具有差向選擇性還原(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯活性的微生物菌株篩選和鑒定

盛駿楨，王亞軍，羅 希，鄭裕國(guó)

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所 生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程研究中心，杭州 310014)

他汀類藥物作為一類高效的降血脂藥物，能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶，限制膽固醇生物合成［1］，是全球銷量最高的降血脂藥物［2］。作為合成阿托伐他汀藥效基團(tuán)的關(guān)鍵手性中間體，6－氰基－(3R，5R)－二羥基己酸叔丁酯的合成是生產(chǎn)阿托伐他汀的關(guān)鍵技術(shù)［3］?；瘜W(xué)法合成6－氰基－(3R，5R)－二羥基己酸叔丁酯存在能耗大、溶劑消耗高和產(chǎn)物光學(xué)純度低等缺陷，利用生物催化的高效率、高立體選擇性和環(huán)境友好等特性，開(kāi)發(fā)6－氰基－(3R，5R)－二羥基己酸叔丁酯手性生物合成技術(shù)具有重要的意義，也逐漸成為研究熱點(diǎn)［4－5］。

羰基還原酶在生物催化反應(yīng)中具有空間選擇性的特點(diǎn)，因而為生物催化還原酮酯制備光學(xué)純?chǔ)拢u基酯提供了一條有效的途徑［6］。然而，在立體化學(xué)方面大多數(shù)天然羰基還原酶催化的非對(duì)稱還原大多遵守Prelog法則，具有反Prelog法則的羰基還原酶相對(duì)較少，反Prelog法則立體選擇性酶的精確機(jī)理也尚未解析［7－8］。筆者所在課題組成功篩選得到具有非對(duì)映選擇性還原 (R)－6－氰基－5－羥基 －3－羰基己酸叔丁酯活性的菌株 ZJB－09225，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，并研究其催化性能，以建立6－氰基－(3R，5R)－二羥基己酸叔丁酯的生物催化合成工藝(圖1)。

圖1 羰基還原酶不對(duì)稱還原(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯制備6-氰基-(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯Fig.1 Enzymatic conversion of t-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxy-3-oxohexanoate to t-butyl 6-cyano-(3R，5R)-dihydroxyhexanoate by ketoreductase.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑

6－氰基－(3R，5R)－二羥基己酸叔丁酯標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Toronto化學(xué)制品研究公司，(R)－6－氰基－5－羥基 －3－羰基己酸叔丁酯(質(zhì)量分?jǐn)?shù)約73.5%)由浙江新東港藥業(yè)股份有限公司饋贈(zèng)。麥芽浸粉和瓊脂為市售生化材料。其他化學(xué)試劑均為市售色譜純或分析純?cè)噭?/p>

2，4－二硝基苯肼溶液:稱取0.60 g 2，4－二硝基苯肼，溶解于15.0 mL濃H2SO4。充分溶解后，與90.0 mL 73.9%乙醇水溶液混合，加水定容至100.0 mL，即為6.0 g/L 2，4－二硝基苯肼溶液。

1.1.2 培養(yǎng)基組成

富集培養(yǎng)基:豆芽汁培養(yǎng)基(50.0 g葡萄糖，黃豆芽100.0 g煮沸30 min，過(guò)濾后加水補(bǔ)足至1.0 L，pH自然)，滅菌后加入22.8 g(R)－6－氰基－5－羥基－3－羰基己酸叔丁酯。

斜面與平板培養(yǎng)基:豆芽汁培養(yǎng)基(50.0 g葡萄糖，黃豆芽100.0 g煮沸30 min，過(guò)濾后加水補(bǔ)足至1.0 L，pH自然)，瓊脂質(zhì)量濃度為20.0 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基(1 L):麥芽浸粉30.0，葡萄糖20.0，(NH4)2HPO41.0，K2HPO4·3H202.28，NaCl 1.0，CuSO43.0 mg;pH 7.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選

土樣采集自江浙一帶的果園、食品廠及制藥廠等地。稱取 1.0 g土樣，分散到 10.0 mL、0.85%生理鹽水溶液中，充分混勻;移取1.0 mL菌懸液接種至29.0 mL含100 mmol/L(R)－6－氰基－5－羥基－3－羰基己酸叔丁酯富集培養(yǎng)基;在28℃、150 r/min條件下，搖床振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)液變渾濁;按照體積分?jǐn)?shù)3.0%接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的無(wú)菌富集培養(yǎng)基中，繼續(xù)在28℃、150 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)液渾濁。連續(xù)富集3次后對(duì)富集培養(yǎng)物逐級(jí)稀釋、涂布到固體平板上，30℃培養(yǎng)至形成明顯的單菌落。將平板上形成的單菌落通過(guò)無(wú)菌牙簽接種到無(wú)菌豆芽汁培養(yǎng)基中。30℃、150 r/min條件下培養(yǎng)2 d，收集發(fā)酵液。各取0.75 mL菌液與等體積30%(體積分?jǐn)?shù))甘油于EP管內(nèi)混合，－20℃保藏。

