基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討十一味參芪制劑治療腫瘤作用機制研究

黃博威，劉啟鴻，溫勁羽，張慧玲，趙紅佳*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建福州 350004；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建福州 350003）

流行病學(xué)資料顯示，惡性腫瘤是我國病死率最高的一種疾病，嚴(yán)重危害著人們的生命健康［1］，至今還被WTO 確定為是一種慢性消耗性疾病。腫瘤的治療一直都是醫(yī)學(xué)界極為迫切需要解決的問題，但由于腫瘤的類型較為繁多，所反映出來的病理表現(xiàn)與臨床癥狀各不相同。近些年來，眾多研究者通過臨床試驗研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在腫瘤防治中發(fā)揮了不可小覷的作用，主要以扶正祛邪為原則，達到“正氣存內(nèi)，邪不可干”的效果。十一味參芪制劑是臨床上治療腫瘤常用的中成藥，由人參、黃芪、天麻、菟絲子等11 味中藥加工制成，具有抗癌扶正祛邪、健脾補氣養(yǎng)血、益腎填精生髓的作用。前期通過系統(tǒng)評價顯示，十一味參芪制劑能有效提高腫瘤患者臨床療效穩(wěn)定率，改善骨髓抑制和腎功能，降低化療的胃腸道不良反應(yīng)，提高患者生活質(zhì)量，治療安全性較好［2］。但是，該制劑防治腫瘤的作用機制并未明晰。由于中藥復(fù)方具有綜合整體調(diào)節(jié)的作用，通過傳統(tǒng)的單藥研究難以反映出中藥復(fù)方的療效，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)正好能彌補這一不足，借助對生物網(wǎng)絡(luò)進行分析，將藥物作用靶點的網(wǎng)絡(luò)進行整合，是一種綜合研究藥物作用機制的新技術(shù)［3］。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探索十一味參芪制劑干預(yù)治療腫瘤的可能作用機制，為推動中醫(yī)藥的傳承與發(fā)展做貢獻。

1 資料與方法

1.1 篩選活性成分及靶點 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析工具TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以人參、黃芪、天麻、當(dāng)歸、熟地黃、澤瀉、決明子、菟絲子、枸杞子、細(xì)辛為關(guān)鍵詞，查找這10 味藥的化學(xué)成分，將口服生物利用度（OB≥30%）與類藥性（DL≥0.18）作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，對所檢索到的活性成分進行分析［4］。利用BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）查找TCMSP 未收錄的鹿角化學(xué)成分，由此建立十一味參芪制劑的成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。利用TCMSP 和BATMAN-TCM 查找十一味參芪制劑化合物對應(yīng)的靶標(biāo)蛋白，將靶標(biāo)蛋白通過Unitprot 數(shù)據(jù)庫（http：//www.Unitprot.org/）查詢相應(yīng)的基因ID。

1.2 腫瘤靶點獲取 采用GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）以“Cancer”作為檢索詞，進行相關(guān)靶基因的獲取，從而構(gòu)建腫瘤的靶基因庫。

1.3 藥物與疾病交集靶點的獲取 借助Venny 2.1工具繪制十一味參芪制劑藥物靶標(biāo)基因與腫瘤靶點的韋恩圖，并獲得二者交集靶點信息，即為十一味參芪制劑治療腫瘤的作用靶點。

1.4 可視化網(wǎng)絡(luò)體系的構(gòu)建 將交集靶點輸入STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），設(shè)置物種為“homo sapiens”，作用閾值“＞0.9”［5］，繪制蛋白互作的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。再將得到的結(jié)果CSV 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件進行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯玫侥繕?biāo)靶點之間的連接圖，運用R 語言軟件對其結(jié)果進行分析整理。同時進一步可視化地構(gòu)建“藥物-靶點-疾病”相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 功能與通路富集分析 利用Metascape 平臺對交集靶點進行GO 與KEGG 富集分析。通過GO 分析基因靶點的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞成分、分子功能和生物過程3 個方面的作用。借助KEGG 通路分析獲得參與的相關(guān)通路，從分子生物學(xué)角度闡釋十一味參芪制劑治療腫瘤的作用機制。

2 結(jié) 果

2.1 十一味參芪制劑有效成分與腫瘤靶點 運用TCMSP、BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫中搜索十一味參芪制劑各味藥的有效成分，共有175 個化合物，其中人參22 個、黃芪21 個、天麻23 個、當(dāng)歸2 個、熟地黃2 個、澤瀉10 個、決明子14 個、菟絲子11 個、鹿角2 個、枸杞子60 個、細(xì)辛8 個，其中各味藥的主要成分見表1。將有效成分進一步分析，共得到潛在有效靶點856 個。借助GeneCards 數(shù)據(jù)庫中檢索到26 151 個腫瘤相關(guān)靶點基因。通過繪制韋恩圖，得到藥物-疾病交互靶點821 個。見圖1。

