低鹽高堿度條件下氨氮對南美白對蝦幼蝦的急性毒性試驗

宋國林 ，趙映燦，劉 哲

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

南美白對蝦(Litopenaeusannamei)學(xué)名為凡納濱對蝦，隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、對蝦科(Penaeidae)、濱對蝦屬(Litopenaeus)的動物[1]，其外形與中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis)、墨吉對蝦(Penaeusmerguiensis)極為相似。南美白對蝦為廣溫廣鹽性熱帶蝦類，成蝦多生活于離岸較近的沿岸水域，幼蝦棲息于餌料豐富的河口區(qū)，是目前世界上三大養(yǎng)殖對蝦中單產(chǎn)量最高的優(yōu)良品種[2-3]，原產(chǎn)于南美太平洋沿岸的水域，我國于1988年引進(jìn)并大規(guī)模地推廣養(yǎng)殖[4]。

隨著市場需求的增加，全國沿海掀起南美白對蝦大規(guī)模養(yǎng)殖熱潮，其產(chǎn)量約占中國所有養(yǎng)殖蝦類總產(chǎn)量的80%。但隨著近海養(yǎng)殖面積的擴(kuò)大以及養(yǎng)殖總量的增加，近海海水環(huán)境惡化，蝦病發(fā)生日趨頻繁。這促使南美白對蝦在內(nèi)陸淡水水域的養(yǎng)殖市場不斷擴(kuò)大，尤其是在鹽堿地水域[5]，內(nèi)陸鹽堿水多表現(xiàn)為低鹽度高堿度，鹽堿水對南美白對蝦脅迫相關(guān)的研究也受到了學(xué)術(shù)界的高度關(guān)注[6]。氨氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中重要的污染脅迫因子，特別是在養(yǎng)殖的中后期，水體中氨氮積累過量對水產(chǎn)動物有明顯毒害作用[7-9]。長時間高濃度氨氮脅迫會影響到甲殼動物的免疫力及生長速度，甚至出現(xiàn)死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。目前國內(nèi)外關(guān)于氨氮對南美白對蝦的毒性研究主要集中于自然海水養(yǎng)殖[9]，但對于內(nèi)陸鹽堿地低鹽高堿度條件下氨氮對南美白對蝦的急性毒性研究未見相關(guān)報道。因此，本試驗通過模擬西北地區(qū)養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，研究氨氮對南美白對蝦幼蝦的急性毒性試驗，找出半致死濃度(LC50)和安全質(zhì)量濃度(SC)，以期為內(nèi)陸地區(qū)南美白對蝦產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

蝦苗：本試驗采用的南美白對蝦幼蝦購買于廣東湛江育苗場。試驗前，幼蝦置于體積為0.91 m×0.50 m×0.58 m、有效水量176 L的水箱中淡化暫養(yǎng)。初始暫養(yǎng)鹽度為25，水溫為21℃，穩(wěn)定2 d后逐步降低鹽度，待鹽度降至5時添加NaHCO3，逐步升高總堿度至250 mg/L。暫養(yǎng)期間用氣石連續(xù)微量充氣，并利用鹵蟲、蝦片等進(jìn)行少量多次的投喂，隨機(jī)挑選體質(zhì)健壯、大小均勻、平均全長為(1.12±0.45)cm的南美白對蝦幼蝦作為試驗對象。

試驗藥品：分析純NH4Cl(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；分析純NaHCO3(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

試驗用水：充分曝氣后的自來水，用加熱棒控制水溫至(21.0±0.5)℃、用海水晶調(diào)節(jié)鹽度至5、溶解氧7.0 mg/L，pH 8.30，用NaHCO3調(diào)節(jié)總堿度為250 mg/L。

試驗容器：使用容積為2.5 L的塑料盒作為試驗容器，每盒裝2 L鹽度為5、總堿度為250 mg/L的人工配制海水。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)試驗

試驗參照《魚類急性毒性試驗方法》[10]中毒性測定法的相關(guān)規(guī)定：在塑料盒中加入1.5 L經(jīng)處理鹽度為5、總堿度為250 mg/L的試驗用水，參照北方養(yǎng)殖初期池塘水溫，將試驗水溫設(shè)置為21℃，溶解氧為6.5 mg/L，pH 8.30；每個塑料盒中放入試驗對蝦10尾，將氯化銨分別以10倍級差稀釋成5個質(zhì)量濃度組(0、0.1、1、10、100 mg/L)。試驗期間停止投喂，測定水體pH值和水溫，及時清污、記錄并撈出死亡個體，根據(jù)試驗結(jié)果，確定24 h氨氮對南美白對蝦幼蝦全部存活時的最高質(zhì)量濃度和全部致死時最低質(zhì)量濃度。

