出芽短梗霉產(chǎn)普魯蘭多糖除菌及脫蛋白工藝

成剛剛，魯亮，陳世偉，李振海，趙廷彬，殷海松，鄭志強，喬長晟*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.天津市工業(yè)微生物重點試驗室，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點試驗室，天津 300457；3.天津慧智百川生物技術有限公司，天津 300457；4.天津現(xiàn)代職業(yè)技術學院生物工程學院，天津 300457；5.軍事科學院系統(tǒng)工程研究院軍需工程技術研究所，北京 101300）

普魯蘭多糖是由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）發(fā)酵產(chǎn)生的類似葡聚糖的胞外水溶性黏質多糖[1-2]，其分子是由α-1，4-糖苷鍵連接3個葡萄糖形成麥芽三糖，并通過α-1，6-糖苷鍵連接麥芽三糖，形成高分子量線形多糖[3-4]。因其具有水溶性好、易降解、易成膜、阻氧、無毒等特點，已被普遍應用于食品、醫(yī)藥、輕化工和農業(yè)等多領域，是一種極具研究價值和應用前景的高新生物制品[5-6]。發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖時，發(fā)酵液黏度高使菌液分離困難，并且發(fā)酵過程中產(chǎn)生的蛋白質也對多糖純化造成一定的困難。因此，去除這些雜質是普魯蘭多糖純化過程中的重要步驟。

目前，普魯蘭多糖的菌液分離主要是通過無機絮凝劑絮凝除菌和板框過濾除菌，牛登飛[7]采用三氯化鋁絮凝除菌，用乙酸鋅和亞鐵氰化鉀進行澄清，用硅藻土進行過濾；萬玉軍等[8]使用硅藻土作為助濾劑，板框過濾除菌。傳統(tǒng)的除菌方式不僅會造成無機金屬離子殘留，助濾劑的使用還會產(chǎn)生固體廢渣，造成環(huán)境污染。常用脫蛋白的方法主要有三氟三氯乙烷法、物理吸附法、Sevag 法[9]、鹽析法[10]、三氯乙酸法[11]和蛋白酶法。馬麗等[12]采用三氟三氯乙烷法去除螺旋藻多糖中的蛋白質；賀曉晗等[13]采用硅鎂類物質吸附去除發(fā)酵液中的蛋白質；張璐等[14]采用木瓜蛋白酶法去除多糖發(fā)酵液中的蛋白質。傳統(tǒng)的化學除蛋白方式，從純化蛋白的角度講，有較好的效果，但對普魯蘭多糖發(fā)酵液中使用化學方法去除蛋白質的同時，不僅會造成有機試劑的殘留，而且多糖損失率較高。

本試驗首先從4種生物絮凝劑中選定除菌效果最好的絮凝劑，通過單因素試驗和響應面試驗優(yōu)化絮凝除菌工藝。然后從6種酶中選定脫蛋白效果最佳的蛋白酶，除菌后發(fā)酵液進行脫蛋白處理，通過單因素和響應面試驗優(yōu)化脫蛋白工藝。再經(jīng)傳統(tǒng)脫色、超濾、濃縮干燥成粉末，測定固體普魯蘭多糖粉末的理化指標。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

出芽短梗霉CGMCC.7055（Aureobasidium pullulans CGMCC.7055）、聚谷氨酸：天津北洋百川生物技術有限公司；羧甲基纖維素鈉、殼聚糖：北京索萊寶生物科技有限公司；海藻酸鈉、考馬斯亮藍G-250：天津市大茂化學試劑廠；中性蛋白酶（1.5×105U/mL）、復合蛋白酶（1.4×105U/mL）、堿性蛋白酶（8.6×104U/mL）、木瓜蛋白酶（5.0×103U/mL）、風味蛋白酶（4.0×103U/mL）：北京瀾翊康生物科技有限公司；酸性蛋白酶（50 U/mL）、牛血清蛋白：上海源葉生物有限公司；大孔樹脂LX-68M：西安藍曉科技有限公司。

1.2 儀器與設備

FE20型pH計：瑞士梅特勒-托利多集團；Tecan SunRise酶標儀：帝肯奧地利責任有限公司；B-260恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；UV-1200型紫外分光光度計：泰亞賽福公司；TDL-5-A型高速離心機：上海安亭科學儀器廠；SP-1500型噴霧干燥機：上海順儀試驗設備有限公司；SY-MU2050型切向流超濾系統(tǒng)：上海世遠生物設備工程有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 普魯蘭多糖發(fā)酵液制備

