泡菜源屎腸球菌RS3的菌株生長特性及耐藥譜研究

劉瑋，曹威，劉浩，潘梅*

（1.桂林南藥股份有限公司，廣西 桂林 541004；2.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類在自然界中廣泛分布，可以利用多種糖類進行乳酸發(fā)酵的細菌的總稱，以其公認的安全性被廣泛地應用于食品工業(yè)、農牧業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)等領域[1-5]，然而由于其對生長環(huán)境的要求較高，如需在厭氧甚至絕氧的條件下生存、對高溫耐受能力較差等，給乳酸菌產品的應用與開發(fā)帶來很大挑戰(zhàn)，所以篩選品質性狀優(yōu)良、抗逆性強的菌種成為乳酸菌產品工業(yè)化的重要一環(huán)[6-7]。

屎腸球菌（Enterococcus faecium）是一種圓形或者橢圓形球菌，不具有芽孢，沒有鞭毛，常見為單生的乳酸菌，且屬于乳酸菌中抗逆性較強的一種，具有耐酸堿、耐高溫、耐高鹽、對氧氣存在與否無要求、腸道黏附能力好等生長特點[8-10]，同時還具有抑制病原菌[11]、增強免疫力[12]等作用，是動物腸道正常菌群之一，與其它腸道益生菌相互協(xié)作共同維持宿主的正常生理功能。

試驗前期從傳統(tǒng)發(fā)酵食品泡菜中分離篩選獲得了屎腸球菌RS3，為進一步了解該菌株生長特性，依據(jù)《中國藥典》（2015年版）的要求對菌株進行菌落及菌體細胞形態(tài)觀察、菌株脂肪酸指紋圖譜繪制、總酸及乳酸的測定，并且對其進行10種常見抗生素藥物的耐藥性分析，旨在為其進一步開發(fā)為益生菌劑提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品

天津科技大學微生物遺傳與代謝實驗室前期分離的屎腸球菌RS3，保存于桂林南藥股份有限公司。

1.1.2 試劑

牛肉膏（生化級）、尿素（分析純）、蔗糖（分析純）、淀粉（生化級）、糖蜜（生化級）、山梨醇（生化級）、L-阿拉伯糖（生化級）、甘露醇（生化級）、D-棉子糖（生化級）、絲氨酸（生化級）、精氨酸（生化級）、甘露糖（生化級）、果糖（生化級）、半乳糖（生化級）、麥芽糖（生化級）、海藻糖（生化級）、甘油（生化級）、明膠（生化級）、脫脂牛奶（生化級）：北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉（分析純）、乳糖（分析純）、葡萄糖（分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；吐溫-80（生化級）、溴甲酚紫（分析純）、檸檬酸鹽（分析純）、DL-蘋果酸鹽（分析純）、菊粉（生化級）：大連美倫生物技術有限公司；血瓊脂平板（成品培養(yǎng)基）：廣東環(huán)凱威生物科技有限公司。

1.2 儀器

雙人超凈工作臺（SW-CJ-1FD）：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術；pH計（S210）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-75KBS）：上海申安醫(yī)療器械；紫外分光光度計（UV-1800）：上海美譜達儀器有限公司；分析天平（BSA124S）：賽多利斯科學儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH4000B）：天津市泰斯特儀器有限公司；厭氧培養(yǎng)箱（YQX-T）：上海力辰邦西儀器科技有限公司；雙目生物顯微鏡（NIKON ECLIPSE 50i）、相機（D3200）：日本 Nikon 公司；電子掃描顯微鏡（TESCAN VEGA3）：泰思肯（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制

含糖牛肉湯培養(yǎng)基：1% 牛肉膏，0.5% 氯化鈉，2% 胰蛋白胨，2% 乳糖，加蒸餾水至1 000 mL，調節(jié)pH值至6.0，115℃滅菌20 min。1.5% 碳酸鈣含糖牛肉瓊脂培養(yǎng)基：按照含糖牛肉培養(yǎng)基的配方和制法，加入溴甲酚紫0.06g、碳酸鈣 15g、瓊脂 15g，加熱溶解，混勻，分裝，115℃濕熱滅菌20 min。脫脂牛奶培養(yǎng)基：稱取脫脂牛奶粉末30 g，加蒸餾水至200 mL，115℃滅菌20 min。

