茉莉酸甲酯對(duì)黃連生物堿含量積累的影響

劉 微 劉義飛 陳士林 劉 迪

(1 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,武漢,430065； 2 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所,北京,100700)

藥用黃連為毛茛科毛茛屬植物黃連CoptischinensisFranch.、三角葉黃連C.deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao或云連C.teetaWall.的干燥根莖，三者分別習(xí)稱“川連或味連”“云連”“雅連”[1]。黃連以根莖入藥，性寒，味極苦，可清熱燥濕，瀉火解毒，常用于治療泄瀉、痢疾、消渴、癰瘡腫毒等?！侗静菥V目》中記載“其根連珠而色黃，故名”[2]。目前從黃連中分離出來(lái)的成分已超過(guò)100種，可分為生物堿類與非生物堿類?，F(xiàn)代研究表明，黃連體內(nèi)的主要活性物質(zhì)為芐基異喹啉類生物堿[3]。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定黃連的指標(biāo)性成分為黃連堿、小檗堿、表小檗堿、巴馬汀[1]。豐富的化學(xué)成分也賦予了黃連多種藥理作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃連具有保護(hù)心腦血管、降糖、抗炎、抗腫瘤等顯著藥理作用，近年來(lái)，黃連在治療心腦血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)疾病的作用日益得到關(guān)注[3]。湖北恩施作為黃連的道地產(chǎn)區(qū)之一，所產(chǎn)黃連形如雞爪，根莖集聚成簇，黃肥堅(jiān)實(shí)，品質(zhì)極佳，素有“黃連之鄉(xiāng)”的美譽(yù)[4-5]。

黃連生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，有效成分一般在4年及以上生長(zhǎng)的植株中顯著積累[6]，產(chǎn)量低；同時(shí)遭受盲目開采，大部分野生黃連處于瀕?；驖u危狀態(tài)；且黃連喜陰濕忌干燥，多生長(zhǎng)在高海拔地區(qū)，適合種植黃連的地區(qū)比較少。顯著的臨床療效、嚴(yán)苛的生長(zhǎng)環(huán)境以及當(dāng)今社會(huì)對(duì)中成藥的開發(fā)，使對(duì)黃連的資源需求以及質(zhì)量的要求越來(lái)越高，因此提高栽培黃連的質(zhì)量對(duì)于解決黃連需求問(wèn)題十分必要。

茉莉酸類植物激素屬于脂肪酸類化合物，主要包括茉莉酸(Jasmonic Acid，JA)及其衍生物茉莉酸甲酯。作為一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，茉莉酸類植物激素參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)過(guò)程，包括花粉發(fā)育、根生長(zhǎng)、花青素積累、果實(shí)發(fā)育等[7]。茉莉酸類植物激素也是一種誘導(dǎo)子，可通過(guò)調(diào)節(jié)植物次生代謝產(chǎn)物生物合成過(guò)程的某些蛋白酶活性或者影響其轉(zhuǎn)錄水平從而引起植物次生代謝途徑或者代謝強(qiáng)度發(fā)生變化[8]，目前關(guān)于茉莉酸甲酯對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物積累的影響以及對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物生物合成過(guò)程的調(diào)控機(jī)制的報(bào)道有很多。

本研究利用茉莉酸甲酯能夠誘導(dǎo)植物體啟動(dòng)內(nèi)在防御機(jī)制的特性，對(duì)黃連幼苗噴施100 μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，刺激其體內(nèi)生物堿的迅速積累，進(jìn)而采用高效液相色譜技術(shù)對(duì)觀察組以及對(duì)照組樣品的黃連堿、鹽酸小檗堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀、藥根堿含量進(jìn)行測(cè)定與分析，旨在研究外源茉莉酸甲酯處理對(duì)黃連中生物堿積累的影響，并為進(jìn)一步研究茉莉酸甲酯對(duì)黃連生物堿生物合成途徑的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 本實(shí)驗(yàn)所用黃連植株來(lái)源于湖北恩施利川箭竹溪黃連專業(yè)合作社的一年生的黃連C.chinensis幼苗，將黃連幼苗種植于植物培養(yǎng)室中，光照周期16 h/8 h(暗/光)，光照強(qiáng)度2 000 lx、溫度20 ℃、濕度60%～80%。甲醇(貨號(hào)：FT1.0101U.4000)、乙腈(貨號(hào)：FT1.01003.4000)為高效液相色譜級(jí)，購(gòu)于湖北弗頓科學(xué)技術(shù)有限公司；茉莉酸甲酯溶液(上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：S30685-5)；水為超純水；無(wú)水乙醇(批號(hào)：20220107)、鹽酸、碳酸氫銨(批號(hào)：20200716)、三乙胺(批號(hào)：20200920)、氨水(批號(hào)：20211115)為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；黃連標(biāo)準(zhǔn)品鹽酸小檗堿(貨號(hào)：B21449)、鹽酸藥根堿(貨號(hào)：B21451)、鹽酸巴馬汀(貨號(hào)：B21433)、表小檗堿(貨號(hào)：B20108)、鹽酸黃連堿(貨號(hào)：B21438)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，純度高達(dá)98%以上。