移取20.0 mL發(fā)酵液，12000 r/min離心，收集菌體并用生理鹽水洗滌2次。細(xì)胞分散于10.0 mL、pH 7.0磷酸緩沖液(50.0 mmol/L)中，加入0.10 g(R)－6－氰基－5－羥基－3－羰基己酸叔丁酯，充分混合后置于30℃水浴搖床，反應(yīng)24 h。轉(zhuǎn)化液12000 r/min離心5 min，上清液采用0.45 μm微濾膜過(guò)濾，濾液采用2，4－二硝基苯肼法［9］、HPLC分析，計(jì)算各株菌的羰基還原酶活性。

1.2.2 菌體生理生化及分子鑒定

利用Vetik 2 Compact自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，考察菌株對(duì)46種鑒定試驗(yàn)的鑒定結(jié)果。將菌株接種到酵母平板培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)2 d，用無(wú)菌棉簽拭轉(zhuǎn)移形態(tài)相似菌落至無(wú)菌水中，利用濁度計(jì)調(diào)節(jié)菌懸液濁度至1.8～2.2麥?zhǔn)蠁挝?。移取菌懸液至鑒定卡，培養(yǎng)18 h后置于 Vetik 2自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)分析。

分子鑒定首先提取ZJB－09225的基因組DNA。利用引物pITS1:5'－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3'和 pITS4:5'－ TCCTCCGCTTATTGATATGC －3'，在PCR儀PTC－200(Bio-Rad，USA)進(jìn)行擴(kuò)增，條件如下:95℃ 4 min;94℃ 50 s，55℃ 1 min，72℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收DNA。根據(jù)T/A克隆步驟(Takara，日本)，將得到的目的基因與pMD18－T載體連接［10］。獲得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)E.coli JM109［11］，然后接種在含有50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)，陽(yáng)性克隆標(biāo)記為E.coli JM109/pMD18－T－ZJB－09225。E.coli JM109/pMD18－T－ZJB－09225接種在含有50 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，收集菌體，采用AxyPrep質(zhì)粒DNA試劑盒提取質(zhì)粒，測(cè)序，并與GenBank中的基因序列進(jìn)行對(duì)比。18S rDNA全序列用 CLUSTAL W ver.1.81 A 軟件包排序，使用MEGA version 2.1軟件計(jì)算進(jìn)化距離，利用Neighour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 轉(zhuǎn)化條件

取1.0 g P.caribbic ZJB－09225細(xì)胞分散于10.0 mL含20.0 g/L葡萄糖酸鈉的磷酸緩沖液(pH 7.0，50 mmol/L)中，加入(R)－6－氰基 －5－羥基－3－羰基己酸叔丁酯(終質(zhì)量濃度14.0 g/L)。混勻后于30℃反應(yīng)3 h。轉(zhuǎn)化液12000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.45 μm微濾膜過(guò)濾。取澄清濾液測(cè)定生成的6－氰基－(3R，5R)－二羥基己酸叔丁酯濃度和殘余(R)－6－氰基－5－羥基－3－羰基己酸叔丁酯濃度。

1.2.4 高底物濃度下的轉(zhuǎn)化條件

取10.0 g P.caribbic ZJB－09225細(xì)胞分散于100.0 mL含20.0 g/L葡萄糖酸鈉的磷酸緩沖液(pH7.5，50 mmol/L)中，加入50 g/L(R)－6－氰基－5－羥基－3－羰基己酸叔丁酯?；靹蚝笥诖帕嚢桢亙?nèi)反應(yīng)12 h，溫度35℃，轉(zhuǎn)速300 r/min。每小時(shí)取樣 0.8 mL，加入 100.0 μL 1.0 mol/L HCl終止反應(yīng)，然后再加入100 μL 1.0 mol/L NaOH溶液中和，12000 r/min離心10 min。上清液經(jīng)0.45 μm微濾膜過(guò)濾，濾液采用HPLC檢測(cè)生成的6－氰基－(3R，5R)－二羥基己酸叔丁酯濃度和殘余的(R)－6－氰基－5－羥基－3－羰基己酸叔丁酯濃度。

1.2.5 2，4 － 二硝基苯肼顯色法

根據(jù)2，4－二硝基苯肼顯色法工作原理［9］，繪制(R)－6－氰基－5－羥基－3－羰基己酸叔丁酯工作曲線。取 20.0 μL轉(zhuǎn)化后的澄清濾液，與100.0 μL 2，4－二硝基苯肼溶液充分混合并靜置1 h，加入5.0 mL 0.8 mol/L NaOH，混勻后靜置 15 min。采用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品在450 nm下的吸光值，計(jì)算出樣品中殘余(R)－6－氰基－5－羥基－3－羰基己酸叔丁酯的濃度。