1.3.2 菌株形態(tài)特征及電鏡掃描觀察

1.3.2.1 菌落形態(tài)及革蘭氏染色

挑取碳酸鈣含糖牛肉湯固體平板上有透明圈的單菌落，接種于含糖牛肉湯液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)12 h。將菌液梯度稀釋至10-6，取稀釋后的菌液100 μL分別涂布于血瓊脂平板、不含碳酸鈣的含糖牛肉湯固體平板以及含有碳酸鈣的含糖牛肉湯固體平板上，分別置于有氧和無氧條件下培養(yǎng)，通過肉眼觀察菌落表征特征。同時對菌體進行革蘭氏染色觀察其菌體特征。

1.3.2.2 電鏡掃描觀察

取對數(shù)期菌液1 mL，8 000 r/min離心1 min，棄去上清并加入2.5% 戊二醛混勻，4℃固定過夜，8 000 r/min離心1 min，棄去上清液，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗 3 次，每次 10 min。加入 1% 鋨酸4℃固定2 h，PBS沖洗3次，每次10 min。利用30% 、50% 、70% 、90% 和100% 的乙醇梯度脫水，每次靜置10 min后8 000 r/min離心1 min，其中100% 乙醇脫水兩次，樣品置于臨界點條件下干燥，噴金觀察。

1.3.3 運動性鑒定

挑取碳酸鈣含糖牛肉湯固體平板上有透明圈的單菌落，接種于含糖牛肉湯液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)蘸取適量培養(yǎng)物點加到載玻片上的水滴中，以懸滴法進行觀察[13]。

1.3.4 菌株生理生化鑒定試驗

1.3.4.1 牛奶凝固力測定

挑取碳酸鈣含糖牛肉湯固體平板上有透明圈的單菌落，接種于含糖牛肉湯液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)12 h，吸取0.2 mL培養(yǎng)物轉接入含有20 mL脫脂牛奶培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，混合均勻并置于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，觀察牛奶凝固情況。

1.3.4.2 生化反應測定

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第八版）、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》以及《中國藥典》（2015年版）鑒定菌株RS3生理生化特性。

（1）特征性發(fā)酵不同碳源

取碳酸鈣含糖牛肉湯固體平板上有透明圈的菌落，接種于不同糖類或者是有機酸類物質的培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)基置于37℃下培養(yǎng)24 h～48 h，考察其發(fā)酵不同碳源情況。

（2）生物酶試驗

菌株觸酶（過氧化氫酶）試驗：挑取碳酸鈣含糖牛肉湯固體培養(yǎng)基上有透明圈的菌落，接種于含糖牛肉湯液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)12 h，離心收集菌體進行過氧化氫酶的檢測。

氧化酶試驗：取細胞色素氧化酶檢測濾紙細胞色素氧化酶檢測濾紙（cytoehrome oxidase test strip，ziqibio 05180）兩枚，用無菌水浸潤，挑取碳酸鈣含糖牛肉湯固體培養(yǎng)基上有透明圈的菌落，均勻涂至檢測濾紙上，于超凈臺內吹干，觀察濾紙顯色反應。

1.3.5 菌株發(fā)酵產總酸及乳酸的測定

1.3.5.1 總酸的測定

挑取含糖牛肉湯固體平板上的單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，吸取0.2 mL 24 h培養(yǎng)物接種于20 mL牛奶培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結束取培養(yǎng)物與脫脂牛奶培養(yǎng)基各5 mL，將培養(yǎng)物與培養(yǎng)基進行5倍稀釋并加入3滴酚酞指示液，用濃度為0.1 mol/L的氫氧化鈉滴定液分別滴定培養(yǎng)物與培養(yǎng)基至溶液為淡紅色，保持1 min不褪色，計算兩者消耗氫氧化鈉的毫升數(shù)差值ΔV（ΔV數(shù)據(jù)大于2 mL結果有意義），根據(jù)氫氧化鈉滴定液的消耗體積計算培養(yǎng)物中總酸含量。總酸計算公式如下。

式中：X為樣品中總酸的質量濃度（以乳酸計），g/L；C為氫氧化鈉標準滴定液的濃度，mol/L；90.08為乳酸的摩爾質量數(shù)值，g/mol；25為被測樣品的體積，mL；5為被測樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.5.2 乳酸的定性及定量測定