1.2 儀器 高效液相色譜儀(日本島津制作所，日本，型號(hào)：LC-10ATVP)、色譜柱(月旭科技上海股份有限公司，型號(hào)：Ultimate? XB-C18)、電子天平(萬(wàn)分之一，上海菁海儀器有限公司，型號(hào)：FA1004N)、分析天平(十萬(wàn)分之一，賽多利斯公司，德國(guó)，型號(hào)：SECURA125-1CN)、超聲波清洗器(上海聲彥超聲波儀器有限公司，型號(hào)：SCQ-6201)、純水儀(四川優(yōu)普超純科技有限公司，型號(hào)：UPH-20)、循環(huán)水式多用真空泵(上海力辰邦西儀器科技有限公司，型號(hào)：SHZ-D(III)ABS)、全自動(dòng)樣品快速研磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，型號(hào)：JXFSTPRP-64)。

1.3 方法

1.3.1 茉莉酸甲酯處理 100 μmol/L茉莉酸甲酯的配置：用移液槍移取22.92 μL茉莉酸甲酯溶液和2.5 mL的無(wú)水乙醇溶液于容量瓶中，加純水定容到1 L。對(duì)照溶液即為0.25%的乙醇溶液。

觀察組與對(duì)照組處理：將生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的黃連幼苗分成2組，一組為觀察組，噴施100 μmol/L茉莉酸甲酯，一組為對(duì)照組，噴施0.25%的乙醇溶液。處理實(shí)驗(yàn)于上午8:30開始。將配置好的觀察組、對(duì)照組溶液裝在噴壺中，均勻噴施于黃連幼苗葉片上至掛滴，分別于噴施溶液后的0 h、24 h、48 h、72 h、96 h取樣，每個(gè)樣品取6株黃連幼苗混樣，每個(gè)樣品取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2 樣品制備 樣品處理：將黃連樣品用清水洗凈，裝于布紡袋中，置于硅膠中進(jìn)行干燥處理。將硅膠干燥后的樣品用快速研磨儀研磨成粉末。供試品制備：稱取樣品粉末0.1 g，精密稱定，記錄各個(gè)稱量的重量。將稱量的樣品粉末置于帶有塞子的錐形瓶中，配置甲醇-鹽酸(100∶1)溶液，精密量取25 mL甲醇-鹽酸(100∶1)溶液于裝有樣品的錐形瓶中，稱重，記錄此時(shí)裝有樣品溶液的錐形瓶重量。使用功率為250 W，頻率為40 kHz的超聲波清洗器超聲處理30 min，超聲結(jié)束后將樣品溶液置于常溫下放冷，再次稱重，用甲醇補(bǔ)足超聲過(guò)程揮發(fā)的甲醇，混合均勻后進(jìn)行過(guò)濾處理，取2 mL過(guò)濾液，用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，即得待測(cè)樣品溶液。對(duì)照品配置：精密稱取鹽酸小檗堿1.65 mg，表小檗堿1.66 mg，鹽酸黃連堿1.20 mg，鹽酸巴馬汀1.48 mg，鹽酸藥根堿1.36 mg，分別加1 mL甲醇溶液，0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，制成5種對(duì)照品溶液。將上述對(duì)照品溶液稀釋10倍后，分別量取100 μL 5種對(duì)照品溶液于2 mL定量瓶中，再加500 μL甲醇溶液制成混合標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.3 色譜條件 固定相采用Ultimate? XB-C18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相參考張琳等[9]的色譜條件，A相為30 mmol/L的碳酸氫銨溶液(含有0.1%三乙胺與0.7%氨水)，B相為乙腈，樣品總出峰時(shí)間為65.00 min。洗脫條件為梯度洗脫，程序設(shè)置為：0～15 min，15%～20%B；15～30 min，20%B；30～50 min，20%～35%B；50～55 min，35%～15%B，55～65 min，15%B。流速為1.00 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，進(jìn)樣量為20 μL，色譜柱溫度設(shè)置為30 ℃。