參照張攀等[15]的方法，略作修改，以出芽短梗霉進行發(fā)酵，發(fā)酵96 h，當普魯蘭多糖達到80 g/L時，待用。

1.3.2 多糖含量及得率的測定

參照宋亞瓊等[16]的方法，略作修改，取30 mL普魯蘭多糖溶液，用2倍體積的無水乙醇，攪拌靜置一段時間，將沉淀放在已恒重的濾紙上抽濾，放入80℃烘箱中干燥至恒重，稱量、記錄結果。根據(jù)式（1）計算出普魯蘭多糖的含量，按照（2）式計算出普魯蘭多糖的得率。

式中：M為普魯蘭多糖含量，g/L；m為普魯蘭多糖和濾紙總重量，g；m0為空白濾紙質量，g。

式中：W為粗多糖得率，% ；M0為處理后普魯蘭多糖的含量，g；M為處理前普魯蘭多糖的含量，g。

1.3.3 除菌率的測定

取未除菌發(fā)酵液1 mL稀釋25倍，搖勻，使用酶標儀在620 nm處測定其吸光度，記為A；經(jīng)過絮凝處理的發(fā)酵液，5 000 r/min離心10 min，取上清，稀釋25倍在620 nm處測定其吸光度，記為A0。吸光度和菌體含量成正比，以吸光度直接表示菌體含量。吸取200 μL待測液，于620 nm處測溶液的吸光度，除菌率（Y）按照式（3）計算。

1.3.4 蛋白質標準曲線的制作及脫蛋白率的測定

采用考馬斯亮藍法[17]測定普魯蘭多糖發(fā)酵液蛋白質含量，以牛血清白蛋白為標準品，經(jīng)波長掃描后在595 nm條件下測定吸光度，得回歸方程y=6.151 4x+0.011 1，R2=0.999（x為蛋白含量，mg/mL；y為吸光度），脫蛋白率按照式（4）計算。

式中：X為脫蛋白率，% ；x為處理前樣品中蛋白質含量，mg/mL；x0為處理后樣品中蛋白質含量，mg/mL。

1.3.5 固體普魯蘭多糖中指標的測定

水分、灰分、單糖、二糖及寡糖含量分別參考GB 5009.3—2010《食品安全國家標準食品中水分的測定》、GB 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》、GB 28402—2012《食品安全國家標準食品添加劑普魯蘭多糖》進行測定。

1.4 生物絮凝劑除菌試驗

1.4.1 生物絮凝劑的篩選

取100 mL發(fā)酵液各4份，考察羧甲基纖維素鈉、殼聚糖、海藻酸鈉、聚谷氨酸4種生物絮凝劑在添加量0.6 g/L，絮凝溫度40℃，絮凝時間30 min，不同pH值下的除菌率，確定最佳生物絮凝劑的類型。

1.4.2 單因素試驗

取100 mL發(fā)酵液各7份，在絮凝劑的添加量0.6g/L，絮凝溫度40℃，絮凝時間30 min的條件下，分別以pH 值 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 進行試驗，離心去除菌體，以除菌率和多糖得率為指標，確定最佳pH值。

按照上述試驗最優(yōu)pH值，取100 mL發(fā)酵液各6份，在絮凝劑的添加量0.6 g/L，絮凝時間30 min的條件下， 分別以絮凝溫度 20、30、40、50、60、70 ℃進行試驗，離心去除菌體，以除菌率和多糖得率為指標，確定最佳絮凝溫度。

按照上述試驗最優(yōu)pH值和絮凝溫度，取100 mL發(fā)酵液各6份，在絮凝劑的添加量0.6 g/L，分別以絮凝時間 10、20、30、40、50、60 min 進行試驗，離心去除菌體，以除菌率和多糖得率為指標，確定最佳絮凝時間。

按照上述試驗最優(yōu)pH值，絮凝溫度和絮凝時間的條件下，取100 mL發(fā)酵液各6份，分別以殼聚糖添加量 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L 進行試驗， 離心去除菌體，以除菌率和多糖得率為指標，確定最佳殼聚糖添加量。

1.4.3 生物絮凝除菌響應面優(yōu)化試驗

在單因素的基礎上應用Box-Behnken Design進行響應面優(yōu)化試驗設計（三因素三水平），因素與水平的具體參數(shù)見表1。

表1 生物絮凝除菌響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design of biopolymer flocculation in sterilization