定性檢測乳酸（《中國藥典》（2015年版））：取試驗組與對照組培養(yǎng)物各1 mL，加入10% 硫酸溶液3滴～5滴，振蕩混勻后加入乙醚10 mL混勻，室溫放置10 min，取分層后的上層乙醚液于試管中，100℃水浴。向蒸去乙醚的殘渣中加蒸餾水2 mL，混合均勻后取出0.2 mL溶液，加入2 mL濃硫酸，于水浴中加熱2 min，取出后用冷水冷卻，滴加10% 愈創(chuàng)木酚乙醇溶液1滴，振搖觀察顯色情況。

定量檢測乳酸：準確移取培養(yǎng)物2 mL于EP管中，4 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL于20 mL容量瓶中定容，取1 mL稀釋后的樣品經0.22 μm濾膜過濾后進行高效液相色譜分析。色譜柱為AminexHPX-87H Column 300 mm×7.8 mm（Bio-Rad）。檢測條件為流動相0.005 mol/L H2SO4溶液，流速0.6 mL/min，柱溫65℃，檢測器波長210 nm，進樣量20 μL，檢測時間22 min。

1.3.6 菌株生長曲線繪制

挑取含糖牛肉湯固體平板上的單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)12 h，然后以1% （體積分數(shù)）的接種量接種于50 mL液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)12 h，再將其以2% （體積分數(shù)）的接種量平行地接種于3瓶盛有100 mL的含糖牛肉湯液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)，每隔1 h取樣1次，用紫外可見光分光光度計在600 nm波長下測定吸光度，繪制該菌體生長曲線。

1.3.7 脂肪酸組分測定

挑取含糖牛肉湯固體平板上的單菌落接種于10mL液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)12 h，然后以1% （體積分數(shù)）接種量轉接到600 mL液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)12 h，于4℃、8 000 r/min的條件下離心10 min，收集菌體，測定脂肪酸組分。

1.3.8 菌株對抗生素藥物敏感性試驗

參照WS/T 125—2018《抗菌藥物敏感性試驗的技術要求》，取新鮮的乳酶生菌液200 μL，均勻涂布于含糖牛肉湯固體平板上，然后將藥敏紙片置于固體培養(yǎng)基平板表面上，輕壓使紙片與培養(yǎng)基完全貼合，于37℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)12 h，考察菌株對抗生素藥物的敏感性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用Ecxel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進行記錄與初步處理分析，Origin 8軟件進行圖片繪制。

2 結果與分析

2.1 屎腸球菌RS3菌落及菌體特征

2.1.1 菌落形態(tài)分析

對分離得到的屎腸球菌RS3進行平板劃線獲得該菌單菌落，結果見圖1。

圖1 屎腸球菌RS3的分離純化Fig.1 Isolation and purification of E.faecium RS3

由圖1可知，呈現(xiàn)乳白色圓形菌落，質地均勻，不透明，邊緣整齊。

利用傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法，對分離純化到的菌株進行觀察。經過3種不同培養(yǎng)基（血瓊脂平板、含糖牛肉湯固體平板和碳酸鈣含糖牛肉湯固體平板）的培養(yǎng)，并分別在有氧和厭氧條件下培養(yǎng)，觀察其菌株形態(tài)，結果見圖2。

圖2 屎腸球菌RS3在不同培養(yǎng)基上有氧和厭氧培養(yǎng)的生長情況Fig.2 Aerobic and anaerobic growth of E.faecium RS3 on different media

RS3在血瓊脂培養(yǎng)基、含糖牛肉湯固體培養(yǎng)基以及碳酸鈣含糖牛肉湯固體培養(yǎng)基上生長時均表現(xiàn)為乳白色圓形菌落，菌落較大且光滑，具有光澤，直徑均在0.5 mm～1.5 mm范圍內。其中在血瓊脂培養(yǎng)基上生長時菌落周圍出現(xiàn)草綠色溶血圈，屬于甲型（ɑ）溶血，與杜志林等[14]和魏成威等[15]研究的雞源、狐源的屎腸球菌存在差異；在碳酸鈣含糖牛肉湯固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時菌落周圍出現(xiàn)透明圈，說明是菌落生長時產生酸與碳酸鈣反應進而生產透明圈，即RS3能夠在含糖牛肉湯固體培養(yǎng)基中發(fā)酵生產酸。