1.2.6 液相分析方法

6－氰基－(3R，5R)－二羥基己酸叔丁酯及其非對(duì)映異構(gòu)體用LC－20AD型高效液相色譜儀(島津)檢測(cè)。色譜條件:液相色譜柱選擇大連依利特Hypersil ODS2 C18 柱 (4.6 mm ×250 mm，2.5 μm)，流動(dòng)相為 V(乙腈)∶V(水)=1∶3，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃。

產(chǎn)物6－氰基－(3R，5R)－二羥基己酸叔丁酯d.e.值按式(1)計(jì)算。

式中:A(3R，5R)表示產(chǎn)物6－ 氰基 －(3R，5R)－ 二羥基己酸叔丁酯的峰面積，A(3S，5R)為6－氰基－(3S，5R)－二羥基己酸叔丁酯的峰面積。

得率Y按式(2)計(jì)算。

式中:c0表示(R)－6－氰基－5－羥基－3－羰基己酸叔丁酯的起始濃度，mol/L;V0為起始時(shí)反應(yīng)體系體積，L;cP為反應(yīng)生成 產(chǎn)物6－氰基－(3R，5R)－二羥基己酸叔丁酯的濃度，mol/L;V為反應(yīng)后反應(yīng)體系體積，L。

2 結(jié)果與討論

2.1 篩選結(jié)果

采用顯色法進(jìn)行R－羰基還原酶菌株篩選，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知:篩選獲得的多株菌株中，菌株ZJB－09225作用于(R)－6－氰基－5－羥基－3－羰基己酸叔丁酯的羰基還原酶活力最好，24 h轉(zhuǎn)化后殘余(R)－6－氰基－5－羥基－3－羰基己酸叔丁酯較少。通過(guò)HPLC分析檢測(cè)，ZJB－09225菌株還原生成的6－氰基－(3R，5R)－二羥基己酸叔丁酯的量最高且立體選擇性較好，產(chǎn)物構(gòu)型符合反Prelog法則。

圖2 顯色法篩選非對(duì)映選擇性還原(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯活性菌株示意Fig.2 Screening strains with diastereoselective ketoreductase activity towards t-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-oxohexanoate using colorimetric reaction

2.2 菌種鑒定結(jié)果

菌株ZJB－09225細(xì)胞呈卵圓狀，細(xì)胞大小1.5 μm×2.5 μm。在豆芽汁平板上培養(yǎng)2 d，形成圓形、乳白色、不透明、中間凸起、表面光滑的菌落，直徑約3 mm(圖3)。

圖3 菌落ZJB-09225在豆芽汁平板上的菌落形態(tài)Fig.3 Morphological characteristics of strain ZJB-09225

ZJB－09225生理生化鑒定結(jié)果示于表1。菌株ZJB－09225對(duì)其中的33種鑒定指標(biāo)顯示陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)其他13種鑒定指標(biāo)顯示陰性反應(yīng)(表1)?；赩etik 2 Compact自動(dòng)鑒定系統(tǒng)分析結(jié)果，菌株ZJB－09225與Pichia caribbic A標(biāo)準(zhǔn)菌株相似，相似性指數(shù)為0.980。

表1 利用Vitek 2 Compact微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)分析菌種ZJB-09225碳/氮源利用結(jié)果Table 1 Utilization of carbon and nitrogen sources by strain ZJB-09225 detected with Vitek 2 Compact system

提取菌株ZJB－09225的18S rDNA測(cè)序。從GenBank中挑選與ZJB－0922518S rDNA序列相似的序列，采用MegAlign軟件(DNAStar公司，美國(guó))繪制進(jìn)化樹(shù)(圖4)。將獲得的序列與GenBank中保存的數(shù)據(jù)進(jìn)行相似性分析發(fā)現(xiàn)，菌株ZJB－09225與Pichia caribbic(FN.428931.1)同源性最高 (100%，607 bps，18S rDNA)。因此，本實(shí)驗(yàn)鑒定的微生物屬于Pichia屬的caribbic種。結(jié)合生理生化與18S rDNA分子鑒定，菌株ZJB－09225被鑒定屬于Pichia caribbic，已遞交CCTCC保藏，保藏號(hào)CCTCC M 2012411。

圖4 菌株ZJB-09225系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic dendrogram for strain ZJB-09225 and related strains based on 18S rDNA sequence

2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)P.caribbic ZJB－09225細(xì)胞羰基還原酶活性的影響