2 結(jié)果

2.1 精密度、線性范圍、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收結(jié)果

2.1.1 精密度考察 隨機(jī)取1份供試品溶液，編號(hào)為HL1，按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄5次供試品溶液色譜圖中的鹽酸藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的峰面積以及各自的保留時(shí)間，并計(jì)算平均峰面積以及平均保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(Relative Standard Deviation，RSD)值，鹽酸藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的平均峰面積的RSD值分別為2.6%，2.1%，2.8%，2.2%，2.5%，平均保留時(shí)間的RSD值分別為0.51%，0.32%，0.31%，0.21%，0.22%。表明本實(shí)驗(yàn)所用方法有較好的精密度。

2.1.2 線性范圍考察 分別量取上述實(shí)驗(yàn)方法中制備的黃連混合標(biāo)準(zhǔn)品0.5 mL、0.25 mL、0.125 mL、62.5 μL于2 mL定量瓶中，用鹽酸-甲醇(1∶100)定容至1 mL，加上原樣品溶液，得到系列濃度樣品溶液。分別精密吸取上述系列濃度溶液20 μL，按1.3.3色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，以各個(gè)生物堿的峰面積積分值(Y)與樣品濃度(X)建立線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到鹽酸藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的線性回歸方程與線性范圍。見(jiàn)表1。

表1 各對(duì)照品線性回歸方程

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取上述試驗(yàn)中選用的供試品溶液HL1，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，分別于0 h，6 h，12 h，18 h，24 h進(jìn)行鹽酸藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量測(cè)定，測(cè)得樣品中鹽酸藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的平均含量分別為0.082%、0.053%、0.340%、0.148%、1.315%，RSD值分別為2.4%、2.1%、2.2%、2.5%、1.9%，表明樣品在24 h內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取上述試驗(yàn)中選用的供試品HL1粉末4份，每份0.1 g，對(duì)4份供試品溶液中的鹽酸藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿進(jìn)行含量測(cè)定，測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽酸藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的RSD依次為2.4%、1.1%、1.3%、2.3%、2.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5 加樣回收試驗(yàn) 取上述試驗(yàn)中選用的供試品溶液HL1，加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)品，按照相應(yīng)的色譜條件測(cè)定樣品中鹽酸藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量，計(jì)算各個(gè)生物堿的加樣回收率，回收率分別為：103.92%、99.23%、100.01%、98.96%、100.21%。

2.2 黃連生物堿測(cè)定 按相應(yīng)色譜條件對(duì)制備的混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行含量測(cè)定，得到色譜圖，其中A峰為鹽酸藥根堿、B峰為表小檗堿、C峰為黃連堿、D峰為鹽酸巴馬汀、E峰為鹽酸小檗堿。見(jiàn)圖1。

圖1 黃連混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.3 茉莉酸甲酯處理對(duì)黃連生物堿積累的影響 與對(duì)照組比較，24 h茉莉酸甲酯處理后的黃連幼苗中的多種生物堿成分，包括表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量顯著升高，48 h茉莉酸甲酯處理后的黃連幼苗中的藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿顯著性升高，72 h和96 h茉莉酸甲酯處理后黃連幼苗中的各個(gè)生物堿的含量并沒(méi)有顯著性差異。

