莆田地區(qū)新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥突變基因型及酶活性亞型分析

周建福 劉莉莉 黃茂新 王桂芝 張一冰 林 堃

莆田學(xué)院附屬醫(yī)院1.新生兒科；2.小兒神經(jīng)康復(fù)科；3.新生兒疾病篩查中心，福建 莆田 351100

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-PD）缺乏癥是世界上最常見的一種遺傳性紅細胞酶?。?］，非洲大陸、地中海沿岸國家、中東地區(qū)和亞洲是高發(fā)區(qū)域［2］。我國不同地區(qū)人群G-6-PD 缺乏癥的發(fā)生率相差甚遠［3］。國家臨床實驗中心報告的G-6-PD缺乏癥發(fā)生率為1∶44［4］。出生前G-6-PD 缺乏癥可發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎及胎兒水腫；出生后可表現(xiàn)為溶血、貧血、黃疸，嚴重者并發(fā)膽紅素腦病，甚至死亡［5］。慢性發(fā)病者可出現(xiàn)非球形紅細胞溶血性貧血［6］。

目前G-6-PD 缺乏癥尚無有效的治療措施，因此，盡早明確新生兒G-6-PD缺乏癥的基因型及酶活性亞型，早發(fā)現(xiàn)早預(yù)防，對提高本地區(qū)出生人口素質(zhì)和群體生命健康水平具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

統(tǒng)計2020年7月—2021年6月莆田學(xué)院附屬醫(yī)院新生兒疾病篩查中心的25 174 份濾紙片干血斑樣本，其中男性13 071例，女性12 103例，男女比為1.08∶1；收集G-6-PD 缺乏癥篩查陽性病例共215例，陽性率0.85%；男性176例，女性39例，男女比為4.51∶1。告知受檢病例的監(jiān)護人關(guān)于檢測G-6-PD缺乏癥突變基因及酶活性的必要性，征得監(jiān)護人同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 采用速率法檢測G-6-PD 酶活性 針對G-6-PD 缺乏癥篩查陽性病例，采用速率法檢測酶活性。靜脈空腹采血，檢測樣本采用壓積紅細胞，用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝血，采集的抗凝血樣本密封2 ～8 ℃保存，可穩(wěn)定2周。樣品處理：抗凝血以4 000 r/min離心5 min，避開血漿層用加樣器準(zhǔn)確吸取壓積紅細胞20 μL加入到1 mL溶解液中溶解，待紅細胞完全溶解后（約1 ～2 min）上機測定，測定時間不得超過25 min，否則會因G-6-PD 失活而造成結(jié)果假性偏低。

結(jié)果判讀：酶活性＜1 700 U/L 為陽性，可生化診斷G-6-PD 缺乏；酶活性≥1 700 ～4 000 U/L 為正常。

1.2.2 采用MMCA 法檢測G-6-PD 突變基因 根據(jù)2019年新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查與診斷實驗室檢測技術(shù)專家共識［7］的推薦，采用多色熔解曲線分析法（multicolor melting curve analysis，MMCA）檢測G-6-PD 缺乏癥突變基因。該檢測技術(shù)原理是利用DNA 的可擴增性及熔點差值（Tm 值）對突變進行定性檢測，采用4 色熒光探針，根據(jù)靶序列和探針雜交體熔點變化檢出G-6-PD 突變位點。用于體外定性檢測人外周血基因組DNA中的中國人群常見的12 種G-6-PD 基因突變：c. 95A＞G、c. 383T＞C、c. 392G＞T、c. 487G＞A、c.517T＞C、c.592C＞T、c.871G＞A、c.1004C＞A、c.1024C＞T、c.1360C＞T、c.1376G＞T、c.1388G＞A。每份檢測樣本需要通過2 個PCR 體系完成，每個體系有4 種熒光探針。最后，對待測樣本與野生型對照對應(yīng)通道的熔解峰的Tm 值進行計算，判斷檢測樣本是否發(fā)生G-6-PD基因突變［8］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 G-6-PD酶活性檢測結(jié)果

215 例G-6-PD 篩查陽性病例行酶活性檢測，其中168 例酶活性異常，可生化診斷G-6-PD 缺乏；男性143例，女性25例，男女比為5.72∶1。WHO根據(jù)G-6-PD 酶活性變異的程度及臨床表現(xiàn)的有無及程度，將G-6-PD 缺乏癥分為5個等級［9］。其中Ⅱ級95例（酶活性值32 ～147 U/L），Ⅲ級73 例（酶活性值213～950 U/L）。