1.2.2 急性毒性試驗

根據(jù)預(yù)試驗確定的試驗液質(zhì)量濃度的范圍，按等對數(shù)間距設(shè)置7個試驗濃度梯度組(組別1～7)及1個空白對照組，同時每個梯度設(shè)置4個平行(表1)。每組放10尾活力好、大小均勻的南美白對蝦幼蝦，整個試驗過程不充氣、不投餌，為保證試驗液的濃度保持穩(wěn)定并有充足的溶解氧，每隔12 h進(jìn)行吸污一次，及時用鑷子剔除死亡個體并觀察其特征，每隔24 h用等濃度人工配制海水換水一次，換水率為100%。用納氏試劑光度法[11]進(jìn)行氨氮測定調(diào)節(jié)，并間隔12 h監(jiān)測各試驗液中氨氮濃度以及水溫、pH值等各項指標(biāo)。定時觀察南美白對蝦幼蝦的活力及死亡情況，并記錄24、48、72、96 h南美白對蝦幼蝦的死亡尾數(shù)。

表1 氨氮對南美白對蝦幼蝦急性毒性試驗濃度梯度

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2010軟件進(jìn)行處理，計算各處理組24、48、72、96 h的死亡率，死亡率=死亡的對蝦數(shù)/試驗對蝦總數(shù)×100%；利用SPSS 25.0軟件的Probit回歸算法計算氨氮對南美白對蝦幼蝦的半致死質(zhì)量濃度。再根據(jù)下列公式(1)計算安全質(zhì)量濃度[12]：

安全質(zhì)量濃度(SC)= 96 h LC50×0.1

(1)

分子氨(NH3-Nm)在氨氮(NH3-Nt)中所占的比例，與pH、水溫及鹽度有關(guān)。根據(jù)氨氮濃度可以求出分子氨濃度：

(2)

式(2)中，pKaS，T=9.24+0.003 091S+0.032 4(298-T)(T為開氏溫度，T=273+t，t為攝氏溫度；S為鹽度；pKaS，T為電離常數(shù))。

2 結(jié)果

2.1 南美白對蝦幼蝦對氨氮的中毒反應(yīng)

南美白對蝦幼蝦從暫養(yǎng)水箱放入盛有試驗液的塑料盒后，最初各組幼蝦大多數(shù)在塑料盒底部正常游動。隨著氨氮脅迫時間的延長，低氨氮濃度組的南美白對蝦幼蝦行為變化不明顯；而高氨氮濃度組南美白對蝦幼蝦表現(xiàn)為焦躁不安，在水中多沿著塑料盒壁快速游動(離群獨游)，2 h后軟弱無力，易被抓捕，12 h后幼蝦鰓區(qū)呈藍(lán)綠色、蝦體肌肉白濁、肝胰臟白化或淡黃色、空腸不空胃，嚴(yán)重者喪失游泳能力、沉于塑料盒盒底，腹肢和游泳足不擺動，用玻璃棒碰觸無反應(yīng)，陸續(xù)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，死后鰓蓋張開。

2.2 氨氮對南美白對蝦幼蝦的急性毒性作用

氨氮對南美白對蝦幼蝦的急性毒性作用見表2。對照組的蝦全部存活，在相同時間內(nèi)，隨著氨氮質(zhì)量濃度的增加，南美白對蝦幼蝦的死亡率逐漸增加。氨氮為2.23 mg/L時，96 h累積死亡率為0%；當(dāng)氨氮為89.12 mg/L時，96 h的累積死亡率均達(dá)到100%；氨氮為190.00 mg/L時，48、72、96 h累積死亡率全為100%。同一藥物濃度下，隨著試驗時間的增加，南美白對蝦幼蝦的死亡率也隨之增加，具有明顯的劑量-時間-效應(yīng)關(guān)系。

表2 氨氮對南美白對蝦急性毒性試驗結(jié)果

根據(jù)表2所得試驗結(jié)果，通過Probit法對各時間段的死亡率對數(shù)與氨氮質(zhì)量濃度進(jìn)行擬合回歸分析，得出半致死濃度和安全質(zhì)量濃度結(jié)果(表3)。在低鹽高堿度條件下，氨氮對南美白對蝦幼蝦的24、48、72、96 h半致死質(zhì)量濃度分別為1 001.17、63.41、47.98、28.30 mg/L，安全質(zhì)量濃度為2.83 mg/L；分子氨的半致死質(zhì)量濃度分別為76.06、4.82、3.64、2.15 mg/L，安全質(zhì)量濃度為0.22 mg/L。

表3 氨氮對南美白對蝦的半致死濃度(LC50)和安全質(zhì)量濃度(SC)