茉莉酸甲酯處理組藥根堿的含量變化總體趨勢(shì)為：0～48 h茉莉酸甲酯處理后黃連中藥根堿含量逐漸升高，至48 h達(dá)到最大值，為對(duì)照組的1.713倍；72～96 h茉莉酸甲酯處理后黃連中藥根堿含量比對(duì)照組高，但與48 h茉莉酸甲酯處理的黃連比較，其增長(zhǎng)率為下降趨勢(shì)。茉莉酸甲酯處理組表小檗堿的含量總體變化趨勢(shì)為：0～48 h茉莉酸甲酯處理后黃連中表小檗堿含量逐漸升高，至48 h達(dá)到最大值，為對(duì)照組的2.444倍；72 h處理后黃連中表小檗堿含量比對(duì)照組高，但與48 h茉莉酸甲酯處理的黃連比較，其增長(zhǎng)率為下降趨勢(shì)；96 h處理后黃連中表小檗堿含量與對(duì)照組比較呈下降趨勢(shì)。茉莉酸甲酯處理組黃連堿的含量變化總體趨勢(shì)為：0～48 h茉莉酸甲酯處理后黃連中黃連堿含量逐漸升高，至48 h達(dá)到最大值，為對(duì)照組的3.15倍；24 h茉莉酸甲酯處理后黃連中黃連堿含量與對(duì)照組相比雖有顯著性差異，但其增長(zhǎng)率沒(méi)有48 h茉莉酸甲酯處理黃連后黃連堿的增長(zhǎng)率高；72 h處理后黃連中黃連堿含量比對(duì)照組高，但與48 h茉莉酸甲酯處理的黃連相比較，其增長(zhǎng)率為下降趨勢(shì)；96 h茉莉酸甲酯處理的黃連中黃連堿含量與對(duì)照組幾乎一致；茉莉酸甲酯處理組鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量變化總體趨勢(shì)與藥根堿幾乎一致；48 h茉莉酸甲酯處理后黃連中鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量增長(zhǎng)最高，分別為對(duì)照組的2.274、1.797倍。見(jiàn)圖2。

圖2 茉莉酸甲酯處理黃連后藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量變化

3 討論

黃連為我國(guó)傳統(tǒng)大宗藥材，藥用歷史悠久。根據(jù)中醫(yī)藥理論，黃連性寒，味極苦，可用于清熱瀉火、燥濕除熱。黃連的主要藥效成分小檗堿一直是臨床藥效研究的熱點(diǎn)對(duì)象[10]，現(xiàn)代臨床藥理研究表明小檗堿有顯著的抗微生物作用，主要表現(xiàn)在抗菌、抗病毒方面，對(duì)多種病原微生物都有抑制作用，除此之外，黃連小檗堿還具有顯著的抗炎、抗心律失常、抗高血壓、抗血脂及降血糖作用。作為流傳千年的傳統(tǒng)中藥，有關(guān)黃連的經(jīng)典名方也有許多，如《傷寒論》中所記載的黃連阿膠湯，臨床研究表明其可治療心腎不交型失眠[11]；《傷寒論》所載“喘而汗出者，葛根黃芩黃連湯主之”，由此可見(jiàn)葛根黃芩黃連湯具有清熱止利的功效[12]；葛洪在《肘后備急方》記載的黃連解毒湯作為清熱劑，可瀉火解毒，治療三焦火毒證[13]。隨著中醫(yī)藥行業(yè)對(duì)黃連日益增長(zhǎng)的需求，提高黃連有效成分含量，培育優(yōu)質(zhì)高含量黃連迫在眉睫。

植物次生代謝產(chǎn)物及其生物合成過(guò)程容易受到如干旱、澇害、病蟲害、機(jī)械損傷以及各種外源性植物激素等外界環(huán)境因素的影響。茉莉酸甲酯作為植物體內(nèi)一類信號(hào)物質(zhì)，是一種非常有效的外源誘導(dǎo)子，可在植物面對(duì)環(huán)境刺激和產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物過(guò)程中發(fā)揮類似于激素的作用，因此茉莉酸甲酯可影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[14]。對(duì)植物施加外源性茉莉酸甲酯后，茉莉酸甲酯將進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)，在相關(guān)水解酶的催化作用下形成茉莉酸。茉莉酸作為植物細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中間物質(zhì)，可通過(guò)與植物氨基酸結(jié)合的方式形成茉莉酸-氨基酸聚合物。這種聚合物具有誘導(dǎo)效果，可在植物受到外界環(huán)境刺激時(shí)將植物防御系統(tǒng)信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)與放大，最終參與到植物的生長(zhǎng)發(fā)育、防御外界環(huán)境刺激過(guò)程中[15]。植物的開花結(jié)果過(guò)程中，在花粉粒授粉到柱頭前限制花粉萌發(fā)是被子植物能否成功受精的關(guān)鍵。Mei等[16]對(duì)MAP3Kε1和MAP3Kε2在擬南芥(Arabidopsisthaliana)花粉萌發(fā)過(guò)程中所起的調(diào)控作用進(jìn)行研究，最終發(fā)現(xiàn)MAP3Kε1和MAP3Kε2雙突變會(huì)導(dǎo)致擬南芥中胼胝質(zhì)異常積累，茉莉酸水平升高，花粉萌發(fā)早，導(dǎo)致結(jié)實(shí)率顯著降低。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)包括茉莉酸在內(nèi)的多種激素參與了土壤中磷極度缺失時(shí)甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)根系的生長(zhǎng)過(guò)程。