1.5 酶法脫蛋白試驗

1.5.1 蛋白酶的篩選

以脫蛋白率和多糖得率為指標，取經(jīng)除菌的發(fā)酵液100 mL各6份，比較中性蛋白酶、復合蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶和酸性蛋白酶6種蛋白酶，在各自最適溫度，加酶量100 U/mL條件下的脫蛋白率，確定最佳蛋白酶的類型。

1.5.2 單因素試驗

取經(jīng)除菌的發(fā)酵液100 mL各7份，在加酶量100 U/mL，酶解溫度50℃，酶解2.0h的條件下，分別以pH 值 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0 進行試驗，90 ℃滅酶5 min，離心去除沉淀后，以脫蛋白率和多糖得率為指標，確定最佳pH值。

取經(jīng)除菌的發(fā)酵液100 mL各6份，按照上述試驗最優(yōu)pH值，在加酶量100 U/mL，酶解2.0 h的條件下，分別以酶解溫度 40、45、50、55、60、65 ℃進行試驗，90℃滅酶5 min，離心去除沉淀后，以脫蛋白率和多糖得率為指標，確定最佳酶解溫度。

取經(jīng)除菌的發(fā)酵液100 mL各7份，按照上述試驗最優(yōu)pH值和酶解溫度，在加酶量100 U/mL條件下，分別以酶解時間 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h 進行試驗，90℃滅酶5 min，離心去除沉淀后，以脫蛋白率和多糖得率為指標，確定最佳酶解時間。

取經(jīng)除菌的發(fā)酵液100 mL各6份，按照上述試驗最優(yōu)pH值，酶解溫度和酶解時間，分別以加酶量20、40、60、80、100、120 U/mL 進行試驗，90 ℃滅酶 5 min，離心去除沉淀后，以脫蛋白率和多糖得率為指標，確定最佳加酶量。

1.5.3 酶法脫蛋白響應面優(yōu)化試驗

在單因素的基礎上應用Box-Behnken Design進行響應面優(yōu)化試驗設計（四因素三水平），因素與水平的具體參數(shù)見表2。

表2 酶法脫蛋白響應面試驗因素及水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design of enzymatic deproteinization

1.6 樹脂脫色

取經(jīng)脫蛋白后的發(fā)酵液，按照5 BV/h進行大孔樹脂脫色試驗，當濾液為淡黃色或無色，收集濾液。

1.7 超濾、濃縮

取經(jīng)脫色后的發(fā)酵液進行超濾除鹽，經(jīng)截留分子量10 kDa超濾膜組件，水洗6次后，濃縮至5% ，收集濾液。

1.8 干燥

取經(jīng)超濾濃縮后的濾液，設置進風溫度為180℃，出風溫度為85℃，進料速度為25 mL/min，霧化驅動，壓力為0.4 MPa，噴霧干燥，得到固體普魯蘭多糖粉末。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.06軟件進行Box-Behnken試驗設計和響應面結果分析，用SPSS 25.0軟件進行顯著性分析，用Origin 2019b軟件進行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 生物絮凝劑的篩選

不同pH值下生物絮凝劑對普魯蘭多糖發(fā)酵液除菌效果的影響見圖1。

圖1 不同pH值下生物絮凝劑對除菌效果的影響Fig.1 Effect of biopolymer flocculation on sterilization under different pH values

由圖1可知，4種生物絮凝劑中，在相同條件下殼聚糖對普魯蘭多糖發(fā)酵液菌體的絮凝效果最好，pH值為3.0～4.0時除菌率可達97.6% 左右。故選殼聚糖進行普魯蘭多糖發(fā)酵液絮凝除菌試驗。

2.2 殼聚糖絮凝除菌單因素試驗結果

2.2.1 pH值對殼聚糖絮凝除菌率的影響

pH值對殼聚糖除菌率的影響見圖2。

圖2 pH值對殼聚糖除菌效果的影響Fig.2 Effect of pH value on sterilization of chitosan

由圖2可知，pH值是影響絮凝的一個重要因素，在堿性條件下絮凝效果不理想，而酸性條件下效果較好。殼聚糖屬于陽離子絮凝劑，整個體系的pH值對絮凝效果影響明顯。在堿性條件下，其氨基成電中性，吸附絡合能力顯著降低[18]；并且普魯蘭多糖發(fā)酵液的黏度也受pH值的影響，酸性條件下黏度較低，有利于殼聚糖絮凝菌體分離。當絮凝劑pH值為3.0～4.0時，除菌率較高，分別為97.6% 和96.76% ；多糖得率分別為91.15% 和91.5% 。pH值3.0和pH值4.0殼聚糖除菌效果差異不顯著，而且考慮普魯蘭多糖發(fā)酵液pH值在4.0～5.0之間，為了節(jié)約成本，選擇最佳pH值為4.0。

