嶺南草藥九節(jié)總黃酮提取和富集工藝研究

尹 麗 盧成淑 王華坤 李國(guó)利 許婷婷

(1 玉林師范學(xué)院，玉林，537000； 2 玉林師范學(xué)院地產(chǎn)藥用資源開(kāi)發(fā)與生物工程技術(shù)中心，玉林，537000)

九節(jié)(PsychotriaasiaticaL.)為九節(jié)屬(PsychotriaL.)傳統(tǒng)藥用植物，又名大丹葉、山大顏、山大刀等，枝、根、葉藥用[1]。據(jù)《中國(guó)植物志》記載九節(jié)屬植物全球有1 500種左右，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。我國(guó)九節(jié)屬植物有17種，其中4種具有藥用價(jià)值。九節(jié)具有清熱解毒、舒筋活絡(luò)、活血止痛、消腫拔毒、祛風(fēng)除濕之效，臨床常用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、白喉、痢疾、腸傷寒、瘡瘍腫毒、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、毒蛇咬傷等癥[2-6]，是國(guó)家非物質(zhì)文化遺產(chǎn)——廣東涼茶常用中藥之一，同時(shí)也是廣西臨床常用的中草藥，主產(chǎn)于廣西玉林市[7]，具有獨(dú)特的地域優(yōu)勢(shì)和開(kāi)發(fā)前景?，F(xiàn)代研究表明，九節(jié)主要化學(xué)成分為黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)和三萜類(lèi)等，具有抗菌和抗病毒活性、抗腫瘤作用，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的致幻、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等，表現(xiàn)出誘人的藥用前景[8]。本課題組在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)九節(jié)的黃酮提取組分對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎具有良好的療效，可有效改善SD大鼠的足趾腫脹度和血清尿酸水平。

在廣西，九節(jié)有著悠久的民間藥用基礎(chǔ)和廣闊的種植面積，而目前針對(duì)其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)方面的研究較少，對(duì)九節(jié)的開(kāi)發(fā)利用相對(duì)滯后，有關(guān)其提取富集工藝尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究以嶺南特色藥材九節(jié)為研究對(duì)象，采用響應(yīng)面法優(yōu)化總黃酮提取工藝，并進(jìn)一步通過(guò)大孔樹(shù)脂富集這一組分，為后續(xù)九節(jié)資源的合理利用和新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司，型號(hào)：HH-S4)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠，型號(hào)：RE-52AA)；循環(huán)水式多用真空泵(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：SHB-Ⅲ)；蜀牛抽濾瓶[四川蜀玻(集團(tuán))有限責(zé)任公司，型號(hào)：GG-17]；紫外分光光度計(jì)[島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司，型號(hào)：UV-2600]。

1.2 試藥 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-201811)；8種大孔吸附樹(shù)脂(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，型號(hào)：D101、AB8、DM301、DA201、H103、HPD100、HP20、H1020)；亞硝酸鈉(南京試劑公司，編號(hào)：C0131520223)；硝酸鋁(南京試劑公司，編號(hào)：C0150520223)；氫氧化鈉(南京試劑公司，編號(hào)：C0131510225)，水為去離子水。藥材于2019年7月采集于廣西玉林，經(jīng)玉林師范學(xué)院盧海嘯教授鑒定為茜草科植物九節(jié)(PsychotriaasiaticaL.)地上部分。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品2 mg，用70%乙醇溶液溶解定容至20 mL，得到質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精準(zhǔn)吸取2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10 mL容量瓶中，在各瓶中分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，適度振蕩搖勻后放置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，振蕩搖勻后放置6 min，最后加入1.0 mol/L的氫氧化鈉4.0 mL，用70%乙醇溶液定容至10 mL，振蕩搖勻，放置15 min，待顯色穩(wěn)定后，以第1管(即蘆丁加入量為0的樣品)作為空白組，放于紫外可見(jiàn)分光光度儀中，設(shè)置波長(zhǎng)為510 nm，測(cè)定吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度Y為縱坐標(biāo)，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到線性回歸方程[9]。線性回歸方程為Y=11.98X-0.001 2，R2=0.999 9，結(jié)果表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液在此范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 提取工藝優(yōu)化