將P.caribbic ZJB－09225接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，每隔4 h取樣分析發(fā)酵液羰基還原酶活性，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知:培養(yǎng)時(shí)間顯著影響 P.caribbic ZJB－09225羰基還原酶體積酶活和生物量，培養(yǎng)32 h后，P.caribbic ZJB－09225發(fā)酵液體積酶活達(dá)到峰值，約7.2 U/L，生物量為8.8 g/L。

圖5 P.caribbic ZJB-09225發(fā)酵進(jìn)程曲線Fig.5 Profiles of biomass density，volumetric activity during P.caribbic ZJB-09225 culture

2.4 溫度和pH對(duì)P.caribbic ZJB－09225細(xì)胞羰基還原酶活性的影響

溫度、pH對(duì)P.caribbic ZJB－09225細(xì)胞羰基還原酶活性的影響見(jiàn)圖6。由圖6(a)可知，在轉(zhuǎn)化pH7.0、轉(zhuǎn)化溫度 28 ～37 ℃范圍內(nèi)，P.caribbic ZJB－09225細(xì)胞表現(xiàn)出較好的差向選擇性，產(chǎn)物d.e.值在95%左右;35℃時(shí)P.caribbic ZJB－09225細(xì)胞羰基還原酶活力達(dá)到最高，溫度超過(guò)37℃時(shí)，細(xì)胞活性急劇下降。由圖6(b)可知:在35℃、pH 6.0～8.0范圍內(nèi)，P.caribbic ZJB－09225細(xì)胞羰基還原酶具有較高的活性和立體選擇性，在pH 7.5磷酸緩沖液中P.caribbic ZJB－09225細(xì)胞羰基還原酶活力最高 (圖6(b))。因此，P.caribbic ZJB－09225細(xì)胞的最適作用溫度為35℃，最適作用pH為7.5。

圖6 轉(zhuǎn)化溫度和pH對(duì)P.caribbic ZJB-09225細(xì)胞羰基還原酶活性的影響Fig.6 Temperature and pH dependence of P.caribbic ZJB-09225 ketoreductase

2.5 P.caribbic ZJB－09225立體選擇性還原高濃度6－氰基－(3R，5R)－二羥基己酸叔丁酯

P.caribbic ZJB－09225立體選擇性還原 50.0 g/L(R)－6－氰基－5－羥基－3－羰基己酸叔丁酯的進(jìn)程曲線見(jiàn)圖7。由圖7可知:轉(zhuǎn)化3 h，產(chǎn)物6－氰基 －(3R，5R)－二羥基己酸叔丁酯得率為3.4%，產(chǎn)物d.e.值99.5%以上，幾乎檢測(cè)不到反式6－氰基－(3，5)－二羥基己酸叔丁酯形成。轉(zhuǎn)化12 h后，產(chǎn)物6－氰基－(3R，5R)－二羥基己酸叔丁酯得率達(dá)19.4%，產(chǎn)物d.e.值94.3%，提高(R)－6－氰基－5－羥基－3－羰基己酸叔丁酯轉(zhuǎn)化率導(dǎo)致6－氰基－(3R，5R)－二羥基己酸叔丁酯d.e.值降低。

圖7 P.caribbic ZJB-09225還原生成6-氰基-(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯的反應(yīng)進(jìn)程曲線Fig.7 Time course of 6-cyano-(3R，5R)-dihydroxylhexanoate formation catalyzed by P.caribbic ZJB-09225

3 結(jié)論

從土壤中篩選得到具有不對(duì)稱還原6－氰基－(3R，5R)－二羥基己酸叔丁酯的羰基還原酶菌株ZJB－09225。經(jīng)過(guò)生理生化和分子遺傳學(xué)鑒定，確定該菌株屬于Pichia caribbic。P.caribbic ZJB－09225發(fā)酵32 h后羰基還原酶活性達(dá)到最高值，體積酶活約7.2 U/L，P.caribbic ZJB －09225 生物量密度 8.8 g/L。P.caribbic ZJB－09225對(duì)(R)－6－氰基－5－羥基－3－羰基己酸叔丁酯的最佳作用條件為35℃、pH 7.5;在轉(zhuǎn)化率3.4%以內(nèi)，產(chǎn)物d.e.值99.5%以上。利用P.caribbic ZJB－09225細(xì)胞成功建立了光學(xué)純6－氰基－(3R，5R)－二羥基己酸叔丁酯的生物催化合成工藝，豐富了他汀藥物關(guān)鍵手性側(cè)鏈的合成技術(shù)。首次報(bào)道了P.caribbic不對(duì)稱還原(R)－6－氰基－5－羥基－3－羰基己酸叔丁酯制備6－氰基－(3R，5R)－二羥基己酸叔丁酯，后續(xù)P.caribbic ZJB－09225羰基還原酶純化、基因克隆具有重要的研究?jī)r(jià)值。

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