清熱八味丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

劉學(xué)良，韓達(dá)斌，陳 鵬，年永琪，汪永明，王永晶，劉海青

（青海省藥品審評(píng)核查中心，青海 西寧 810007）

蒙藥清熱八味丸由石膏、人工牛黃、胡黃連、紅花等8 味藥材制成，有清熱解毒功效，主要用于熾熱、血熱、臟腑之熱、肺熱咳嗽、痰中帶血、肝火肋痛的治療。始載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊(cè)》［1］，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)《國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)》中，檢驗(yàn)項(xiàng)目有顯微鑒別、理化鑒別及膽酸的含量測(cè)定。為了更全面控制該制劑質(zhì)量，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對(duì)方中人工牛黃、紅花進(jìn)行定性鑒別，同時(shí)采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)方中胡黃連的有效成分胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ進(jìn)行含量測(cè)定?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 1525型高效液相色譜儀，包含Waters 2489型紫外檢測(cè)器、Empower 化學(xué)工作站（美國(guó)Waters 公司）；AB204-S型、ME204E型、XS105DU型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Lambda 35 型紫外 - 可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)PE 公司）；硅膠H，G 薄層板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 試藥

清熱八味丸（內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司，批號(hào)分別為 090424，090614，100217，100526，101022，101212，111214）；胡黃連苷Ⅰ對(duì)照品（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，批號(hào)為MUST - 11062102，含量98%）；胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ?hào)為111596 - 201805，含量93.2%），膽酸對(duì)照品（批號(hào)為110775-201105，含量98.9%），豬去氧膽酸對(duì)照品（批號(hào)為110749-201316，含量99.7%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、磷酸、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 人工牛黃［2-5］

取樣品適量，研細(xì)，稱取粉末0.5 g，精密稱定，加乙醇10 mL，振搖15 min，離心，取上清液，作為供試品溶液。取豬去氧膽酸對(duì)照品、膽酸對(duì)照品各適量，分別加乙醇制成每1 mL 含2 種成分1 mg 的單一對(duì)照品溶液。按清熱八味丸處方和工藝制備缺人工牛黃的陰性樣品，并按供試品溶液方法制成陰性對(duì)照品溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則 0502 TLC 法，精密吸取上述溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯 - 正己烷 - 甲醇 - 冰醋酸（8∶1.5∶0.25∶0.25，V/V/V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1。

圖1 人工牛黃薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of Bovis Calculus Artifatus

2.1.2 紅花［6-10］

取樣品適量，研細(xì)，稱取粉末4 g，精密稱定，加80%丙酮溶液 20 mL，振搖 15 min，靜置 10 min 后，取上清液，作為供試品溶液。另取紅花對(duì)照藥材0.5 g，同供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。按清熱八味丸處方和工藝制備缺紅花的陰性樣品，并按供試品溶液方法制成陰性對(duì)照品溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC 法，精密吸取上述溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯-水-甲酸-甲醇（7∶3∶2∶0.4，V/V/V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置日光燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色主斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖2。

圖2 紅花薄層色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of Carthami Flos

2.2 胡黃連苷含量測(cè)定［11-17］

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil - ODS 柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.15%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～7 min 時(shí) 22%A→17%A，7～14 min 時(shí) 17%A，14～15 min 時(shí) 17%A→19%A，15～30 min 時(shí) 19%A→20%A，30～45 min時(shí)20%A→22%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：266 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2.2 溶液制備

取胡黃連苷Ⅰ對(duì)照品10.86 mg、胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌?1.70 mg，精密稱定，分別置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解、定容，搖勻，即得胡黃連苷Ⅰ，Ⅱ質(zhì)量濃度分別為0.212 9，0.218 0 mg/ mL 的單一對(duì)照品溶液。各取4 mL，置20 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得胡黃連苷Ⅰ，Ⅱ質(zhì)量濃度分別為0.0425 8，0.0436 0 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。取樣品（批號(hào)100217）適量，研細(xì)，取1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按清熱八味丸處方工藝制備缺胡黃連的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取2.2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果待測(cè)成分與樣品中其他成分分離良好，理論板數(shù)按胡黃連苷Ⅱ峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，陰性對(duì)照品溶液在與對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處無(wú)干擾峰，表明專屬性良好。詳見(jiàn)圖3。