2.2.1 浸膏得率及提取率測(cè)定 九節(jié)浸膏得率=M1/M2×100%；總黃酮得率=CV/1 000M2×100%；C為提取液中總黃酮濃度，mg/mL；V為提取液的體積，mL；M1為浸膏質(zhì)量，g；M2為九節(jié)樣品的質(zhì)量，g。

2.2.2 供試品溶液的配制 取干燥九節(jié)地上部分粉碎后精確稱取粗粉(過(guò)四號(hào)篩)10 g置于圓底燒瓶?jī)?nèi)，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在設(shè)定的條件下(乙醇濃度、提取溫度、料液比和提取時(shí)間)回流提取2次，過(guò)濾，合并2次濾液，濾液濃縮至浸膏狀。參考相關(guān)文獻(xiàn)[10]的實(shí)驗(yàn)方法，精確稱取九節(jié)浸膏5 mg，用70%乙醇定容至10 mL，得到0.5 mg/mL的總黃酮待測(cè)液。取總黃酮待測(cè)液1 mL按照2.1中方法自“在瓶中加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL”開(kāi)始操作，每個(gè)處理重復(fù)3次。

2.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以總黃酮得率為指標(biāo)，對(duì)乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行考察，為后面響應(yīng)面法優(yōu)化工藝確定各參數(shù)范圍。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，精密稱取粉碎后的藥渣10 g于100 mL圓底燒瓶中，在固定其余參數(shù)情況下，考察乙醇濃度：50%、60%、70%、80%、90%；提取溫度：50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃；料液比(質(zhì)量比體積)：1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25；提取時(shí)間：40 min、60 min、80 min、100 min和120 min時(shí)九節(jié)中總黃酮得率(n=3)。考察不同乙醇濃度對(duì)九節(jié)總黃酮提取率的影響時(shí)，精密稱取粉碎后的藥渣10 g于100 mL圓底燒瓶中，固定加熱回流提取溫度為60 ℃，料液比為1∶10，提取時(shí)間為60 min[11]；考察不同提取溫度的影響時(shí)，精密稱取粉碎后的藥渣10 g于100 mL圓底燒瓶中，以80%乙醇為提取溶劑，固定料液比為1∶10，提取時(shí)間為60 min；考察不同料液比對(duì)的影響時(shí)，精密稱取粉碎后的藥渣10 g于100 mL圓底燒瓶中，以80%乙醇為提取溶劑，固定提取時(shí)間為60 min，提取溫度為60 ℃；考察不同提取時(shí)間的影響時(shí)，精密稱取粉碎后的藥渣10 g于100 mL圓底燒瓶中，以80%乙醇為提取溶劑，固定料液比為1∶10，提取溫度為60 ℃[12]。

2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 以單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的結(jié)果為中心點(diǎn)，運(yùn)用Design Expert8.0.6軟件針對(duì)主要因素(乙醇濃度、提取溫度、液料比、提取時(shí)間)使用中值組合重新編碼，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，采用Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平