3 討論

氨氮是指水中以分子氨和銨離子形式存在的氮，它是引起水生生物中毒的主要環(huán)境因子[14]。在養(yǎng)殖水體中，有機(jī)物中的氮被微生物降解、氨化，最終轉(zhuǎn)化為氨氮。另外，蝦類屬于直接排氨型，其中約60%～70%的含氮排泄物是以氨氮的形式經(jīng)鰓組織直接排入到養(yǎng)殖水環(huán)境中，其余的少數(shù)含氮排泄物以尿酸鹽或尿素的形式排出[15]。氨氮中起毒害作用的物質(zhì)主要是分子氨，分子氨在氨氮中占比與pH、鹽度和溫度密切相關(guān)，分子氨和銨離子可以相互轉(zhuǎn)化。當(dāng)pH值升高時，銨離子轉(zhuǎn)化分子氨，分子氨含量增加，氨氮的毒性增強(qiáng)；水溫升高，氨氮的毒性增加[13]。氨氮嚴(yán)重影響蝦類的育苗和健康養(yǎng)殖，當(dāng)氨氮在水中不斷積累時，其自身的細(xì)胞、組織、器官和系統(tǒng)的生理活動將受到嚴(yán)重的影響[16-18]。南美白對蝦氮代謝產(chǎn)物主要是氨氮[15]，當(dāng)養(yǎng)殖水體環(huán)境中氨氮含量過高時，動物對氨氮代謝活動受阻，并且水體中氨氮可以通過其鰓上皮大量滲入體內(nèi)[18]，會對養(yǎng)殖動物自身代謝所產(chǎn)生氨氮的正常排泄引發(fā)抑制，導(dǎo)致動物體內(nèi)血氨的濃度升高，進(jìn)而降低血液的載氧能力，影響?zhàn)B殖動物的呼吸作用[19]。本研究中，高濃度氨氮組幼蝦死亡時鰓蓋張開、體色發(fā)白，表明血藍(lán)蛋白處于還原態(tài)，此時血液中氧含量不足，幼蝦因缺氧窒息死亡，與王桂霞等[19]結(jié)論吻合。

有關(guān)氨氮對南美白對蝦的毒性已有較多的報道[20-23]，而關(guān)于低鹽高堿度條件下氨氮對南美白對蝦的急性毒性試驗未見報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在設(shè)置的氨氮濃度范圍內(nèi)，幼蝦的存活率與氨氮濃度呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。這與上述報道中的結(jié)果類似，表明氨氮濃度升高會對南美白對蝦幼蝦產(chǎn)生毒性效應(yīng)。甲殼動物的幼體對氨氮比較敏感，而隨著個體生長以育，對氨氮的耐受性增強(qiáng)[24]。本試驗使用全長為1.12 cm的幼蝦，對氨氮和分子氨的安全質(zhì)量分別為2.83、0.22 mg/L，和表4中全長5 cm幼蝦的耐受性相當(dāng)[22]，遠(yuǎn)高于彭自然等[21]的研究結(jié)果，因此，在低鹽高堿度條件下，離子強(qiáng)度也會影響分子氨的濃度，其濃度隨離子強(qiáng)度的增大而降低，氨氮毒性作用減弱。歐洲內(nèi)陸漁業(yè)咨詢委員會規(guī)定魚類養(yǎng)殖的分子氨濃度不得超過0.025 mg/L[25]，與該標(biāo)準(zhǔn)相比，在低鹽高堿度條件下，南美白對蝦幼蝦對氨氮的耐受性較強(qiáng)，且南美白對蝦具有較高的經(jīng)濟(jì)價值，適合在西北內(nèi)陸進(jìn)行大面積推廣養(yǎng)殖。

表4 氨氮對不同發(fā)育階段南美白對蝦的安全質(zhì)量濃度

蝦苗集中標(biāo)粗時密度大，而且處于密閉的大棚中，氨氮往往超過3 mg/L，這是誘發(fā)南美白對蝦“轉(zhuǎn)肝期”發(fā)病的主要環(huán)境因素之一。為此，提出以下降低養(yǎng)殖水體中氨氮的有效途徑：1)合理設(shè)計養(yǎng)殖密度，根據(jù)養(yǎng)殖條件設(shè)計適宜的養(yǎng)殖密度，避免放養(yǎng)密度過大。2)科學(xué)投餌管理，選用優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)飼料，最好含有微生態(tài)制劑的飼料，控制投喂量，盡可能采用少量多次的方式，以防止飼料過剩帶來的水質(zhì)敗壞。3)合理使用增氧機(jī)，增加水體的溶解氧含量，從而加快硝化反應(yīng)，降低水中的氨氮濃度。4)定期更換新水，是最快、最有效減少水中氨氮的方法，降低環(huán)境脅迫力。更換的水質(zhì)要好，水的溫度與養(yǎng)殖用水體的溫度要基本一致，避免幼蝦因溫度突變而使機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激。5)定時監(jiān)測水體中pH值和溫度等各項指標(biāo)，避免因養(yǎng)殖水體中pH和溫度過高而導(dǎo)致有毒性的分子氨含量增加[26]。

4 結(jié)論

在水溫為21℃、鹽度為5、總堿度為250 mg/L、pH=8.3條件下，氨氮和分子氨對南美白對蝦的安全質(zhì)量濃度分別為2.83、0.22 mg/L。