工業(yè)屬性普魯蘭酶的開發(fā)及其催化性能改善的研究進展

聶 堯，嚴 偉，徐 巖

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，無錫 214122)

普魯蘭酶屬于淀粉脫支酶，可切割普魯蘭和支鏈淀粉的α-1，6-糖苷鍵。它作用于支鏈淀粉時，可切下支鏈淀粉的整個支鏈，形成直鏈淀粉。當(dāng)它作用于普魯蘭時，主要產(chǎn)物為麥芽三糖。普魯蘭酶是重要的工業(yè)用酶，在生產(chǎn)糖漿的淀粉加工工業(yè)中，通常與其他的淀粉水解酶(如α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡糖淀粉酶)復(fù)合使用［1］。因此，研究可水解α-1，6-糖苷鍵的普魯蘭酶有利于高效獲得具有結(jié)構(gòu)多樣性和性質(zhì)獨特的多糖，在食品、制藥、能源和高聚物材料等領(lǐng)域有重要的商業(yè)價值［2］，是工業(yè)上提高生產(chǎn)效率、增加經(jīng)濟效益的有效途徑。而且，作為研究糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)的工具，普魯蘭酶也受到了極大的關(guān)注［3］。

根據(jù)水解的糖苷鍵類型，普魯蘭酶可以被分為兩類:I型普魯蘭酶(EC 3.2.1.41，專一性切割普魯蘭的α-1，6-糖苷鍵，又稱限制性糊精酶、支鏈淀粉-6-葡萄糖苷水解酶)和II型普魯蘭酶(EC 3.2.1.3，切割淀粉及相關(guān)多糖的α-1，4和α-1，6糖苷鍵，又稱淀粉普魯蘭酶)［4］。

盡管國內(nèi)外研究學(xué)者已經(jīng)對普魯蘭酶進行了大量研究，但目前能夠滿足工業(yè)需求具有工業(yè)屬性的普魯蘭酶的開發(fā)仍較為有限。微生物來源普魯蘭酶的分泌、誘導(dǎo)［5］和表達研究的開展以及嗜酸性分解普魯蘭多糖芽胞桿菌 (Bacillus acidopullulyticus)普魯蘭酶3D結(jié)構(gòu)［6］和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)普魯蘭酶晶體結(jié)構(gòu)的解析［7］為普魯蘭酶的分子改造和高效應(yīng)用提供了新的依據(jù)。

本文主要綜述了普魯蘭酶在淀粉糖漿工業(yè)中的應(yīng)用及產(chǎn)酶微生物的開發(fā)、異源表達、酶分子結(jié)構(gòu)功能和性質(zhì)改良等方面的研究內(nèi)容，以期為普魯蘭酶的高效表達、酶的分子改造及催化性能改善提供理論依據(jù)。

1 普魯蘭酶在淀粉糖漿工業(yè)中的應(yīng)用

當(dāng)前，普魯蘭酶主要應(yīng)用于淀粉糖漿工業(yè)。在糖漿工業(yè)中，使用的大部分淀粉質(zhì)原料含有約75%～85%的支鏈淀粉，如玉米中支鏈淀粉約占74%、馬鈴薯占76%［8］。支鏈淀粉是一種高度支鏈化的多糖，平均每20～25個D-葡萄糖單元就有一個分支點，因此支鏈淀粉含有4% ～5%的α-1，6糖苷鍵［9］。通常酶法水解淀粉分為液化和糖化兩個過程。在液化過程中需使用內(nèi)作用的α-淀粉酶切割淀粉的α-1，4糖苷鍵，使其成為相對分子質(zhì)量相對較低的糊精;在糖化過程中需添加葡萄糖淀粉酶(即糖化酶)將糊精完全分解為葡萄糖或添加β-淀粉酶將糊精分解為麥芽糖［10］。以酶法(α-淀粉酶和糖化酶)生產(chǎn)葡萄糖的最高轉(zhuǎn)化率DE值為96%，這是酶法生產(chǎn)糖漿的極限數(shù)值(DE值是指還原糖(以葡萄糖計)占糖漿干物質(zhì)量的百分比)。這是由于淀粉糖化過程中使用的糖化酶(即葡萄糖淀粉酶)對α-1，6糖苷鍵的作用效率低，而β-淀粉酶遇到α-1，6分支點則停止作用［9］，因此支鏈淀粉中的α-1，6糖苷鍵對糖漿的生產(chǎn)無疑是障礙。若在糖化過程中加入可作用于α-1，6糖苷鍵的脫支酶，則糖化的效率可顯著提高。

普魯蘭酶是比較理想的脫支酶。在糖化過程中，普魯蘭酶與糖化酶共同作用，普魯蘭酶切割分支點，糖化酶只需切割線性的低聚糖，可顯著地提高淀粉的水解效率，不僅降低糖化酶用量，還可使DE值提高到97%以上，提高水解產(chǎn)物葡萄糖或麥芽糖的質(zhì)量和純度。由于淀粉的糖化過程在較高的溫度(55～60℃)、微酸性條件(pH 4.5～5.5)下進行，因此應(yīng)用于糖漿工業(yè)的普魯蘭酶需要有較好的耐熱耐酸性能［10］。