表1 十一味參芪制劑的主要化學(xué)成分

圖1 藥物-疾病交互靶點韋恩圖

2.2 可視化網(wǎng)絡(luò)體系及其關(guān)鍵靶點的獲取 將821 個交集靶標(biāo)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)，獲得蛋白間的相互作用信息，再將網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件進行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，得到靶點連接圖，見圖2。發(fā)現(xiàn)該網(wǎng)絡(luò)中包含了184 個節(jié)點和592 條邊，217 個潛在核心靶點，節(jié)點平均度值為8.811，其中視黃醇X 受體α（retinoid X receptor alpha，RXRA）、CREB結(jié)合蛋白（CREB-binding protein，CREBBP）、核受體輔激活蛋白1（nuclear receptor coactivator 1，NCOA1）、轉(zhuǎn)錄中介體亞基1（MED1）、視黃醇X受體β（retinoid X receptor beta，RXRB）、視黃醇X 受體γ（retinoid X receptor gamma，RXRG）、核受體輔激活蛋白2（nuclear receptor coactivator 2，NCOA2）等82 個節(jié)點度值高于平均值，即為十一味參芪制劑干預(yù)腫瘤的核心靶點，見圖3。

圖2 共同靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖3 核心靶點

2.3 藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò) 運用Cytoscape 3.7.2軟件，導(dǎo)入相應(yīng)文件后構(gòu)建“藥物-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中有217 個疾病靶點，每條連線代表十一味參芪制劑與藥物、藥物與作用靶點、作用靶點與腫瘤之間的作用關(guān)系。見圖4。

2.4 GO 功能富集分析 GO 分析分別取前10 條目錄進行條形圖展示，見圖5。GO 分析結(jié)果顯示，十一味參芪制劑的活性成分影響的相關(guān)蛋白基因主要富集在分子功能中的氧化還原酶活性、維生素結(jié)合、羧酸結(jié)合、陽離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性等方面；生物過程中的細(xì)胞對無機物、有毒物質(zhì)和脂多糖以及化學(xué)刺激的反應(yīng)，對活性氧代謝、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)等方面；細(xì)胞組分中的樹突、突觸后、軸突、離子通道復(fù)合物等方面。

圖4 “藥物-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖5 十一味參芪制劑GO 基因功能富集分析

2.5 KEGG 富集結(jié)果分析 篩選前20 條通路進行部分展示，根據(jù)結(jié)果可以看出主要涉及與腫瘤相關(guān)通絡(luò)（pathways in cancer）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、化學(xué)致癌通路（chemical carcinogenic-receptor activation）、cGMP-PKG 信號通路、MAPK 信號通路、PI3K-Akt信號通路等。見圖6。

3 討 論

在中醫(yī)學(xué)中，腫瘤作為一種通常以機體局部病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的惡性疾病，尤其是惡性腫瘤，其根本病機在于正氣虛損，氣血陰陽失調(diào)，致邪實亢盛，故治療上應(yīng)以扶正祛邪為主。正如《黃帝內(nèi)經(jīng)》所云：“有胃氣則生，無胃氣則亡”，顧護胃氣和補益氣血是扶正祛邪的關(guān)鍵和前提，其在抗腫瘤治療中的作用不可忽視。十一味參芪制劑是臨床上常用于補氣扶正的中成藥，方以黃芪和人參為君，黃芪可補氣固表，益衛(wèi)升陽，具有托毒生肌之功；人參大補元氣，復(fù)脈固脫，健脾益肺，使五臟之氣得以充實。當(dāng)歸補血、活血止痛，熟地黃滋陰補血，二者為臣以滋陰生血、填精生髓。佐以菟絲子、枸杞子、澤瀉、決明子、鹿角、天麻，可滋補肝腎、益精生髓。全方補血與補氣藥配伍巧妙，共奏氣血雙補、健脾補腎的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究也證實，方中主要成分人參中含有的皂苷和多糖，具有提高白細(xì)胞數(shù)量，增強人體細(xì)胞免疫功能，抑制腫瘤細(xì)胞生長和誘導(dǎo)凋亡的作用；黃芪同樣可以提高機體免疫功能，維持內(nèi)環(huán)境的平衡穩(wěn)定［6-7］。