圖3 高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1，2，4，8，12，20 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，胡黃連苷Ⅰ為Y1= 1 738 693X1+ 9 175（r= 0.999 8），胡黃連苷Ⅱ?yàn)閅2=1 286 879X2+1 344（r=0.999 7）。結(jié)果表明，胡黃連苷Ⅰ和Ⅱ進(jìn)樣量分別在0.042 58～0.851 6μg和0.043 60～0.872 0 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果胡黃連苷Ⅰ和Ⅱ峰面積的RSD分別為0.65%和0.52%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液10μL，室溫下按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件分別于第0，3，6，12，18，24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果胡黃連苷Ⅰ和Ⅱ峰面積的RSD分別為1.22%和1.06%（n= 6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)100217）適量，精密稱定，共5 份，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果胡黃連苷Ⅰ和Ⅱ的平均含量分別為1.049 0 mg/g和1.722 4 mg/g，RSD分別為1.12%和0.86%（n=5），表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取樣品（批號(hào)100217）適量，研細(xì)，精密稱定，共6 份，分別精密加入2.2.2 項(xiàng)下胡黃連苷Ⅰ和Ⅱ單一對(duì)照品溶液，各適量，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取7 批樣品各適量，分別按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.2 Results of content determination of picroside Ⅰand picroside Ⅱ in samples（n=3）

3 討論

清熱八味丸方中，人工牛黃可清熱解毒、化痰定驚［18］，紅花可活血通經(jīng)、散瘀止痛［19］，胡黃連可清熱燥濕、瀉火解毒、通經(jīng)利尿，且胡黃連中胡黃連苷Ⅰ和Ⅱ是其主要活性成分，具有較好的清熱、殺菌及利尿作用［20］，與清熱八味丸清熱解毒功效一致。本研究中基于預(yù)試驗(yàn)中對(duì)提取溶劑、提取方法、提取時(shí)間等因素進(jìn)行的考察，建立了清熱八味丸方中人工牛黃、紅花的TLC鑒別方法，胡黃連中胡黃連苷Ⅰ和Ⅱ的HPLC 定量檢測(cè)方法，可為今后研究清熱八味丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

含量測(cè)定預(yù)試驗(yàn)中，參考相關(guān)文獻(xiàn)，同時(shí)結(jié)合胡黃連苷Ⅰ和Ⅱ?qū)φ掌啡芤旱淖贤夤庾V掃描結(jié)果，選擇紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為266 nm。同時(shí)分別對(duì)甲醇- 0.10%冰醋酸溶液、甲醇-0.15%磷酸溶液、乙腈-0.15%磷酸溶液3種流動(dòng)相進(jìn)行考察，結(jié)果以乙腈-0.15%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)基線較平穩(wěn)，對(duì)待測(cè)組分峰無(wú)干擾，故選擇。

清熱八味丸方中八味藥材處方量相同，均為藥材原粉入藥制成水丸，胡黃連占處方總量的12.5%，2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》中規(guī)定，胡黃連中胡黃連苷Ⅰ與胡黃連苷Ⅱ的總量不得少于9.0%［21］，原粉入藥轉(zhuǎn)移率按90%計(jì)算，得樣品中兩者總量的理論值下限為10.125 0 mg/ g，而本研究中7 批樣品的含量為2.718 2～3.842 2 mg/g，明顯低于理論值下限。分析原因，清熱八味丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)胡黃連進(jìn)行控制，企業(yè)在生產(chǎn)過(guò)程中可能存在以次充好或投料不足的情況。

清熱八味丸與清熱八味散、清熱八味膠囊均收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊(cè)》，藥味相同，處方量略有差異，但清熱八味系列3種制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制項(xiàng)目差異較大，部分項(xiàng)目制定的控制指標(biāo)不盡合理。2020 年版《中國(guó)藥典》中對(duì)胡黃連苷Ⅰ和Ⅱ的含量進(jìn)行控制，然而，清熱八味膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅以肉桂酸的含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)，不合理，也缺少代表性。后續(xù)制訂的控制指標(biāo)要考慮與其功能主治緊密結(jié)合，可考慮同時(shí)對(duì)3 種劑型的清熱八味制劑進(jìn)行研究，盡量建立較統(tǒng)一、完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。