Norman等［9］將微生物普魯蘭酶與黑曲霉糖化酶聯(lián)用，研究了普魯蘭酶的添加對糖化過程的影響，發(fā)現(xiàn)未加入普魯蘭酶時，D-葡萄糖最大質(zhì)量分數(shù)為96%，而使用對照組一半用量的葡萄糖淀粉酶和0.25 U/g干物質(zhì)量的普魯蘭酶，D-葡萄糖最大質(zhì)量分數(shù)提高0.5%，繼續(xù)提高普魯蘭酶用量可使葡萄糖質(zhì)量分數(shù)提高1.5%。并且雙酶聯(lián)用可增大糖化過程的底物濃度。在未加普魯蘭酶的對照組中，當(dāng)?shù)孜锔晌镔|(zhì)量分數(shù)為32%時，得到96%的D-葡萄糖，而使用對照組一半用量的葡萄糖淀粉酶和和1 U/g干物質(zhì)量的普魯蘭酶時，可在高達37%的底物干物質(zhì)量分數(shù)下獲得相同水平的D-葡萄糖。另外，典型的糖化反應(yīng)需要48～96 h，而通過加入普魯蘭酶則可縮短反應(yīng)時間。當(dāng)添加0.4 U/g干物質(zhì)量的普魯蘭酶時，獲得相同水平D-葡萄糖的反應(yīng)時間甚至可縮短到30 h左右。

Norman等的研究結(jié)果對淀粉糖漿工業(yè)有重要的經(jīng)濟意義，因為普魯蘭酶的加入首先減少了葡萄糖淀粉酶的用量，不僅節(jié)約了生產(chǎn)成本，而且葡萄糖淀粉酶用量的減少還可減少異麥芽糖的生成，提高產(chǎn)物純度。其次，在更高的底物濃度下進行糖化，可大大降低產(chǎn)物蒸發(fā)時的成本。另外糖化反應(yīng)時間的縮短可增加生產(chǎn)批次，大幅提高經(jīng)濟效益［9］。

2 普魯蘭酶產(chǎn)生菌種及其比較

普魯蘭酶主要存在于植物［11］和微生物中，前者的普魯蘭酶被稱為R-酶［11］。自從1961年Wallenfels等［12］從肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中發(fā)現(xiàn)普魯蘭酶，迄今為止，已有許多的微生物普魯蘭酶被發(fā)現(xiàn)和研究。文獻中常見的普魯蘭酶產(chǎn)生菌株見表1。

表1 普魯蘭酶產(chǎn)生菌株及其部分性質(zhì)Table 1 Different microorganisms producing pullulanase and their partial properties

淀粉的糖化過程在57～63℃、pH 4.0～4.5的條件下進行，因此，要求普魯蘭酶需要有較好的耐熱耐酸性能。由表1可以發(fā)現(xiàn)，除B.acidopullulyticus外，其他微生物的普魯蘭酶均不太符合糖化過程的要求，這也是B.acidopullulyticus可以被用于生產(chǎn)商品普魯蘭酶的原因之一。

淀粉的液化在95～105℃下進行，糖化條件則通常為60 ℃、pH 4.5 ～5.5［10］，由液化轉(zhuǎn)入糖化時需要降低溫度并加酸降低糖漿的pH。若在液化的條件下可以同時進行糖化，既可以省去加酸堿調(diào)節(jié)pH的過程以簡化工藝、降低成本，又可以有效地防止微生物污染，并且在液化的高溫下，還可以獲得較高的反應(yīng)速率。因此，人們希望將液化和糖化過程合并，即在液化的條件下用耐高溫的糖化酶和普魯蘭酶實現(xiàn)糖化。但早期所發(fā)現(xiàn)的普魯蘭酶的耐熱性都較差，最適作用的溫度偏低，因此不適合在液化過程的條件下作用。

為獲得耐高溫的普魯蘭酶，研究人員開始從極端嗜熱微生物中篩選普魯蘭酶產(chǎn)生菌。獲得的普魯蘭酶生 產(chǎn) 菌 種 包 括 D.mucosus［19］、A.gottschalkii［21］、G.thermoleovorans US105［22］、R.marinus［23］、Bacillus sp.AN-7［1］、T.maritime MSB8［24］、F.pennavorans Ven5［25］等。這些微生物的普魯蘭酶最適溫度均在70℃以上，部分甚至達到90℃，基本符合在液化過程高溫下水解淀粉的要求。

3 普魯蘭酶的異源表達

雖然學(xué)者們獲得了許多產(chǎn)普魯蘭酶的微生物，但這些原始菌種的大多數(shù)發(fā)酵酶活很低，無法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。自20世紀90年代以來，采用基因工程技術(shù)將普魯蘭酶編碼基因克隆進宿主中，構(gòu)建高產(chǎn)的重組菌，已被許多學(xué)者采用，并且已獲得了一些產(chǎn)酶能力強于原始菌的重組菌(表2)。常用的宿主菌為大腸桿菌和枯草芽胞桿菌，也有在酵母中表達的報道［28-29］，但由于普魯蘭酶主要來源于原核微生物，因此普魯蘭酶的真核表達報道極少。