2.3 大孔樹(shù)脂富集

2.3.1 樹(shù)脂篩選 精密稱取1.0 g粗提物總黃酮浸膏至燒杯中，加入少量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠖ㄈ葜?00 mL。加入等體積無(wú)水乙醇，渦旋混勻，10 000 r/min，離心半徑10 cm，離心30 min，取上清液旋至無(wú)醇味，加水溶解并通過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾，即為上樣液。參照文獻(xiàn)[13]的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理。分別稱取按說(shuō)明書(shū)預(yù)處理后的8種大孔樹(shù)脂各3 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL上樣液，于恒溫?fù)u床(25 ℃，180 r/min)振蕩吸附24 h，使其至吸附平衡，過(guò)濾后吸取一定體積的濾液，依法測(cè)定吸附后溶液九節(jié)總黃酮的含量。將上述吸附平衡后的8種大孔吸附樹(shù)脂用少量的純化水洗去表面的雜質(zhì)與溶液，抽濾至干，分別置于250 mL的具塞錐形瓶中，各加入100 mL無(wú)水乙醇，于恒溫?fù)u床(25 ℃，180 r/min)振蕩解析24 h，使其至解吸附平衡，過(guò)濾后吸取一定體積的濾液依法測(cè)定解吸附后溶液的九節(jié)總黃酮含量。最后按照下列公式計(jì)算：靜態(tài)飽和吸附量=(C0-C1)V1/M(mg/g)；吸附率=(C0-C1)/C0×100%；解吸率=(C2V2)/(C0V1-C1V1)×100%；回收率=C2V2/C0V1×100%。C0為吸附前樣品溶液中總黃酮的初始濃度，mg/mL；C1為吸附平衡后溶液中總黃酮濃度，mg/mL；C2為解吸平衡后解析液中總黃酮濃度，mg/mL；V1為吸附液體積，mL；V2為解析液體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g。

2.3.2 最佳提取工藝條件的驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，回歸模型預(yù)測(cè)的定向生成總黃酮最高提取率條件：58.94 ℃的提取溫度，75%的乙醇濃度和10.42∶1的料液比，48.3 min/次，提取2次，在此條件下九節(jié)總黃酮的提取率為2.37%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，對(duì)參數(shù)進(jìn)行修正：提取溫度59 ℃、乙醇濃度75%、料液比1∶10、提取時(shí)間48 min，在該參數(shù)下進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.3.3 最佳洗脫劑體積分?jǐn)?shù)摸索 取預(yù)處理好的大孔樹(shù)脂10 g，分別濕法裝柱(2 cm×30 cm)進(jìn)行吸附，收集過(guò)柱液，吸附后蒸餾水洗至無(wú)色，再分別用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液洗脫(10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%)，流速為3.0 mL/min，洗脫體積為6個(gè)柱床體積(BV)，收集洗脫液，測(cè)定其總黃酮含量，計(jì)算解吸率，篩選最佳洗脫劑體積分?jǐn)?shù)。

2.3.4 總黃酮的富集 稱取預(yù)處理好的大孔樹(shù)脂10、20和50 g，濕法裝柱，上樣吸附至飽和，蒸餾水洗至無(wú)色，再按上述最佳洗脫條件進(jìn)行洗脫，收集洗脫液測(cè)定總黃酮含量，并計(jì)算純度和回收率，驗(yàn)證工藝效果和穩(wěn)定性。純度=C2V2/M×100%；回收率=(C2V2-C1V1)/C1V1×100%。C1為富集前黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為富集前溶液體積，mL；C2為富集后總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V2為富集后定容體積，mL；M為富集后樣品質(zhì)量，g。富集工藝放大實(shí)驗(yàn)選取HP-20大孔樹(shù)脂，濕法裝柱，蒸餾水洗至無(wú)色，再以60%乙醇溶液洗脫，流速3.0 mL/min，洗脫體積6 BV。

3 結(jié)果

3.1 四因素考察結(jié)果

3.1.1 不同乙醇濃度對(duì)九節(jié)總黃酮提取率的影響 當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，九節(jié)總黃酮的提取率達(dá)到最大。乙醇濃度從50%增加到70%時(shí)，總黃酮提取率的變化不大，當(dāng)乙醇濃度從70%增大到80%的時(shí)候，九節(jié)總黃酮提取率迅速上升，之后增大乙醇濃度，總黃酮提取率逐漸減小?？梢源_定乙醇濃度為80%時(shí)提取率最高。本研究在響應(yīng)曲面提取乙醇濃度的3個(gè)水平選擇70%、80%、90%。見(jiàn)圖1。

圖1 不同乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響(%)