外源性茉莉酸甲酯也可直接參與植物細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，誘導(dǎo)植物次生代謝產(chǎn)物的合成與積累。有關(guān)茉莉酸甲酯提高農(nóng)產(chǎn)品代謝產(chǎn)物的研究有很多。Nakajima等[18]研究發(fā)現(xiàn)密封條件下用茉莉酸甲酯蒸汽處理可以增加早期葡萄(Vitisvinifera)表皮花青素積累，使得葡萄表皮紫色加深。Ortega-Hernández等[19]對(duì)羽衣甘藍(lán)(KaleSprouts)施加不同濃度的硒、硫、茉莉酸甲酯，觀測(cè)其對(duì)羽衣甘藍(lán)中次生代謝物含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯處理羽衣甘藍(lán)后，除山柰酚和槲皮素外，大部分酚類物質(zhì)的含量降低，25 μmol/L茉莉酸甲酯處理后，山柰酚和槲皮素的含量都提高了70%以上。Tang等[20]用200 μmol/L茉莉酸甲酯浸漬桃子(Prunuspersica)7 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯處理后對(duì)桃子果實(shí)的紅色形成有積極作用，會(huì)導(dǎo)致桃果實(shí)花青素積累(增加至120%)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯處理可增加與花青素生物合成相關(guān)的酶或者基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而促進(jìn)花青素的積累。施江等[21]對(duì)施加外源性茉莉酸甲酯對(duì)茶葉(Camelliasinensis)中類胡蘿卜類成分的影響進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯可以誘導(dǎo)茶樹鮮葉中多種脂溶性物質(zhì)的積累，這對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中培育提高茶葉品質(zhì)具有科學(xué)指導(dǎo)意義。有關(guān)茉莉酸甲酯對(duì)生物堿合成與積累的調(diào)控研究也有很多。

目前許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者已在通過(guò)施加外源性茉莉酸甲酯等激素改善中藥有效成分含量，提高中藥品質(zhì)方面有深入研究。如Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)向甘西鼠尾草(SalviaprzewalskiiMaxim)毛狀根中施加茉莉酸甲酯與水楊酸后，與對(duì)照組比較，茉莉酸甲酯處理后的丹參毛狀根中丹酚酸、丹參酮Ⅱa等含量顯著升高，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)觀察組丹參毛狀根中與次生代謝產(chǎn)物生物合成過(guò)程相關(guān)的基因和酶都顯著上調(diào)；Zhang等[23]采用間歇浸沒(méi)式生物反應(yīng)器體外培養(yǎng)金釵石斛幼苗，研究不同濃度茉莉酸甲酯以及不同處理時(shí)間對(duì)金釵石斛(DendrobiumnobileLindl)生物堿積累的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 μmol/L茉莉酸甲酯處理20 d和30 d的金釵石斛幼苗的生物堿的含量和產(chǎn)量最高。有關(guān)茉莉酸類植物激素對(duì)生物堿積累的影響及其對(duì)生物堿生物合成途徑的調(diào)控研究也有很多。Pu等[24]采用多組學(xué)方法分析茉莉酸甲酯等多種誘導(dǎo)子對(duì)喜樹(Camptothecaacuminata)中喜樹堿生物合成的調(diào)控作用，研究結(jié)果表明與對(duì)照組比較，茉莉酸甲酯處理組喜樹堿的含量提高了78.6%，并從茉莉酸甲酯處理過(guò)的喜樹幼苗中分離鑒定了15種新的生物堿成分；罌粟科植物罌粟的主要次生代謝產(chǎn)物為芐基異喹啉生物堿，與黃連主要成分相似，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)人紅罌粟(PapaverbracteatumLindl.)施加100 μmol/L和500 μmol/L茉莉酸甲酯可以顯著提高罌粟植株中芐基異喹啉生物堿的含量[25]。Kato等[26]通過(guò)瞬時(shí)RNAi篩選技術(shù)，首次在日本黃連(Coptisjaponica)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)Ⅱc類群的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，并命名為CjWRKY1，作為黃連小檗堿生物合成過(guò)程的轉(zhuǎn)錄激活因子，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CjWRKY1可通過(guò)在花菱草中的異源表達(dá)，調(diào)控花菱草芐基異喹啉生物堿的生物合成過(guò)程[27]，且CjWRKY1基因表現(xiàn)出顯著的茉莉酸甲酯響應(yīng)性，可通過(guò)施加茉莉酸甲酯誘導(dǎo)CjWRKY1的表達(dá)，從而提高與CjWRKY1相互作用的合成途徑關(guān)鍵基因和酶的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而增加芐基異喹啉生物堿的積累。Yamada等[28-29]通過(guò)瞬時(shí)RNAi篩選技術(shù)進(jìn)一步從日本黃連中篩選出了一個(gè)調(diào)控黃連生物堿生物合成的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(Basic Helix-loop-helix，bHLH)轉(zhuǎn)錄因子CjbHLH，隨后發(fā)現(xiàn)花菱草中CjbHLH同源蛋白EcbHLH1-1/1-2同樣參與其體內(nèi)生物堿的生物合成過(guò)程，而CjbHLH和EcbHLH1-1/1-2的表達(dá)皆由茉莉酸甲酯誘導(dǎo)。