表2 普魯蘭酶基因在原核系統(tǒng)中的異源表達Table 2 Heterologous expression of pullulanase genes in prokaryotic systems

3.1 普魯蘭酶在大腸桿菌中的表達

Takizawa等［31］將 K.aerogenes 70 的普魯蘭酶基因pul克隆至pBR322質(zhì)粒，并構(gòu)建了重組大腸桿菌。該重組大腸桿菌產(chǎn)生比野生型K.aerogenes W70多3～7倍的普魯蘭酶。將相同的含有 pul基因的pBR322轉(zhuǎn)入野生型K.aerogenes W70，則使普魯蘭酶總產(chǎn)量提高20～40倍，胞內(nèi)酶水平比原始W70菌高100～150倍。這證明了pBR322上的pul基因可以在大腸桿菌和K.aerogenes中表達，并且普魯蘭酶產(chǎn)量可大幅提高。Bertoldo等［25］將編碼極端嗜熱厭氧菌F.pennavorans Ven5的Ⅰ型普魯蘭酶基因pulA克隆至大腸桿菌。不帶信號肽的pulA基因被亞克隆進表達載體pSE420，并在trc啟動子控制下在大腸桿菌中過量表達。該不帶信號肽的普魯蘭酶酶活比原始菌株產(chǎn)生的普魯蘭酶高122倍，比鳥槍法獲得的克隆子高40倍。Zouari等［22］通過使用2種不同的信號肽，使G.thermoleovorans US105(PUL US105)的Ⅰ型普魯蘭酶在大腸桿菌周質(zhì)空間或胞外高效分泌。其中，帶有Ssamy信號肽的重組大腸桿菌用于考察普魯蘭酶分布，質(zhì)粒上的Ssamy-pul US105先由lac啟動子控制，酶活測定顯示胞外酶活最高，胞內(nèi)只有胞外的10%，周質(zhì)無酶活，此時普魯蘭酶酶活相對較低。然后將lac啟動子替換成trc啟動子，結(jié)果比酶活提高8倍(12 U/mg)。

但將普魯蘭酶編碼基因克隆至異源宿主并不能總是獲得過量表達的重組菌。Michaelis等［37］將K.pneumoniae的pulA基因克隆至大腸桿菌，pulA基因的表達受到麥芽糖調(diào)節(jié)子的malT調(diào)節(jié)基因控制。載有單個pulA基因拷貝的重組菌的普魯蘭酶表達量只有野生型K.pneumoniae的10% ～20%，可能的原因是由于大腸桿菌的malT蛋白對pulA啟動子活性不高導(dǎo)致pulA基因在大腸桿菌中轉(zhuǎn)錄效率不高。另一個可能的原因是普魯蘭酶在大腸桿菌細胞膜中的不適當(dāng)定位導(dǎo)致在大腸桿菌中不穩(wěn)定。

3.2 普魯蘭酶在枯草芽胞桿菌中的表達

宿主菌的安全性是食品級酶制劑發(fā)展的最重要因素之一。目前，有幾種微生物通常被認為是安全的，如 E.coli K-12，B.subtilis和A.niger，它們被廣泛地用作生產(chǎn)食品級酶的宿主細胞［38］。枯草芽胞桿菌(B.subtilis)作為外源基因表達的宿主，具有如下優(yōu)點:不含內(nèi)毒素，為非致病的土壤微生物;有很多噬菌體和質(zhì)?？勺鳛榭莶菅堪麠U菌的克隆載體，并且有可利用的強啟動子;具有很強的分泌蛋白質(zhì)的能力，分泌的蛋白質(zhì)具有天然活性，且大多數(shù)蛋白被分泌到胞外［39］。普魯蘭酶主要應(yīng)用于食品工業(yè)，因此常用枯草芽胞桿菌作為表達普魯蘭酶的宿主菌。

Duffner等［19］將超高溫厭氧古菌 D.mucosus的普魯蘭酶基因apuA克隆至質(zhì)粒pJA803，并在宿主菌B.subtilis DN1885中表達。apuA基因由α-淀粉酶啟動子(PamyM)控制。收集發(fā)酵上清液，經(jīng)過陰離子交換、疏水層析和凝膠過濾后，得到的純普魯蘭酶比酶活為26 U/mg。重組活性蛋白的表觀相對分子質(zhì)量為6.6×104，與D.mucosus的原始酶相同。該高溫古菌普魯蘭酶在枯草桿菌中表達量較低(15 mg/L)，原因可能有mRNA穩(wěn)定性、密碼子偏好、蛋白質(zhì)折疊與分泌。進一步研究發(fā)現(xiàn):D.mucosus普魯蘭酶有典型的古細菌密碼子偏好，N端的22個氨基酸有9個大腸桿菌的稀有密碼子，因此密碼子偏好性可能是表達水平低的重要原因。

4 普魯蘭酶結(jié)構(gòu)與功能分析

4.1 普魯蘭酶的分子結(jié)構(gòu)