3.1.2 不同提取溫度對(duì)九節(jié)總黃酮提取率的影響 隨著提取溫度的升高，九節(jié)總黃酮的提取率也逐漸上升，在提取溫度為60 ℃時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最高，之后再提高溫度，總黃酮提取率反而逐漸下降。提取溫度為60 ℃時(shí)提取率最高，本研究在響應(yīng)曲面提取溫度的3個(gè)水平選擇50 ℃、60 ℃、70 ℃。見(jiàn)圖2。

圖2 不同提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

3.1.3 不同料液比對(duì)九節(jié)總黃酮提取率的影響 當(dāng)料液比從1∶5增加到1∶10時(shí)，料液比與總黃酮提取率正相關(guān)；當(dāng)料液比到1∶10的時(shí)候，總黃酮提取率達(dá)最大值，之后提取率隨著料液比的增大而減小；當(dāng)料液比增加至1∶15之后總黃酮提取率又有所上升，并在料液比為1∶20時(shí)達(dá)第2個(gè)頂點(diǎn)，隨后增大料液比，總黃酮提取率逐漸減小。料液比1∶10時(shí)提取率最高，本研究在響應(yīng)曲面料液比的3個(gè)水平選擇1∶5、1∶10、1∶15。見(jiàn)圖3。

圖3 不同料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

3.1.4 不同提取時(shí)間對(duì)九節(jié)總黃酮提取率的影響 隨著加熱回流提取的時(shí)間增加，九節(jié)中總黃酮的提取率逐漸上升，在60 min后，繼續(xù)回流提取，總黃酮提取率逐漸下降。在80 min后總黃酮提取率又有所上升，并在100 min時(shí)達(dá)到第2個(gè)頂點(diǎn)，之后繼續(xù)加熱回流提取，總黃酮提取率逐漸下降。提取時(shí)間為60 min時(shí)提取率最高，本研究在響應(yīng)曲面提取時(shí)間的3個(gè)水平選擇40 min、60 min、80 min。見(jiàn)圖4。

圖4 不同提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

3.2 九節(jié)總黃酮提取工藝優(yōu)化

3.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 共計(jì)29組實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 總黃酮提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合得到的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=2.30+0.034A-0.068B-0.024C-0.087D-0.018AB+0.032AC+0.18AD+7.500E-003BC+0.11BD-0.097CD-9.500E-003A2-0.33B2-0.11C2-0.19D2。

回歸模型的顯著水平為極其顯著(P<0.000 1)；失擬項(xiàng)P=0.260 1，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。乙醇濃度、提取溫度、液料比、提取時(shí)間對(duì)九節(jié)總黃酮提取率的影響顯著性由大到小為：提取時(shí)間(D)>提取溫度(B)>乙醇(濃度(A)>料液比(C)。見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

通過(guò)表3中的分析可以知道，乙醇濃度(A)和提取時(shí)間(D)交互作用對(duì)九節(jié)總黃酮提取率影響達(dá)到極顯著水平，提取溫度(B)和提取時(shí)間(D)交互作用對(duì)九節(jié)總黃酮提取率影響達(dá)非常顯著水平，料液比(C)和提取時(shí)間(D)交互作用對(duì)九節(jié)總黃酮提取率影響達(dá)到顯著水平，而AB、AC及BC交互作用對(duì)九節(jié)總黃酮提取率的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。在本實(shí)驗(yàn)中，CV值是3.64%，表明本回歸模型置信度較高，回歸模型的方程能很好地反映出真實(shí)實(shí)驗(yàn)的值，可以用該回歸模型分析響應(yīng)值的變化趨勢(shì)。本回歸模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.942 8，校正決定系數(shù)RAdj2=0.885 6，兩系數(shù)比較相近，表明模型的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值能很好地?cái)M合；本回歸模型的擬合情況比較好，回歸方程有很好的代表性，能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)真實(shí)的情況，表明運(yùn)用響應(yīng)面優(yōu)化法得到的提取條件對(duì)九節(jié)總黃酮進(jìn)行提取是可行的。