2.1.2 菌體細胞形態(tài)分析

通過革蘭氏染色及鏡檢對屎腸球菌RS3菌株進行個體形態(tài)分析，結果見圖3。

圖3 屎腸球菌RS3菌株革蘭氏染色及電鏡掃描情況Fig.3 Gram staining and electron microscopic scanning of E.faecium RS3

由圖3可知，屎腸球菌RS3為革蘭氏陽性菌株（圖3a），掃描電子顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌RS3菌體細胞呈橢圓，4個～5個細胞成團簇狀或短鏈狀分布（圖3b）。

2.1.3 菌體細胞運動性

屎腸球菌RS3菌體運動性試驗借助成像顯微鏡完成，可以觀察到菌體無明顯位移，只在原位置做布朗運動，結果見圖4。

圖4 細胞運動性觀察Fig.4 Observation of cell motility

2.2 生理生化試驗鑒定

根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》（第八版）、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》以及《中國藥典》（2015年版）對篩選菌株進行生理生化試驗，檢測其對不同碳源發(fā)酵產酸情況，增強鑒別專屬性以區(qū)分相似菌株，生理生化試驗結果見表1。

表1 屎腸球菌RS3菌株生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of E.faecium RS3

由表1可知，該菌株與《中國藥典》（2015年版）對屎腸球菌所規(guī)定的以山梨醇、L-阿拉伯糖、甘露醇及D-棉子糖為碳源時所呈現(xiàn)的結果一致——山梨醇、D-棉子糖反應呈陰性，L-阿拉伯糖、甘露醇反應呈陽性；另外根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》（第八版）和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，本試驗新增16種不同的糖類及有機酸類物質發(fā)酵，反應結果一致顯示分離菌株為屎腸球菌（E.faecium）[16-17]。

過氧化氫酶位于細胞的過氧化物酶體內，是過氧化物酶體的標志酶，大約占過氧化物酶體酶總量的40% ，催化過氧化氫分解成氧和水，可以使細胞免受過氧化氫的毒害作用[18]，測得屎腸球菌RS3菌體中過氧化氫酶的含量為（1 507.39±15.90）U/g。陽性菌涂布于細胞色素氧化酶檢測濾紙上會呈現(xiàn)深藍色，而陰性菌無變化。屎腸球菌RS3細胞色素氧化酶檢測結果見圖5。

圖5 屎腸球菌RS3細胞色素氧化酶檢測Fig.5 Cytochrome oxidase test of E.faecium RS3

由圖5可知，屎腸球菌RS3涂布在檢測濾紙上反應呈現(xiàn)為藍色，故其為陽性菌株。

2.3 總酸的測定

通過酸堿滴定法測定屎腸球菌RS3在脫脂牛奶培養(yǎng)基中發(fā)酵產酸的情況，氫氧化鈉滴定液消耗情況見表2。

表2 氫氧化鈉滴定液消耗情況Table 2 The consumption of sodium hydroxide

由表2可知，消耗氫氧化鈉滴定液的體積為3.33mL，滿足《中國藥典》（2015版）中規(guī)定的兩者消耗氫氧化鈉滴定液毫升數(shù)差值不得小于2 mL要求，數(shù)據(jù)具有參考意義，且計算出培養(yǎng)物中總酸含量為（6.01±0.10）g/L。

2.4 乳酸的測定

定性和定量檢測屎腸球菌RS3發(fā)酵液中乳酸結果見圖6。

圖6 定性和定量檢測屎腸球菌RS3發(fā)酵液中乳酸Fig.6 Qualitative and quantitive of lactic acid in E.faecium RS3 fermentation broth

乳酸為屎腸球菌在發(fā)酵過程中產生的主要次級代謝產物[19]，為了鑒別本研究中分離得到的屎腸球菌RS3在脫脂牛奶培養(yǎng)基中發(fā)酵是否積累乳酸，利用愈創(chuàng)木酚顯色法檢測乳酸發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液呈現(xiàn)典型的淡粉紅色，即菌株在脫脂牛奶培養(yǎng)基中生長時有乳酸積累，與《中國藥典》（2015年版）所規(guī)定的結果一致（圖6a）。通過高效液相色譜檢測分析發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液中有乳酸特征峰，其在脫脂牛奶培養(yǎng)基中生長48 h后乳酸濃度為 5.73 g/L（圖6b）。