普魯蘭酶的一級結(jié)構(gòu)可分為4個結(jié)構(gòu)域:A、B、C、F［40-41］。結(jié)構(gòu)域A有一些區(qū)域與8個α螺旋和8個β鏈一致，形成中心的催化的(β/α)8-折疊筒。一個小的結(jié)構(gòu)域B以環(huán)的形式插入到第3個α螺旋和第3個β鏈間［42-43］。結(jié)構(gòu)域B參與形成活性中心和折疊筒的壁。結(jié)構(gòu)域C有8個β鏈，而且，結(jié)構(gòu)域C連接到結(jié)構(gòu)域A的C-末端，有時結(jié)構(gòu)域F連接到結(jié)構(gòu)域A的N-末端［44-45］。結(jié)構(gòu)域F有一個短的α螺旋和6個β鏈，折疊為形成β-三明治基序的β-反平行片層［46］。

嗜酸性分解普魯蘭多糖芽胞桿菌(B.acidopullulyticus)普魯蘭酶的3D結(jié)構(gòu)已獲得解析［6］。該普魯蘭酶(BaPul13A)的成熟蛋白含921個氨基酸，由CBM41-X45a-X25-X45b-CBM48-GH13_14等部分形成了多結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(圖1)。其中CBM表示糖類結(jié)合結(jié)構(gòu)域，X表示未知功能的組件，GH13_14為CAZY GH13結(jié)構(gòu)域。該酶的3D結(jié)構(gòu)見圖2。CBM41 N端結(jié)構(gòu)域在晶體中高度無序，無法模擬其結(jié)構(gòu)，與其他酶比對后推測該結(jié)構(gòu)域可能有糖原/淀粉結(jié)合功能。X45a-X25-X45b功能未知，CBM48為糖原/淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域，GH13_14為催化組件，屬GH13家族，其自身含有α-淀粉酶共有的3個典型的A、B、C結(jié)構(gòu)域。因此，BaPul13A成熟蛋白為含有7個結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，其3個催化結(jié)構(gòu)域連接到4個N端輔助的結(jié)構(gòu)域。

圖1 BaPul13A分子結(jié)構(gòu)示意［6］Fig.1 Schematic diagram of the modular structure of BaPul13A［6］

圖2 BaPul13A的3D結(jié)構(gòu)Fig.2 3-D structure of BaPul13A

4.2 普魯蘭酶的重要氨基酸位點

Liebl等［47］研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的普魯蘭酶都含有高度保守的區(qū)域Ⅰ～Ⅳ，這些區(qū)域組成一個活性中心和共有的底物結(jié)合位點。此外，Kuriki等［48］發(fā)現(xiàn)普魯蘭酶催化位點中的2種氨基酸:精氨酸(Arg)和谷氨酸(Glu)，對酶的催化活力十分重要。他們還發(fā)現(xiàn)，Asp-206、His-210和His-296在底物結(jié)合位點發(fā)揮重要作用［49］。

為探索普魯蘭酶的功能位點，Yamashita等［50］替換了 K.aerogenes普魯蘭酶重要位點的氨基酸His-607、Asp-677、His-682 和 His-833，這些氨基酸分別位于普魯蘭酶的4個保守區(qū)。His-607、Asp-677和His-833的氨基酸替換導(dǎo)致酶活完全喪失。相比之下，His-682的替換仍保留了酶活。測定這些突變體對普魯蘭酶的競爭性抑制劑——α-或β-環(huán)糊精的結(jié)合親和力后發(fā)現(xiàn)，His-833的突變不影響普魯蘭酶對α-環(huán)糊精的親和力，而His-607和Asp-677的突變體導(dǎo)致喪失其對普魯蘭的結(jié)合能力。這些結(jié)果表明K.aerogenes普魯蘭酶的His-607、Asp-677位點參與普魯蘭酶與底物的結(jié)合，而His-833位點與催化有關(guān)。

4.3 普魯蘭酶的保守序列

許多普魯蘭酶的氨基酸序列中都有4個保守區(qū)。所有的Ⅰ型普魯蘭酶都具有共有序列YNWGYDP［50］，YNWGYDP 基序位于酶的中部，分析顯示該基序可能與底物結(jié)合或催化活力相關(guān)。Ⅱ型普魯蘭酶含有與Ⅰ型酶不同的特異序列，2種普魯蘭酶的序列的最大不同在于共有序列Ⅱ和Ⅳ。Ⅱ型普魯蘭酶的共有序列Ⅱ可被分為兩部分，其中第二部分位于共有序列Ⅲ和Ⅳ中間［4］。另外，Berloldo等［51］研究顯示，古細菌Ⅱ型普魯蘭酶不含YNWGYDP共有序列及保守區(qū)域Ⅰ～Ⅳ。

4.4 普魯蘭酶中脯氨酸含量與熱穩(wěn)定性的關(guān)系

酶分子的熱穩(wěn)定性通常與其氨基酸組成和含量有關(guān)。Suzuki等［52］研究發(fā)現(xiàn)，增加 β-轉(zhuǎn)角和總的疏水性氨基酸中脯氨酸的頻率，芽胞桿菌的寡聚-1，6-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性可得到提高。Matthew等［53］的實驗亦證明了上述發(fā)現(xiàn)。Suzuki等［54］研究噬菌體T4溶菌酶時，通過在一個β-轉(zhuǎn)角處用脯氨酸(Pro)替換了丙氨酸(Ala)，降低了酶分子骨架的折疊熵，從而提高了溶菌酶的熱穩(wěn)定性。因此，該發(fā)現(xiàn)被稱為脯氨酸理論。