3.2.2 響應(yīng)面直觀分析 隨著乙醇濃度、提取時(shí)間和料液比的增大或延長(zhǎng)，九節(jié)總黃酮的提取量也隨之增大，但當(dāng)乙醇濃度、提取時(shí)間和料液比增大或延長(zhǎng)到一定程度后，黃酮提取量有下降的趨勢(shì)。乙醇濃度和提取時(shí)間的交互作用對(duì)模型影響顯著，提取溫度和提取時(shí)間的交互作用對(duì)模型影響顯著，從等高線圖中可見(jiàn)其橢圓程度和疏密程度，與模型回歸中的方差分析一致。見(jiàn)圖5。

圖5 兩因素交互影響總黃酮提取率的等高線

響應(yīng)面的開(kāi)口朝向下，隨著每個(gè)實(shí)驗(yàn)因素的不斷增大，響應(yīng)值也逐漸增大，當(dāng)響應(yīng)值達(dá)到最大值即該模型的穩(wěn)定點(diǎn)后，隨著實(shí)驗(yàn)因素的增大，響應(yīng)值反而逐漸減小。響應(yīng)曲面的坡度越陡峭，表示響應(yīng)值對(duì)實(shí)驗(yàn)因素的改變?cè)矫舾?；反之，曲面越平緩，則表示響應(yīng)值對(duì)實(shí)驗(yàn)因素的改變?cè)竭t鈍。本實(shí)驗(yàn)中兩實(shí)驗(yàn)因素交互作用下，九節(jié)總黃酮提取率對(duì)其的敏感度為ad>bd>cd。見(jiàn)圖6I、6K、6L。對(duì)ab、ac和bc的交互作用反應(yīng)較遲鈍。見(jiàn)圖6G、6H、6J。該結(jié)果與表3分析結(jié)果一致。

圖6 兩因素交互影響總黃酮提取率的響應(yīng)面

3.3 最佳提取工藝條件的驗(yàn)證試驗(yàn) 得到總黃酮提取率的平均值2.36%，與理論值2.37%相差不大建立的模型預(yù)測(cè)性良好，優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。見(jiàn)表4。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4 大孔吸附樹(shù)脂的篩選 對(duì)8種樹(shù)脂進(jìn)行靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)。在吸附率上，HP-20、AB-8和D101排名前3，其中HP-20型樹(shù)脂的吸附率最高，對(duì)總黃酮表現(xiàn)很好的吸附效果；而在洗脫過(guò)程中，上述3種樹(shù)脂對(duì)總黃酮均表現(xiàn)出很好的解吸附效果?；厥章史矫?，D101和HP-20型樹(shù)脂的回收率較高，分別為85.58%和85.16%，綜合考慮選用HP-20大孔樹(shù)脂富集純化九節(jié)中的總黃酮。見(jiàn)表5。

表5 8種大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附、解吸、回收率

3.5 大孔樹(shù)脂富集結(jié)果

3.5.1 洗脫劑濃度 隨著洗脫液濃度的逐漸上升，解吸率顯著提高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，解吸率達(dá)到最高，繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，解吸率趨于平衡。由于九節(jié)總黃酮中的糖苷鍵類(lèi)化合物和部分多酚類(lèi)物質(zhì)在溶液中極性較低，容易被乙醇洗脫出來(lái)，故洗脫液濃度過(guò)低致使洗脫不完全，而洗脫液濃度過(guò)高可能將一些雜質(zhì)合并洗脫出來(lái)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇洗脫液的最佳體積分?jǐn)?shù)為60%。見(jiàn)圖7。

圖7 洗脫劑濃度對(duì)解吸率的影響(%)

3.5.2 富集工藝放大驗(yàn)證 結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)不同樹(shù)脂量的大孔樹(shù)脂柱富集后，總黃酮純度達(dá)到10.64%，相對(duì)于提取液(總黃酮純度1.87%)提高了約6倍，回收率達(dá)到了87.70%，HP-20富集結(jié)果穩(wěn)定可行。見(jiàn)表6。