2.2.2 絮凝溫度對殼聚糖除菌率的影響

絮凝溫度對殼聚糖除菌率的影響見圖3。

圖3 絮凝溫度對殼聚糖除菌效果的影響Fig.3 Effect of flocculation temperature on the sterilization of chitosan

由圖3可知，隨著絮凝溫度的升高，殼聚糖絮凝除菌率緩慢上升，多糖得率逐漸上升，溫度達到40℃時除菌率和多糖得率達到最高，分別為98.10% 和95.47% ，且隨著溫度繼續(xù)升高，除菌率整體上保持穩(wěn)定，多糖得率也趨于平緩，說明絮凝溫度（＞30℃）對絮凝除菌影響較小。

2.2.3 絮凝時間對殼聚糖除菌率的影響

絮凝時間對殼聚糖除菌率的影響見圖4。

圖4 絮凝時間對殼聚糖除菌效果的影響Fig.4 Effect of flocculation time on the sterilization of chitosan

由圖4可知，絮凝除菌反應在20 min時除菌率和多糖得率達到最高，分別為98.17% 和93.97% ，隨著絮凝時間的增加，除菌率和多糖得率降低，后趨于穩(wěn)定；可能是因為保溫絮凝時間的延長會造成絮凝劑形成的架橋結構逐漸不穩(wěn)定，菌體逐漸游離出來，而普魯蘭多糖復合到殼聚糖絮凝沉淀中，進而造成除菌效率降低和多糖損失率升高。因此，最優(yōu)絮凝時間為20 min。

2.2.4 殼聚糖添加量對殼聚糖除菌率的影響

殼聚糖添加量對殼聚糖絮凝除菌率的影響見圖5。

圖5 殼聚糖添加量對殼聚糖除菌效果的影響Fig.5 Effect of chitosan addition on the sterilization of flocculation

由圖5可知，隨著殼聚糖添加量的逐漸增加，絮凝除菌率逐漸升高隨后趨于平穩(wěn)，表明殼聚糖添加量增加到一定程度后，除菌率整體上趨于穩(wěn)定。此現(xiàn)象屬于架橋絮凝機理，絮凝劑用量增加有利于其與菌體充分架橋，當生物高分子絮凝劑覆蓋菌體表面大約為50% 時，其絮凝作用最好[19]；用量過多會造成吸附過飽和，使其在每個膠粒上形成覆蓋層，再次讓膠粒呈現(xiàn)一種穩(wěn)定狀態(tài)[20]。所以，整個體系中絮凝劑用量需要適中，過量或少量都達不到理想的絮凝效果。在殼聚糖添加量為0.8 g/L時，除菌效率最高，為98.45% ，多糖得率為91.3% 。因此選擇殼聚糖的最佳添加量為0.8 g/L。

2.3 殼聚糖絮凝除菌響應面優(yōu)化試驗結果

2.3.1 響應面試驗設計及回歸模型的建立

以單因素試驗結果為基礎，以pH值（A1）、絮凝時間（B1）、殼聚糖添加量（C1）3 個因素為響應變量，以除菌率為響應值（Y1），設計三因素三水平試驗17組，結果見表3。

表3 殼聚糖絮凝除菌Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Factors and levels of Box-Behnken design of chitosan flocculation in sterilization

對表3進行回歸分析，得到回歸方程：Y1=98.60-0.862 5A1-0.700 0B1+1.54C1-0.85A1B1-0.425 0A1C1+0.800B1C1-1.59A12-2.96B12-1.34C12。對回歸方程進行方差分析，結果見表4。

表4 殼聚糖絮凝除菌的回歸模型方差分析及回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 4 Significance test for variance analysis and coefficient constants of regression models for chitosan flocculation in sterilization

由表4可以看出，除菌率模型達到極顯著水平（P＜0.01），一次項中pH值和殼聚糖添加量影響極顯著，絮凝時間影響顯著；根據(jù)F值大小，可以判斷3個因素對菌體去除率的影響主次順序為殼聚糖添加量（C1）＞pH 值（A1）＞絮凝時間（B1）；相互作用項 A1B1、B1C1顯著（P＜0.05）；模型失擬項不顯著（P＞0.05），R2=0.971 7，說明模型具有可行性；同時模型的調整決定系數(shù)R2adj為0.935 3，說明模型能夠解釋試驗93.53% 的響應值變化，表明此試驗模型與實際數(shù)據(jù)擬合程度好。