Suzuki等［18］比較 K.pneumoniae、B.acidopullulyticus和B.flavocaldarius的普魯蘭酶時發(fā)現(xiàn)，脯氨酸理論適用于這3種菌的普魯蘭酶:①以K.pneumoniae→B.acidopullulyticus→B.flavocaldarius的順序，3 種細菌的普魯蘭酶脯氨酸含量依次升高，熱穩(wěn)定性也隨之提高;②比較結(jié)構(gòu)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)極端嗜熱菌B.flavocaldarius的普魯蘭酶僅在疏水相互作用上超過中溫菌的普魯蘭酶。B.flavocaldarius普魯蘭酶含有更多的脯氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和亮氨酸，而絲氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和天冬氨酸則比中溫菌的普魯蘭酶少。大量的脯氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸有助于增強疏水相互作用，精氨酸、組氨酸、賴氨酸和天冬氨酸幾乎不影響離子鍵勢能。疏水相互作用被認為是穩(wěn)定嗜熱酶最重要的因素［55］。

脯氨酸理論對蛋白質(zhì)工程意義重大。利用該理論，可創(chuàng)造出熱穩(wěn)定性優(yōu)良的普魯蘭酶變體，可為提高普魯蘭酶的熱穩(wěn)定性提供切實可行的策略。

5 改善普魯蘭酶熱穩(wěn)定性的其他方式

在淀粉糖化過程中，普魯蘭酶的熱穩(wěn)定性非常重要。良好的熱穩(wěn)定性允許提高糖化反應(yīng)溫度和底物濃度，并阻止微生物生長［56］。雖然研究人員從極端嗜熱微生物中分離出了產(chǎn)耐高溫普魯蘭酶的菌種，但這些菌種的普魯蘭酶熱穩(wěn)定性依然不太理想。如R.marinus的普魯蘭酶，雖然最適作用溫度達到80℃，但在85℃下的半衰期只有30 min［23］。因此，需要通過一些技術(shù)手段增強普魯蘭酶的熱穩(wěn)定性。

5.1 底物類似物對普魯蘭酶熱穩(wěn)定性的影響

Kusano等［56］發(fā)現(xiàn)，大于麥芽三糖醇的麥芽寡糖能夠完全保護普魯蘭酶免遭熱鈍化，這可能是由于酶與底物類似物的相互作用穩(wěn)定了普魯蘭酶的四級結(jié)構(gòu)。鑒于此，Kusano等研究了D-葡萄糖醇(G1-OH)、麥芽糖醇(G2-OH)、麥芽三糖醇(G3-OH)、麥芽四糖醇(G4-OH)和麥芽五糖醇(G5-OH)對B.acidopullulyticus普魯蘭酶熱穩(wěn)定性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，普魯蘭酶在0.56、0.28、0.14和0 mol/L的D-葡萄糖醇中60℃熱處理90 min后，殘余酶活依次下降，說明普魯蘭酶的熱穩(wěn)定性依賴于D-葡萄糖醇的濃度。同時還發(fā)現(xiàn)，隨著作為熱保護劑的糖醇的葡萄糖基增加，普魯蘭酶穩(wěn)定性提高。另外，高濃度的麥芽糖醇也可穩(wěn)定其他的普魯蘭酶。這些結(jié)果說明了糖醇的添加可提高普魯蘭酶的熱穩(wěn)定性，葡萄糖基數(shù)較多的糖醇可作為普魯蘭酶的熱保護劑應(yīng)用于糖漿工業(yè)。

5.2 固定化普魯蘭酶

酶的固定化是提高酶熱穩(wěn)定性的有效措施之一，而且使用固定化酶可實現(xiàn)工業(yè)酶促過程的連續(xù)操作。目前科研人員已通過固定化技術(shù)成功提高了普魯蘭酶熱穩(wěn)定性。

Singh等［2］將 B.acidopullulyticus普魯蘭酶共價固定在通用軟化樹脂Duolite XAD761上。固定化普魯蘭酶顯示了比游離酶更好的溫度特性。pH 5.5下最適溫度達到60℃，比游離酶高10℃;65℃下熱處理6 h后保留了85%的酶活，70℃下處理3 h殘余32.38%的活力，而70℃下游離酶則迅速失活。固定化普魯蘭酶對普魯蘭、可溶性淀粉和糊精的最大反應(yīng)速率分別為4.0、4.17和5.00 U/g，均高于游離酶。循環(huán)使用25批后，固定化普魯蘭酶的酶活下降到初始的一半，表明該固定化普魯蘭酶具有較好的重復(fù)利用能力。

Kuroiwa等［57］通過普魯蘭酶的氨基和凝膠表面的醛基多點結(jié)合，將K.pneumoniae的普魯蘭酶用瓊脂凝膠固定化。50℃熱處理8 h后，游離酶完全失活，而相比之下固定化的酶則相當(dāng)穩(wěn)定，熱處理48 h后殘余30%的酶活。并且發(fā)現(xiàn)，一個普魯蘭酶分子連接的醛基密度為17.9個醛基/3600×10-20m2時固定化酶的熱穩(wěn)定性最好，在pH 6.0的磷酸緩沖液中45℃熱處理200 h后依然保留60%的酶活。