表6 富集工藝實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 討論

目前少有文獻(xiàn)報(bào)道九節(jié)總黃酮的提取和富集工藝，李洪福等[14]以正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化海南九節(jié)(P.haninanensis)中總黃酮提取率為0.65%，但僅考察了提取工藝，且正交實(shí)驗(yàn)法未能從整個(gè)區(qū)域中計(jì)算出單因素和指標(biāo)間確定的函數(shù)表達(dá)式，并探討單因素之間的交互作用。本實(shí)驗(yàn)首次采用響應(yīng)面法對(duì)九節(jié)的總黃酮提取工藝進(jìn)行研究，在單因素實(shí)驗(yàn)中最初隨著乙醇濃度增加，九節(jié)總黃酮提取率迅速上升，濃度繼續(xù)增大總黃酮提取率反而逐漸減小。其主要原因可能為隨著乙醇濃度和極性的改變，提取液中的一些如葉綠素等脂溶性的物質(zhì)溶出，隨著乙醇濃度的增大而不斷增加，從而影響了總黃酮的溶出[15]。不同提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響與之類(lèi)似，60 ℃時(shí)提取率達(dá)到最高，之后再提高溫度總黃酮提取率反而逐漸下降。出現(xiàn)該種情況的原因可能是開(kāi)始時(shí)溫度升高，總黃酮溶出增加導(dǎo)致提取率上升，但上升到一定溫度之后，黃酮化合物的性質(zhì)發(fā)生了改變，過(guò)高的溫度也可能使溶劑加速揮發(fā)，從而影響九節(jié)總黃酮的提取率。同理，增大料液比總黃酮提取率逐漸減小。呈現(xiàn)出這種趨勢(shì)的原因可能是在一定的料液比范圍內(nèi)，九節(jié)中黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出隨著料液比的增大而增大，當(dāng)料液比到達(dá)一定比例的時(shí)候，九節(jié)中黃酮類(lèi)化合物已經(jīng)基本完全溶出，故提取率有所下降，之后再提高料液比，不會(huì)促進(jìn)黃酮類(lèi)化合物的溶出，反而會(huì)增加雜質(zhì)的溶出，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果受影響而呈現(xiàn)出該趨勢(shì)[16]。在提取時(shí)間對(duì)九節(jié)總黃酮提取率影響實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)同樣的趨勢(shì)，持續(xù)加熱回流提取，總黃酮提取率逐漸下降。主要原因可能為隨著提取時(shí)間增加，九節(jié)總黃酮化合物溶出增加，提取率上升，到達(dá)一定時(shí)間后，黃酮化合物的溶出趨于穩(wěn)定，之后繼續(xù)回流提取，其他溶于乙醇的雜質(zhì)增加，對(duì)總黃酮提取率產(chǎn)生影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)九節(jié)總黃酮提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳提取工藝條件為：提取溫度59 ℃，乙醇濃度75%，料液比1∶10，提取時(shí)間48 min，提取2次，在此條件下總黃酮得率為2.36%，結(jié)果優(yōu)于上述文獻(xiàn)。

由于大多數(shù)黃酮類(lèi)的化合物分子極性不太大，根據(jù)“相似相吸引”原則，在非極性與弱極性樹(shù)脂上有較好的吸附效果。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[17-19]比較8種不同型號(hào)大孔樹(shù)脂對(duì)九節(jié)總黃酮的吸附量、靜態(tài)吸附、解析性能和回收率等指標(biāo)，確定HP-20大孔樹(shù)脂作為富集樹(shù)脂，在洗脫劑為60%乙醇、洗脫流速為3 mL/min、洗脫劑用量6 BV的條件下，富集后總黃酮回收率達(dá)到87.70%，純度相比浸膏提升6倍。該工藝對(duì)九節(jié)中最具價(jià)值的黃酮類(lèi)有效組分的提取富集，操作簡(jiǎn)單且穩(wěn)定性好，有助于保持九節(jié)黃酮類(lèi)物質(zhì)的生物活性，避免過(guò)高的經(jīng)濟(jì)與環(huán)境成本，適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)于九節(jié)這一地方特色藥材資源的資源利用提供了有效途徑。