本研究使用茉莉酸甲酯處理黃連幼苗，研究茉莉酸甲酯對(duì)黃連多種生物堿積累的影響。結(jié)果表明，100 μmol/L的茉莉酸甲酯處理黃連幼苗，48 h后黃連幼苗中的藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿積累量與增長(zhǎng)率最高，與對(duì)照組相比增長(zhǎng)倍數(shù)分別可以為1.713倍、2.444倍、3.15倍、2.274、1.797倍。茉莉酸甲酯處理后黃連幼苗中黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的積累趨勢(shì)相似，都是24 h處理積累量增加，48 h后增長(zhǎng)率最高，72 h、96 h處理后黃連幼苗中的黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿也是增加的，但其增長(zhǎng)率卻呈下降趨勢(shì)，甚至于與對(duì)照組比較，96 h茉莉酸甲酯處理后黃連堿的含量沒(méi)有增長(zhǎng)，推測(cè)提高處理時(shí)間，黃連堿的積累將會(huì)出現(xiàn)下降趨勢(shì)；茉莉酸甲酯處理后黃連幼苗中藥根堿于上述3種生物堿的積累趨勢(shì)相似，都是在48 h茉莉酸甲酯處理后增長(zhǎng)率最高，72 h、96 h處理后含量雖然是增加的，但其增長(zhǎng)率卻呈下降趨勢(shì)，不同點(diǎn)在于72 h、96 h茉莉酸甲酯處理后藥根堿的增長(zhǎng)率高于24 h的增長(zhǎng)率；莉酸甲酯處理后表小檗堿的積累模式與藥根堿一致，但在96 h處理后呈現(xiàn)出明顯的茉莉酸甲酯抑制作用?？偨Y(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間對(duì)黃連幼苗施加茉莉酸甲酯將會(huì)抑制黃連生物堿的積累，同樣的結(jié)果在其他植物的研究中也有發(fā)現(xiàn)，如胡正平等[30]用不同濃度的茉莉酸甲酯處理川續(xù)斷后，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L茉莉酸甲酯處理1～3 d能顯著提高川續(xù)斷中的主要成分川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量，而在處理的第5天，川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量低于對(duì)照組；金琳等[31]用不同濃度茉莉酸甲酯處理開花期的滇龍膽10 d后，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，茉莉酸甲酯可顯著降低苦龍膽酯苷的含量；路星星等[32]用不同濃度茉莉酸甲酯處理鉤藤后，發(fā)現(xiàn)100 μmol/L茉莉酸甲酯處理3 d可顯著提高鉤藤中葉綠素含量，但在處理6～9 d后則表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

綜上所述，通過(guò)短時(shí)間外源施加茉莉酸甲酯可以顯著促進(jìn)黃連幼苗體內(nèi)藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的積累，提高黃連中生物堿的含量，為深入研究黃連生物堿生物合成的分子調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)，也對(duì)黃連栽培種植和資源品質(zhì)利用實(shí)踐具有指導(dǎo)意義。