6 結(jié)語

對于普魯蘭酶的研究，國內(nèi)主要集中在產(chǎn)酶菌種的篩選與鑒定。國外則研究得較深入，目前已對普魯蘭酶基因與酶分子的結(jié)構(gòu)、酶的定位與分泌機制有了較清楚的認識。但對普魯蘭酶在分子水平上進行改造，以獲得酶學(xué)性質(zhì)更加優(yōu)良的普魯蘭酶變體，則研究較少。

從普魯蘭酶的研究現(xiàn)狀來看，現(xiàn)有菌種產(chǎn)生的普魯蘭酶在酶學(xué)性質(zhì)上依然不能完全滿足工業(yè)需求，因此需要尋找更多酶學(xué)性質(zhì)更好的產(chǎn)生菌種。自然界中超過99%的原核微生物無法在實驗室中培養(yǎng)［58］，其中含有大量普魯蘭酶產(chǎn)生菌。采用常規(guī)的方法無法獲得這些非培養(yǎng)微生物的普魯蘭酶編碼基因。宏基因組學(xué)已被用于從未培養(yǎng)微生物中尋找新的功能基因，并成功地獲得了蛋白酶、甘油水解酶和氧化還原酶等多種酶類的編碼基因。將宏基因組學(xué)應(yīng)用于普魯蘭酶基因的尋找，將很可能獲得更多新的普魯蘭酶編碼基因［59］。

另一方面，雖然人們已獲得產(chǎn)普魯蘭酶的基因工程菌，但普魯蘭酶表達水平依然普遍較低，所產(chǎn)的普魯蘭酶酶學(xué)性質(zhì)仍有缺陷，并且重組芽胞桿菌的重組質(zhì)粒穩(wěn)定性不夠理想。因此，今后的研究工作一方面需要尋找和構(gòu)建更加優(yōu)良的表達載體，采用信號肽選擇、啟動子改造、翻譯起始區(qū)優(yōu)化等手段實現(xiàn)重組菌普魯蘭酶的高效表達;另一方面，可以采用定向進化等分子改造手段改造普魯蘭酶本身，進一步改善其酶學(xué)特性，如提高普魯蘭酶對底物的親和力、酶的熱穩(wěn)定性和pH耐受性等。若能通過上述手段獲得耐高溫普魯蘭酶高產(chǎn)重組菌株，將會對食品工業(yè)及相關(guān)領(lǐng)域產(chǎn)生深遠的影響。

［1］Kunamneni A，Singh S.Improved high thermal stability of pullulanase from a newly isolated thermophilic Bacillus sp.AN-7［J］.Enzyme Microb Technol，2006，39(7):1399-1404.

［2］Singh R S，Saini G K，Kennedy J F.Covalent immobilization and thermodynamic characterization of pullulanase for the hydrolysis of pullulan in batch system［J］.Carbohydr Polym，2010，81(2):252-259.

［3］Kitahata S，Tanimoto T，Ikuta A，et al.Synthesis of novel heterobranched beta-cyclodextrins from 42-O-beta-D-galactosylmaltose and beta-cyclodextrin by the reverse action of pullulanase，and isolation and characterization of the products［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2000，64(6):1223-1229.

［4］Domań-Pytka M，Bardowski J.Pullulan degrading enzymes of bacterial origin［J］.Crit Rev Microbiol，2004，30(2):107-121.

［5］Nair S，Singhal R，Kamat M.Induction of pullulanase production in Bacillus cereus FDTA-13［J］.Biores Technol，2007，98(4):856-859.

［6］Turkenburg J P，Brzozowski A M，Svendsen A，et al.Structure of a pullulanase from Bacillus acidopullulyticus［J］.Proteins，2009，76(2):516-519.

［7］Mikami B，Iwamoto H，Malle D，et al.Crystal structure of pullulanase:evidence for parallel binding of oligosaccharides in the active site［J］.J Mol Biol，2006，359(3):690-707.

［8］周念波，孫杰，王晶，等.普魯蘭酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］.食品工程，2008(2):18-20.

［9］Norman B E，Bagsvaerd.A novel debranching enzyme for application in the glucose syrup industry［J］.Stárch:Starke，1982，34:340-346.

［10］Castro G R，Santopietro L M D，Sineriz F.Acid pullulanase from Bacillus polymyxa MIC-23［J］.Appl Biochem Biotechnol，1992，37:227-233.

［11］Wu C，Colleoni C，Myers A M，et al.Enzymatic properties and regulation of ZPU1，the maize pullulanase-type starch debranching enzyme［J］.Arch Biochem Biophys，2002，406(1):21-32.

［12］Wallenfels K，Bender H，Rached J.Pullulanase from Aerobacter aerogenes;production in a cell-bound state.Purification and properties of the enzyme［J］.Biochem Biophys Res Commun，1966，22(3):254-261.