2.2 G-6-PD基因突變檢測結(jié)果

采用MMCA法可同時檢測12種常見G-6-PD缺乏癥突變基因型。168 例G-6-PD 酶活性異常病例中有145 例（男性124 例，女性21 例）同意接受基因檢測，129例確診G-6-PD 缺乏癥突變基因型的分布情況見表1。

表1 129例突變基因分布情況（例）

145 例中檢出10 種常見突變基因型，混合突變僅1例。其中男性半合子112例，女性雜合子16例，女性純合子僅1 例，男女比為6.59∶1；另外16 例基因檢測陰性，其中7 例是Ⅱ級酶活性亞型（男性4 例，女性3 例），9 例是Ⅲ級酶活性亞型（男性8 例，女性1例）。

2.3 生化檢出率及基因檢出率比較

生化檢出率比較，男性81.25%（143/176）與女性64.10%（25/39）的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.495，P=0.019）；基因檢出率比較，男性90.32%（112/124）與女性80.95%（17/21）的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.793，P=0.373）；生化檢出率78.14%（168/215）與基因檢出率88.97%（129/145）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.030，P=0.008）。

3 討論

全世界已發(fā)現(xiàn)G-6-PD 缺乏癥有400 多個基因突變類型［10］。從全球范圍看，非洲大陸以c.202G＞A、c.376A＞G突變?yōu)橹?，位于地中海沿岸的國家和地區(qū)以c.563C＞T 突變?yōu)橹鳎?1］，而東南亞國家主要以c. 871G＞A、c. 1311C＞T 這兩種突變類型為主。東亞和南亞最常見的G-6-PD突變類型是c.1003G＞A，又名G-6-PDChatham 突變，主要分布于日本、菲律賓和印度等國家［12］，也有文獻報道此突變?yōu)閹讉€東亞及伊朗部分省市的第二常見突變［13］。該突變導(dǎo)致G-6-PD 蛋白僅有不到正常蛋白10%的活性。Nuchprayon 等［14］報道在緬甸南部發(fā)現(xiàn)1 例c.94C＞G變異，由于變異導(dǎo)致組氨酸變?yōu)樘於彼?，從而影響G-6-PD 蛋白活性。該突變患者酶檢測活性為0。中國人群已報道的突變類型有40余種，國內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的G-6-PD 基因致病性變異超過30 種，絕大部分為Ⅱ類或Ⅲ類，分布具有種族和區(qū)域特異性［15］。G-6-PD 缺乏癥是X 連鎖不完全顯性等位基因異常引起的，基因檢測是G-6-PD 缺乏癥確診的重要依據(jù)，尤其對于女性雜合子、臨床疑似病例和有家族史的患者。女性雜合子由于其X染色體可隨機失活，導(dǎo)致部分女性可發(fā)病。G-6-PD 致病基因位于Xq28，長約20 kb，包含13 個外顯子和12 個內(nèi)含子，共編碼515 個氨基酸的蛋白酶［16］，起始密碼子位于第2 外顯子，第1外顯子不參與翻譯。G-6-PD 缺乏癥基因突變以單個堿基置換的錯義突變?yōu)橹鳌?/p>

本組168 例酶活性異常病例中，其中男性檢出率為81.25%，女性檢出率為64.10%，表明采用速率法檢測酶活性可初步檢出80%左右本地區(qū)男性新生兒G-6-PD缺乏癥病例，適合在缺乏基因檢測條件的基層醫(yī)院推廣應(yīng)用。而女性病例生化檢出率比較低，提示女性病例更有必要采用基因檢測以明確診斷。從篩查陽性到基因確診，男女比例由4.51∶1（176/39）擴大到6.59∶1（112/17），反映出部分女性雜合子可能被漏診。本組病例基因檢出率88.97%明顯高于生化檢出率78.14%；但男性生化檢出率81.25%與女性基因檢出率80.95%相近；男女性常見突變基因檢出率分別為90.32% 和80.95%，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示酶活性異常病例的突變基因檢出率不存在性別差異。對比唐芳等［17］報道的酶活性異常病例中男女性常見突變基因檢出率分別為96.93%和90.52%，發(fā)現(xiàn)本組女性病例的突變基因檢出率與該報道有差距，可能提示本地區(qū)女性G-6-PD 缺乏癥突變基因型更具區(qū)域特點，需要進一步研究證實。