圖6 十一味參芪制劑KEGG 通路分析

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，十一味參芪制劑干預(yù)腫瘤的主要活性化學(xué)成分包括山柰酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（Beta-sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）、異鼠李素（isorhamnetin）、芝麻素（sesamin）、蘆薈大黃素（aloe-emodin）、芒柄花黃素（formononetin）等。其中山柰酚、槲皮素、異鼠李素為黃酮類化合物，黃酮類物質(zhì)具有多重抗腫瘤效應(yīng)和廣泛的生物學(xué)活性。藥理學(xué)研究表明，山柰酚、槲皮素具有抗炎、抗氧化作用，可通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、增強抑癌基因活性及抑制癌基因表達等方面起到抗癌作用［8-9］。而異鼠李素不僅可以通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR、Ras/MAPK、Wnt/β-catenin 等 信號通路發(fā)揮抗癌作用，還可以增強包含鉑類化合物、5-氟尿嘧啶、卡培他濱等多種化療藥物的抗癌活性［10］。β-谷甾醇和豆甾醇均為植物甾醇，可抑制消化道腫瘤生長。研究表明，β-谷甾醇可使胃癌細(xì)胞中AMPK、PTEN 蛋白表達增加，HS90 蛋白表達下調(diào)，進而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制其生長［11］。王凱等［12］發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可通過抑制CDC25B 蛋白的表達，促進肝癌細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖。豆甾醇可通過阻滯細(xì)胞分裂周期及ROS 的氧化、鈣離子濃度上升的級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 凋亡［13］。芝麻素作為一種常見的天然木脂類化合物，可在抗增殖、抗轉(zhuǎn)移、促凋亡和促進自噬等方面起到抗癌作用，研究表明這可能與芝麻素選擇性參與NF-κB、STAT3、JNK、ERK1/2、p38 MAPK、PI3K/Akt、胱天蛋白酶-3 以及p53 信號通路有關(guān)［14］。蘆薈大黃素在作用于肝癌細(xì)胞時可以通過抑制Src/STAT3 信號通路抑制其增殖與遷移［15］。芒柄花黃素作為十一味參芪制劑中君藥黃芪的主要活性化學(xué)成分，已被研究證實其對肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌都有明顯的抑制作用［16］。

通過對PPI 網(wǎng)絡(luò)的深入研究發(fā)現(xiàn)，十一味參芪制劑治療腫瘤的主要核心靶點有RXRA、CREBBP、NCOA1、MED1、RXRB 和RXRG 等。RXRA、RXRB、RXRG 屬于類視黃醇X 受體（retinoid X receptors，RXRs）的3 種不同亞型，屬于配體依賴性核受體，在細(xì)胞增殖、分化、代謝、炎癥等生理功能方面發(fā)揮廣泛的調(diào)控作用，其異常表達在癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮促進作用［17］。研究報道，CREBBP能夠抑制炎性腸病相關(guān)結(jié)直腸進展，同時也是一種能夠維持人體正常造血功能的重要腫瘤抑制基因［18］。NCOA1 具有促炎、促血管生成的作用，促使細(xì)胞的侵襲和增殖［19］。研究表明，MED1 基因在乳腺癌中高表達，能夠促進癌細(xì)胞的增殖，沉默該MED1 基因后增殖現(xiàn)象明顯受到抑制［20］。

為進一步研究核心靶點在基因功能和信號通路的作用，本研究進行GO 生物學(xué)功能富集分析，發(fā)現(xiàn)上述核心靶點基因可以通過影響活性氧代謝、細(xì)胞凋亡氧化還原酶活性、維生素結(jié)合、羧酸結(jié)合、陽離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性等途徑起到抗腫瘤的作用。KEGG 通路分析顯示，十一味參芪制劑干預(yù)腫瘤的靶標(biāo)基因主要富集的通路涉及與腫瘤相關(guān)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、化學(xué)致癌作用通路、cGMP-PKG 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 通路等，這些通路等與癌癥間接相關(guān)，可起到抗癌作用。研究表明，cGMP-PKG 信號通路對維持血管穩(wěn)態(tài)具有重要的作用，激活cGMP-PKG 信號通路可抑制腫瘤細(xì)胞的血管新生，提示十一味參芪制劑可能通過激活該通路調(diào)控腫瘤［21］。PI3K-Akt信號通路參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲與遷移的調(diào)控，該通路在癌細(xì)胞中呈過度激活狀態(tài)，其通路中的節(jié)點是靶向藥物治療的核心靶點［22］。MAPK信號通路是調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過程的關(guān)鍵信號通路，能夠抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯［23］。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，挖掘了十一味參芪制劑作用于腫瘤的重要活性成分及核心靶點基因，并借助KEGG 富集分析闡釋其信號通路及分子作用機制，可為十一味參芪制劑干預(yù)腫瘤的臨床應(yīng)用提供依據(jù)，為進一步的實驗研究奠定基礎(chǔ)和提供新方向，但以上研究仍然需要通過體內(nèi)、外實驗針對某種具體腫瘤開展進一步驗證。