［13］Takasaki Y.Productions and utilizations of beta-amylase and pullulanase from Bacillus cereus var.mycoides［J］.Agric Biol Chem，1976，40(8):1515-1522.

［14］SChülein M，H jer-Pedersen B.Characterization of a new class of thermophilic pullulanases from Bacillus acidopullulyticus［J］.Ann New York Acad Sci，1984，434(1):271-274.

［15］Matuschek M，Burchhardt G，Sahm K，et al.Pullulanase of Thermoanaerobacterium thermosulfurigenesEM1(Clostridium thermosulfurogenes):molecular analysis of the gene，composite structure of the enzyme，and a common model for its attachment to the cell surface［J］.J Bacteriol，1994，176(11):3295.

［16］Takasaki Y.Pullulanase-Amylase complex enzyme from Bacillus subtilis［J］.Agric Biol Chem，1987，51(1):9-16.

［17］Plant A R，Morgan H W，Daniel R M.A highly stable pullulanase from Thermus aquaticus YT-1［J］.Enzyme Microb Technol，1986，8:668-672.

［18］Suzuki Y，Hatagaki K，Oda H.A hyperthermostable pullulanase produced by an extreme thermophile，Bacillus flavocaldarius KP 1228，and evidence for the proline theory of increasing protein thermostability［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1991，34(6):707-714.

［19］Duffner F，Bertoldo C，Andersen J T，et al.A new Thermoactive Pullulanase from desulfurococcus mucosus cloning，sequencing，purification，and characterization of the recombinant enzyme after expression in Bacillus subtilis［J］.J Bacteriol，2000，182(22):6331-6338.

［20］Albertson G D，McHale R H，Gibbs M D，et al.Cloning and sequence of a type I pullulanase from an extremely thermophilic anaerobic bacterium，Caldicellulosiruptor saccharolyticus［J］.Biochim Biophys Acta，1997，1354(1):35-39.

［21］Bertoldo C，Armbrecht M，Becker F，et al.Cloning，sequencing，and characterization ofa heat-and Alkali-Stable type I pullulanase from Anaerobranca gottschalkii［J］.Appl Environ Microbiol，2004，70(6):3407-3416.

［22］Zouari Ayadi D，Ben Ali M，Jemli S，et al.Heterologous expression，secretion and characterization of the Geobacillus thermoleovorans US105 type I pullulanase［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2008，78(3):473-481.

［23］Gomes I.Highly thermostable amylase and pullulanase of the extreme thermophilic eubacterium Rhodothermus marinus:production and partial characterization［J］.Biores Technol，2003，90(2):207-214.

［24］Kriegshauser G，Liebl W.Pullulanase from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima:purification by beta-cyclodextrin affinity chromatography［J］.J Chromatogr B:Biomed Sci Appl，2000，737(1/2):245-251.

［25］Bertoldo C，Duffner F，Jorgensen P L，et al.Pullulanase type I from Fervidobacterium pennavorans Ven5:cloning，sequencing，and expression of the gene and biochemical characterization of the recombinant enzyme［J］.Appl Environ Microbiol，1999，65(5):2084-2091.

［26］Francetic O，Pugsley AP.Towards the identification of type II secretion signals in a nonacylated variant of pullulanase from Klebsiella oxytoca［J］.J Bacteriol，2005，187(20):7045-7055.

［27］Kuriki T，Okada S，Imanaka T.New type of pullulanase from Bacillus stearothermophilus and molecular cloning and expression of the gene in Bacillus subtilis［J］.J Bacteriol，1988，170(4):1554-1559.

［28］Janse B J，Pretorius I S.Expression of the Klebsiella pneumoniae pullulanase-encoding gene in Saccharomyces cerevisiae［J］.Curr Genet，1993，24(1/2):32-37.

［29］Xu B，Yang Y J，Huang Z X.Cloning and overexpression of gene encoding the pullulanase from Bacillus naganoensis in Pichia pastoris［J］.J Microbiol Biotechnol，2006，16(8):1185-1191.

［30］Ben Messaoud E，Ben Ammar Y，Mellouli L，et al.Thermostable pullulanase type I from new isolated Bacillus thermoleovorans US105:cloning，sequencing and expression of the gene in E.coli［J］.Enzyme Microb Technol，2002，31(6):827-832.

［31］Takizawa N，Murooka Y.Cloning of the pullulanase gene and overproduction of pullulanase in Escherichia coli and Klebsiella aerogenes［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1985，49(2):294-298.

［32］Duffner F，Bertoldo C，Andersen J T，et al.A new thermoactive pullulanase from Desulfurococcus mucosus:cloning，sequencing，purification，and characterization of the recombinant enzyme after expression in Bacillus subtilis［J］.J Bacteriol，2000，182(22):6331.

［33］Kurik T，Park IJH，OkadaS，etal.Purification and characterization ofThermostable Pullulanase from Bacillus stearothermophilus and molecular cloning and expression of the gene in Bacillus subtilis［J］.Appl Environ Microbiol，1988，54(11):2881-2883.

［34］Martin W T，Phillip J B，Larry N A，et al.Pullulanase expression constructs containing α-amylase promoter and leader sequences:US，6300115B1［P］.2001-10-09.

