋白的灰度值，比較不同TNF-α 濃度對p-P65 蛋白相對表達(dá)量的影響，結(jié)果見圖2。與0 ng/mL 比較，10、50 ng/mL TNF-α 分別刺激細(xì)胞后，p-P65 蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.05），最終選取TNF-α 刺激濃度為10 ng/mL。

再篩選TNF-α 上調(diào)p-P65 蛋白表達(dá)的最佳時間，按3×105個/mL 的細(xì)胞密度，將對數(shù)生長期C2C12 成肌細(xì)胞接種于35 mm2培養(yǎng)皿中，10 ng/mL TNF-α 蛋白液分別在8 min、15 min、30 min、1 h 刺激細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白及Western blot 法操作同前，結(jié)果見圖3，10 ng/mL TNF-α 刺激細(xì)胞8 min 顯著上調(diào)p-P65蛋白表達(dá)（P＜0.05），最終選取10 ng/mL TNF-α 刺激細(xì)胞8 min 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)干預(yù)濃度和時間。

圖2 不同TNF-α 濃度對p-P65 蛋白表達(dá)的影響

圖3 不同TNF-α 刺激時間對p-P65 蛋白表達(dá)的影響

2.6 篩選TNF-α 上調(diào)Atrogin-1 蛋白表達(dá)的濃度和時間 Atrogin-1 為NF-κB 信號通路下游通路指標(biāo)，對TNF-α 蛋白反應(yīng)時間不同，因此再篩選TNF-α 上調(diào)Atrogin-1 蛋白表達(dá)的濃度和時間。取對數(shù)生長期C2C12 成肌細(xì)胞按3×105個/mL 的細(xì)胞密度接種于35 mm2培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞匯合度至70%～80%，分別加入0、1、10、50 ng/mL TNF-α 蛋白液干預(yù)C2C12 成肌細(xì)胞4 h，Western blot 法步驟同前，Atrogin-1 和GAPDH 抗體稀釋比例分別為1∶1 000 和1∶5 000，結(jié)果見圖4。與0 ng/mL 比較，1、10、50 ng/mL TNF-α 刺激細(xì)胞后，Atrogin-1 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），為與前刺激濃度一致，最終選取TNF-α 刺激濃度為10 ng/mL。

圖4 不同TNF-α 濃度對Atrogin-1 蛋白表達(dá)的影響

再篩選TNF-α 上調(diào)Atrogin-1 蛋白表達(dá)的最佳時間，將對數(shù)生長期C2C12成肌細(xì)胞按3×105個/mL的細(xì)胞密度接種于35 mm2培養(yǎng)皿中，10 ng/mL TNF-α 蛋白液分別在8 min、15 min、30 min、1 h、4 h刺激細(xì)胞，Western blot 法操作同前，結(jié)果見圖5。10 ng/mL TNF-α 刺激細(xì)胞4 h 顯著上調(diào)Atrogin-1蛋白表達(dá)（P＜0.05），最終選取10 ng/mL TNF-α 刺激細(xì)胞4 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)干預(yù)濃度和時間。

圖5 不同TNF-α 刺激時間對Atrogin-1 蛋白表達(dá)的影響

2.7 BBD 對p-P65、Atrogin-1 蛋白表達(dá)的作用 按3×105個/mL 的細(xì)胞密度，取對數(shù)生長期C2C12 成肌細(xì)胞接種于35 mm2培養(yǎng)皿中，設(shè)置空白對照組，藥物對照組、模型組、八寶丹組，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%，藥物對照組和八寶丹組加入0.75 mg/mL BBD 藥液，同時空白對照組和模型組加入等體積PBS，預(yù)處理2 h。①模型組和八寶丹組加入10 ng/mL TNF-α 蛋白液，與此同時空白對照組和藥物對照組加入等體積PBS，刺激細(xì)胞8 min 后，冰PBS 收取細(xì)胞，與上述提取細(xì)胞總蛋白及Western blot 法步驟一致，檢測各組p-P65 蛋白表達(dá)；②模型組和八寶