本組病例中檢測出10 種常見突變基因型和1 種混合突變。比較陳瑤等［18］報道的應(yīng)用Massarray（質(zhì)量陣列）基因芯片技術(shù)共檢出9種新生兒G-6-PD缺乏癥單純型單點突變和7種復(fù)合突變，前3順位突變基因型為：c. 1376G＞T、c. 1388G＞A 及c.95A＞G。除了第一順位都是最常見的c.1376G＞T外，其他順位及基因型都不一致，表明與地域差異有關(guān)。129 例基因確診病例中112 例為男性半合子，16 例為女性雜合子，1 例女性純合子，僅1 例女性純合子和3例男性半合子有明確家族成員患G-6-PD 缺乏癥病史，顯示G-6-PD 缺乏癥呈X 連鎖不完全顯性遺傳。之所以男性發(fā)病居多，因為男性只有1 條G-6-PD 拷貝，而女性有2 條G-6-PD 拷貝，僅依靠正常表型不能區(qū)分其為純合子或雜合子。當(dāng)為雜合子時，有一正?；蚩珊铣烧５腉-6-PD，其等位基因則合成變異的G-6-PD，這種雙向合成使紅細胞表現(xiàn)為兩種情況，一種正常，一種則缺乏G-6-PD 酶。這就使女性雜合子G-6-PD 缺乏癥難以診斷，因為正常紅細胞部分掩蓋了異常紅細胞，其酶活性變化范圍較大，常在正常范圍之內(nèi)，也可呈輕度至重度降低［19-20］。女性雜合子發(fā)病與否取決于其G-6-PD缺乏的細胞數(shù)量在細胞群中所占的比例，由于臨床上不同的表現(xiàn)程度，稱為不完全顯性［21］。

本組病例的酶活性亞型分布以Ⅱ級和Ⅲ級為主，沒有發(fā)現(xiàn)Ⅰ級、Ⅳ級和Ⅴ級亞型。與國內(nèi)報道［22］基本一致。另外，接受基因檢測的145 例酶活性異常病例中，除外129 例基因確診，還有7 例Ⅱ級亞型和9 例Ⅲ級亞型未檢出突變基因。由于MMCA 法僅檢測12 種常見基因變異位點［7］，易將其他突變位點漏診。中國已有35 種致病突變被證實［23］，尚缺乏大型流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)，Liu 等［24］對2013 至2017年多中心1 764 299 例新生兒篩查樣本進行基因檢測發(fā)現(xiàn)29 種基因變異，其中c.1388G＞A、c.1376G＞T 和c.95A＞G 仍然是我國南方地區(qū)最常見變異位點，且僅在華人中存在，世界其他民族未見報道。本組病例中最常見的3種突變類型與國內(nèi)報道的前3 種突變基因型及順位都不一致［18，24］，顯示本地區(qū)G-6-PD 缺乏癥突變基因型獨具地域特色的可能性，有必要通過基因測序分析以鑒定12 種基因型之外的其他常見突變位點和新的突變位點［7］。

隨著新生兒G-6-PD缺乏癥篩查在我國推廣，基因型與生化表型的關(guān)系受到關(guān)注［25］，目前有關(guān)G-6-PD 基因型與新生兒篩查干血斑G-6-PD 酶活性的關(guān)系尚不十分清楚。郭靜等［26］報道的G-6-PD 基因突變位點與G-6-PD活性無明顯相關(guān)性，臨床不能以該病患兒G-6-PD 基因突變位點推測其G-6-PD 活性。陳鄉(xiāng)等［27］報道的單中心研究顯示，攜帶相同G-6-PD致病變異同性別患兒的表型譜有較大差異，攜帶相同致病位點且酶活性一致的同性別患兒臨床表現(xiàn)亦有差異。

綜上所述，采用速率法檢測酶活性及MMCA法檢測突變基因，對G-6-PD缺乏癥的酶活性分型及基因型確診都有意義。下一階段將采用基因測序分析聯(lián)合多色熔解曲線分析法探討G-6-PD 缺乏癥基因變異位點與酶學(xué)表型的關(guān)聯(lián)性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突