［35］Dennis M.Katkocin N W Z，Yang S S.Novel thermostable pullulanase enzyme and method for its production:US，4628028［P］.1986-12-09.

［36］Philippe Deweer A A.Pullulanase producing microrganisms:US，5817498［P］.1998-10-06.

［37］Michaelis S，Chapon C，D'Enfert C，et al.Characterization and expression of the structural gene for pullulanase，a maltoseinducible secreted protein of Klebsiella pneumoniae［J］.J Bacteriol，1985，164(2):633-638.

［38］Choi C H，Kim S H，Jang J H，et al.Enzymatic synthesis of glycosylated puerarin using maltogenic amylase from Bacillus stearothermophilus expressed in Bacillus subtilis［J］.J Sci Food Agric，2010，90(7):1179-1184.

［39］彭清忠，張惟材，朱厚礎(chǔ).枯草桿菌表達系統(tǒng)的研究進展［J］.生物技術(shù)通訊.2001，12(3):220-225.

［40］Ohdan K，Kuriki T，Kaneko H，et al.Characteristics of two forms of α-amylase and structural implication ［J］.Appl Environ Microbiol，1999，65(10):4652-4658.

［41］Svensson B.Protein engineering in the α-amylase family:catalytic mechanism，substrate specificity，and stability［J］.Plant Mole Biolo，1994，25(2):141-157.

［42］Janecek S，Svensson B，Henrissat B.Domain evolution in the αamylase family［J］.J Mol Evolution，1997，45(3):322-331.

［43］Jespersen H M，MacGregor E A，Sierks M R，et al.Comparison of the domain-level organization of starch hydrolases and related enzymes［J］.Biochem J，1991，280(Pt 1):51-55.

［44］Renz A，Schikora S，Schmid R，et al.cDNA sequence and heterologousexpression ofmonomeric spinach pullulanase:multiple isomeric forms arise from the same polypeptide［J］.Biochem J，1998，331(Pt 3):937-945.

［45］Ryter A，Pugsley A.Cloning and expression in Escherichia coli of the Klebsiella pneumoniae genes for production，surface localization and secretion of the lipoprotein pullulanase［J］.EMBO J，1987，6(11):3531-3538.

［46］Kashiwabara S，Ogawa S，Miyoshi N，et al.Three domains comprised in thermostable molecular weight 54，000 pullulanase of type I from Bacillus flavocaldarius KP1228 ［J］.Biosci，Biotechnol，Biochem，1999，63(10):1736-1748.

［47］Liebl W，Stemplinger I，Ruile P.Properties and gene structure of the Thermotoga maritima alpha-amylase AmyA，aputative lipoprotein of a hyperthermophilic bacterium［J］.J Bacteriol，1997，179(3):941-948.

［48］Kuriki T，Imanaka T.The concept of the［alpha］-amylase family:structural similarity and common catalytic mechanism［J］.J Biosci Bioeng，1999，87(5):557-565.

［49］Kuriki T，Imanaka T.Nucleotide sequence of the neopullulanase gene from Bacillus stearothermophilus［J］.Microbiology，1989，135(6):1521-1528.

［50］Yamashita M，Matsumoto D，Murooka Y.Amino acid residues specific for the catalytic action towards α-1，6-glucosidic linkages in Klebsiella pullulanase［J］.J Ferment Bioeng，1997，84(4):283-290.

［51］Bertoldo C，Antranikian G.Starch-hydrolyzing enzymes from thermophilic archaea and bacteria［J］.Curr Opin Chem Biol，2002，6(2):151-160.

［52］SuzukiY，F(xiàn)ujiiH，Uemura H，etal.Purification and characterization of extremely thermostable exo-oligo-1，6-glucosidase from a caldoactive Bacillus sp.KP 1228［J］.Starch:St?rke，1987，39(1):17-23.

［53］MatthewsB，Nicholson H，BecktelW.Enhanced protein thermostability from site-directed mutations that decrease the entropy of unfolding［J］.PNAS，1987，84(19):6663-6667.

［54］Suzuki Y.A general principle of increasing protein thermostability［J］.Proc Jpn Acad Ser B，1989，65(6):146-148.

［55］Menéndez-AriasL，ArgosfP.Engineering protein thermal stability:Sequence statistics point to residue substitutions in αhelices［J］.J Mol Biol，1989，206(2):397-406.

［56］Kusano S，Takahashi S，F(xiàn)ujimoto D，et al.Effects of reduced maltooligosaccharides on the thermal stability of pullulanase from Bacillus acidopullulyticus ［J］.Carbohydr Res，1990，199(1):83-89.

［57］Kuroiwa T，Shoda H，Ichikawa S，et al.Immobilization and stabilization of pullulanase from Klebsiella pneumoniae by a multipoint attachment method using activated agar gel supports［J］.Process Biochem，2005，40(8):2637-2642.

［58］SchlossP D，Handelsman J.Metagenomics for studying unculturable microorganisms:cutting the Gordian knot［J］.Genome Biol，2005，6(8):229.doi:10.1186/qb-2005-6-8-229.

［59］Schmeisser C，Steele H，Streit W R.Metagenomics，biotechnology with non-culturable microbes［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，75(5):955-962.