2.3.2 殼聚糖絮凝除菌各因素間交互作用

殼聚糖絮凝除菌各因素間交互作用如圖6所示。

圖6 各因素交互作用的等高線圖和曲面圖Fig.6 Contour diagrams and surface diagrams for the interaction of factors

由圖6可知，pH值和絮凝時間、絮凝時間和殼聚糖添加量的交互作用較強，與表4方差分析中顯著性檢驗結果一致。

2.3.3 響應面優(yōu)化驗證

響應面優(yōu)化最優(yōu)條件：pH值為3.71、絮凝時間為20.01 min、殼聚糖添加量為0.96 g/L，在此條件下模型預測的除菌率為99.19% 。結合實際操作的可行性，取絮凝pH值為3.70、絮凝時間為20 min、殼聚糖添加量為0.96 g/L，在此條件下進行3組驗證試驗，實際得到的除菌率為99.05% 。這與模型預測值較為接近，誤差不超過5% ，說明該模型能較好地預測實際情況。

2.4 蛋白酶的篩選

不同酶種類對粗多糖溶液脫蛋白率的影響見圖7。

圖7 酶種類對粗多糖溶液脫蛋白的影響Fig.7 Effect of enzymes on deproteinization of crude polysaccharide solution

由圖7可知，在不同酶各自最適宜的條件下，堿性蛋白酶的脫蛋白效率最高，且多糖得率也最優(yōu)，分別為67.5% 和98.55% 。表明普魯蘭多糖發(fā)酵液中蛋白質以堿性蛋白質為主，因此選擇堿性蛋白酶進行酶解試驗。

2.5 堿性蛋白酶脫蛋白單因素試驗結果

2.5.1 pH值對堿性蛋白酶脫蛋白率的影響

pH值對堿性蛋白酶脫蛋白率的影響見圖8。

圖8 pH值對堿性蛋白酶脫蛋白的影響Fig.8 Effect of pH on deproteinization of alkaline protease

pH值是影響蛋白酶催化活性的主要因素之一。一方面，pH值會改變底物的帶電狀態(tài)，對底物和蛋白酶的特異性結合產(chǎn)生影響；另一方面，過酸過堿的試驗條件下，會破壞蛋白酶的空間結構，導致蛋白酶活性降低甚至失活[21]。由圖8可知，pH值為8.0～8.5時，脫蛋白率相對較高。而且pH值對多糖得率影響不顯著。因此，確定酶解pH值為8.5，此時脫蛋白率為68.82% 。

2.5.2 酶解溫度對堿性蛋白酶脫蛋白率的影響

酶解溫度對堿性蛋白酶脫蛋白率的影響見圖9。

圖9 酶解溫度對堿性蛋白酶脫蛋白的影響Fig.9 Effect of enzymolysis temperature on deproteinization of alkaline protease

由圖9可知，酶解溫度在45℃～50℃時，脫蛋白率相對較高。酶解溫度也是影響酶的催化效率的一個重要因素，適當?shù)奶岣呙附鉁囟瓤梢源龠M酶催化反應的進行，提高脫蛋白率，但酶解溫度過高會導致酶失活，故酶解溫度確定為45℃，此時脫蛋白率最高，為69.49% ，多糖得率為98.85% 。因此，選擇酶解溫度45℃。

2.5.3 酶解時間對堿性蛋白酶脫蛋白率的影響

酶解時間對堿性蛋白酶脫蛋白率的影響見圖10。

圖10 酶解時間對堿性蛋白酶脫蛋白的影響Fig.10 Effect of enzymolysis time on deproteinization of alkaline protease

由圖10可知，當酶解時間為2.5 h時，脫蛋白率最高，為72.76% ，多糖得率為98.38% 。并且酶解時間對多糖得率無顯著影響。因此，選擇最佳酶解時間2.5 h。

2.5.4 加酶量對堿性蛋白酶脫蛋白率的影響

加酶量對堿性蛋白酶脫蛋白率的影響見圖11。

圖11 加酶量對堿性蛋白酶脫蛋白的影響Fig.11 Effect of enzyme addition on deproteinization of alkaline protease