2.5 菌株的生長曲線測定

菌株RS3進行靜置培養(yǎng)，每隔1h取樣1次，每次3個平行，將取得的樣品用紫外分光光度計在波長600 nm下測定菌體濃度，繪制該菌株生長曲線，結果見圖7。

圖7 屎腸球菌RS3生長曲線圖Fig.7 Growth curve of strain E.faecium RS3

由圖7可知，該菌株在含糖牛肉湯液體培養(yǎng)基中生長時，最初的0～2 h處于延遲期，菌株生長緩慢；2 h～8 h處于對數(shù)期，菌株快速生長；8 h～12 h處于穩(wěn)定期。

2.6 菌株脂肪酸組分測定

脂肪酸是菌體的基本結構成分之一，是構成生物膜的重要物質，細菌的細胞結構中普遍含有的脂肪酸成分與細菌的DNA具有高度的同源性，不同種屬的細菌在脂肪酸的組成和含量上存在不同程度的差異且比較穩(wěn)定，各種細菌具有其特征性的細胞脂肪酸指紋圖譜。本研究收集穩(wěn)定期屎腸球菌RS3菌體并測定其脂肪酸類型及含量，結果見表3。

表3 屎腸球菌RS3脂肪酸組分Table 3 Fatty acid composition of E.faecium RS3

由表3可知，屎腸球菌RS3脂肪酸檢測特征峰中主要有十四碳烷酸、十六碳烷酸、十六碳烯酸、十八碳烯酸和十八碳二烯酸，與甘永琦等[20]報道的腸球菌屬具有的脂肪酸特征峰相一致。

2.7 菌株對抗生素藥物的敏感性

將分離菌株進行頭孢噻吩、四環(huán)素、氨芐西林等10種典型抗生素藥物敏感性試驗，檢測結果如圖8。

圖8 藥敏紙片法測定屎腸球菌RS3對抗生素藥物的敏感性Fig.8 Sensitivities of E.faecium RS3 to various antibiotics by drug sensitive paper method

屎腸球菌RS3的抗生素敏感性見表4。

表4 屎腸球菌RS3的抗生素敏感性Table 4 Sensitivities of E.faecium RS3 to various antibiotics

如表4所示，屎腸球菌RS3對氨芐西林霉素敏感；對四環(huán)素、萬古霉素、紅霉素的敏感性為中介；對頭孢噻吩、青霉素、苯唑西林霉素具有耐藥性。

3 結論

為了明確新分離得到的屎腸球菌RS3的菌株生長特性，為其開發(fā)為益生菌劑提供數(shù)據(jù)支持，本文對泡菜源屎腸球菌RS3進行了全面系統(tǒng)的鑒定，得到以下結論：（1）屎腸球菌RS3為兼性厭氧菌、革蘭氏陽性菌，菌落為乳白色圓形、大而光滑、質地均勻、不透明、邊緣整齊，菌體細胞為橢圓形，成團簇狀或短鏈狀分布，菌體無明顯運動，只做布朗運動；（2）屎腸球菌RS3可特征性發(fā)酵L-阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖酸鹽、丙酮酸鹽、絲氨酸、蔗糖、甘露醇、果糖、半乳糖、麥芽糖、海藻糖、乳糖及菊粉，與山梨醇、D-棉子糖、檸檬酸鹽、蘋果酸鹽、精氨酸和甘油等無明顯反應，菌體中過氧化氫酶的含量為（1 507.39±15.90）U/g，與細胞色素氧化酶檢測濾紙反應呈陽性；（3）屎腸球菌RS3在脫脂牛奶培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵終點總酸含量為（6.01±0.10）g/L，其中乳酸含量為 5.73 g/L；（4）屎腸球菌RS3生長的遲緩期為0～2 h，對數(shù)期為2 h～8 h，穩(wěn)定期為8 h～12 h；（5） 屎腸球菌RS3代謝產物中的主要特征脂肪酸為十四碳烷酸、十六碳烷酸、十六碳烯酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸；（6）屎腸球菌RS3對氨芐西林霉素敏感，對四環(huán)素、萬古霉素、紅霉素的敏感性為中介，對頭孢噻吩、青霉素、苯唑西林霉素具有耐藥性。