圖6 4 組C2C12 成肌細(xì)胞p-P65 蛋白表達(dá)比較

3 討 論

肌肉萎縮是癌癥惡病質(zhì)患者死亡的預(yù)測因子［16］，在癌癥惡病質(zhì)的動物模型中，肌肉萎縮得到改善的動物模型病死率降低［17］，表明改善肌肉萎縮可能有助于提高惡病質(zhì)患者生存率。成肌細(xì)胞是體外研究肌肉生長修復(fù)重要的細(xì)胞系，目前用于實(shí)驗(yàn)研究的成肌細(xì)胞主要是C2C12 成肌細(xì)胞［18］。因此本研究選用C2C12 成肌細(xì)胞作為研究對象。炎癥是肌肉萎縮的常見觸發(fā)因素，炎癥因子是肌肉萎縮的有效誘導(dǎo)劑，TNF-α 已被證明對骨骼肌有分解代謝作用［19］，主要是通過激活NF-κB 信號通路［7］，TNF-α 通過結(jié)合并激活其同源受體TNF-αR后，促使IKKα 磷酸化IκBα 而被降解，NF-κB-IκB二聚體解離，NF-κB p65 亞單位上的S536 發(fā)生磷酸化，使得NF-κB 入核調(diào)控下游基因表達(dá)，從而導(dǎo)致丹組加入10 ng/mL TNF-α 蛋白液，同時空白對照組和藥物對照組加入等體積PBS，刺激細(xì)胞4 h 后，冰PBS 收取細(xì)胞，與上述提取細(xì)胞總蛋白及Western blot 法步驟一致，檢測各組Atrogin-1 蛋白表達(dá)。

圖7 4 組C2C12 成肌細(xì)胞Atrogin-1 蛋白表達(dá)比較

圖6 結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組p-P65 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），而與模型組比較，八寶丹組p-P65 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）。圖7 結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組Atrogin-1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），而與模型組比較，八寶丹組Atrogin-1 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。UPS 中泛素連接酶如Atrogin-1 過度上調(diào)，肌肉蛋白質(zhì)降解增多［9］。故選取TNF-α 蛋白液刺激C2C12成肌細(xì)胞模擬體內(nèi)炎癥引起的肌肉萎縮模型，因p-P65 及下游通路指標(biāo)Atrogin-1 在不同時間點(diǎn)對TNF-α 反應(yīng)時間不一致，故分別篩選TNF-α 上調(diào)p-P65、Atrogin-1 表達(dá)的最佳濃度和時間。結(jié)果表明10 ng/mL TNF-α 刺激細(xì)胞8 min 顯著上調(diào)p-P65蛋白表達(dá)，而10 ng/mL TNF-α 刺激細(xì)胞4 h 顯著上調(diào)Atrogin-1 蛋白表達(dá)。

癌癥惡病質(zhì)歸為中醫(yī)“虛勞”范疇［20］，治療原則為扶正固本、化痰祛濕、活血化瘀解毒以助癌毒消散［21］。BBD 由牛黃、蛇膽、羚羊角、麝香、珍珠、三七和兩種保密藥物組成，功效為清利濕熱、活血解毒、通經(jīng)止痛，其功效基本符合中醫(yī)對癌癥惡病質(zhì)的治療原則［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，BBD 可抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB 信號通路中NF-κB 的磷酸化水平及下游通路Atrogin-1 蛋白表達(dá)，表明BBD 可能通過抑制NF-κB 通路的激活進(jìn)而削弱UPS 系統(tǒng)的活性，減少肌肉蛋白降解量。本研究為有效防治癌癥惡病質(zhì)肌肉萎縮提供了研究基礎(chǔ)，但BBD 對癌癥惡病質(zhì)肌肉萎縮動物模型的作用有待進(jìn)一步研究探討。