由圖11可知，當加酶量為60 U/mL～80 U/mL時，脫蛋白率較高。隨著加酶量的增加，脫蛋白率開始降低，可能是因為蛋白酶量過多，滅酶不完全造成蛋白含量增加。因此，選擇加酶量為80 U/mL，此時脫蛋白率最高，為74.40% ，多糖得率為98.42% 。

2.6 堿性蛋白酶法脫蛋白響應面優(yōu)化試驗結果

2.6.1 響應面試驗設計及回歸模型的建立

以單因素試驗結果為基礎，以pH值（A2）、酶解溫度（B2）、酶解時間（C2）、加酶量（D2）4 個因素為響應變量，以脫蛋白率為響應值（Y2），設計四因素三水平試驗29組，結果見表5。

表5 堿性蛋白酶法脫蛋白的Box-Behnken試驗設計及結果Table 5 Factors and levels of Box-Behnken design of alkaline protease in deproteinization

對表5進行回歸分析，得到回歸方程：Y2=74.43+1.63A2+0.70B2+0.68C2+1.25D2-1.21A2B2+0.05A2C2+1.41A2D2-1.17B2C2-1.48B2D2-1.22C2D2-4.95A22-4.47B22-4.36C22-4.55D22。對回歸方程進行方差分析，結果見表6。

表6 堿性蛋白酶法脫蛋白的回歸模型方差分析及回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 6 Significance test for variance analysis and coefficient constants of regression models by alkaline protease in deproteinization

由表6可以看出，堿性蛋白酶法脫蛋白模型達到極顯著水平（P＜0.01），一次項中pH值和加酶量影響極顯著，酶解溫度和酶解時間影響顯著；根據(jù)F值大小，可以判斷4個因素對脫蛋白率的影響主次順序為pH 值（A2）＞加酶量（D2）＞酶解溫度（B2）＞酶解時間（C2）；相互作用項 A2B2、A2D2、B2D2和 C2D2顯著（P＜0.05）；模型失擬項不顯著（P＞0.05），R2=0.964 0，說明模型具有可行性；同時模型的調整決定系數(shù)R2adj為0.928 1，說明模型能夠解釋試驗92.81% 的響應值變化，表明此試驗模型與實際數(shù)據(jù)擬合程度好。

2.6.2 堿性蛋白酶法脫蛋白各因素間交互作用

堿性蛋白酶法脫蛋白各因素間交互作用如圖12所示。

圖12 各因素交互作用的等高線圖和曲面圖Fig.12 Contour diagrams and surface diagrams for the interaction of factors

由圖12可知，pH值和酶解溫度、pH值和加酶量、酶解溫度和加酶量、酶解時間和加酶量的交互作用較強，與表6的方差分析中顯著性檢驗結果一致。

2.6.3 響應面優(yōu)化驗證

響應面優(yōu)化最優(yōu)條件：pH值為8.59、酶解溫度為45.10℃、酶解時間為2.53 h，加酶量為83.10 U/mL，在此條件下模型預測的脫蛋白率為74.70% 。結合實際操作的可行性，取pH值為8.6、酶解溫度為45℃、酶解時間為2.5 h，加酶量為83 U/mL，在此條件下進行3組驗證試驗，實際得到的脫蛋白率為74% 。這與模型預測值較為接近，誤差不超過5% ，說明該模型能較好地預測實際情況。

2.7 固體普魯蘭多糖理化指標

按照上述普魯蘭多糖提取工藝，得到固體普魯蘭多糖粉末，對產(chǎn)品進行理化性質分析，結果如表7所示，產(chǎn)品質量滿足國家標準要求。

表7 固體普魯蘭多糖理化指標結果Table 7 Physicochemical indexes of solid pullulan

3 結論

本研究采用響應面分析優(yōu)化普魯蘭多糖發(fā)酵液除菌和脫蛋白工藝，結果表明最佳除菌條件：pH3.7、絮凝時間為20 min、絮凝溫度為40℃、殼聚糖添加量為0.96 g/L，此時除菌率為99.19% ，多糖得率為91.3% 。最佳脫蛋白條件：pH8.6、酶解溫度為45℃、酶解時間為2.5 h，堿性蛋白酶加酶量為83 U/mL，此時脫蛋白率為74.70% ，多糖得率為98.42% 。再經(jīng)傳統(tǒng)的樹脂脫色、超濾濃縮、干燥得到產(chǎn)品純度為91.5% ，符合國家標準要求，表明此工藝具有應用于普魯蘭多糖生產(chǎn)的潛能。