丹白顆粒對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位癥血管生成及應(yīng)激水平的影響

姜艷玲，王金華*，李發(fā)余，徐善榮，郭海龍

（1.中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，福建 福州 350005；3.日照市人民醫(yī)院婦科，山東 日照 276826）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis, EMT）是育齡婦女的常見(jiàn)病，發(fā)病率高達(dá)10%～15%，經(jīng)期子宮內(nèi)膜碎片隨經(jīng)血逆流，通過(guò)輸卵管種植于卵巢和鄰近的盆腔腹膜，隨后在種植處繼續(xù)生長(zhǎng)和蔓延，異位病灶組織的生長(zhǎng)均有侵襲、局部播散、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)等諸多方面的特征，最終EMT 形成[1-2]。 據(jù)研究，EMT是否發(fā)病與激素水平密切相關(guān)[3]；另有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激反應(yīng)及異位內(nèi)膜病灶血管生成在EMT 的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，EMT 患者血清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）水平明顯升高，血管生成是EMT 種植生長(zhǎng)維持的必要條件，VEGF 水平越高則表明促血管生成作用越強(qiáng)[4]。 異位內(nèi)膜組織病灶處的血管異常增生及炎性反應(yīng)是EMT 的主要致病基礎(chǔ)，抑制血管生成對(duì)EMT 的治療至關(guān)重要[5]。目前，EMT 主要依靠手術(shù)或藥物進(jìn)行治療，而中醫(yī)學(xué)在該病的治療方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。 大量研究表明，中醫(yī)藥的有效干預(yù)能夠顯著抑制異位病灶的生長(zhǎng)，并能有效改善患者臨床癥狀[6]。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討丹白顆粒對(duì)EMT 大鼠異位內(nèi)膜組織中血管生成和應(yīng)激反應(yīng)的影響[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取48 只SD 大鼠雌性，性成熟，無(wú)交配記錄，體質(zhì)量200～240 g，購(gòu)自北京華阜康有限公司動(dòng)物研究中心，8～9 周齡，許可證號(hào)為SYXK（京）2021-0015，使用許可證號(hào)：SYXK（魯）2018-008，倫理批準(zhǔn)編號(hào)：NH-IACUC-2021-022，所有大鼠均飼養(yǎng)在中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房中，溫度25 ℃，相對(duì)濕度50%，保持環(huán)境安靜、干凈、透氣，12 h/12 h 間斷光照，自由飲食、飲水，定期更換墊料，清潔、消毒鼠籠。

1.1.2 主要儀器與試劑 離心機(jī)（H2050R，湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；石蠟切片機(jī)（TYJ10，紹興譜爾儀器設(shè)備有限公司）；顯微鏡（E100，尼康公司）；酶標(biāo)儀（SHE-3000，北京賽爾福公司）。 孕三烯酮膠囊（國(guó)藥準(zhǔn)字H19980020，2.5 mg/粒，華潤(rùn)紫竹藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)00321081）；丹白顆粒（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20090651，8 g/袋，山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)2111222）；VEGF 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京興康生物科技有限公司；測(cè)定促卵泡生成素（follicle stimulating hormone, FSH，批號(hào)：140625-201411）、促黃體生成素（luteinizing hormone, LH，批號(hào)：120903-201510）、孕酮（proges-terone, P，批號(hào)：111826-201806）試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD，批號(hào)：111854-201905）、丙二醛（malondialdehyde,MDA，批號(hào)：121038-201405）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase, GSHPx，批號(hào)：100533-201805）檢測(cè)試劑盒由北京生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 按SPF 級(jí)動(dòng)物要求飼養(yǎng)，采用戊酸雌二醇灌胃使大鼠處于統(tǒng)一動(dòng)情期，選擇動(dòng)情周期4～5 d、有連續(xù)2 個(gè)正常動(dòng)情周期的大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周開(kāi)始造模。 稱(chēng)量大鼠體質(zhì)量，腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉溶液（劑量為45 mg/kg）進(jìn)行麻醉，給藥劑量為0.3 mL/kg，將大鼠仰臥位固定至鼠板，剪開(kāi)腹壁，剪取部分子宮內(nèi)膜組織，用縫合針把內(nèi)膜縫合于腹壁上，關(guān)腹縫合。術(shù)后連續(xù)3 d 給予青霉素鈉腹腔注射預(yù)防感染，術(shù)后10 d 開(kāi)始進(jìn)行戊酸雌二醇（0.2 mg/只）灌胃，連續(xù)5 d。 手術(shù)后4 周，選擇動(dòng)情期大鼠再次麻醉，開(kāi)腹觀(guān)察，異位病灶體積增大，有血管增生或水腫病變，呈小囊狀或透明結(jié)節(jié)狀，內(nèi)含清亮液體，表面有血管形成和結(jié)締組織覆蓋，可以認(rèn)定為造模成功[8]。

1.2.2 分組與給藥 取造模成功大鼠40 只，隨機(jī)編號(hào)并染色標(biāo)記，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、陽(yáng)性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組8 只。 另取8 只大鼠僅開(kāi)腹剪開(kāi)子宮后縫合，設(shè)為假手術(shù)組。造模成功后，陽(yáng)性藥組：孕三烯酮膠囊灌胃給藥，取膠囊內(nèi)容物與適量的蒸餾水混合研磨溶化，每次按0.5 mg/kg 灌胃，每周2 次；低劑量組、中劑量組、高劑量組：丹白顆粒灌胃給藥，給藥方法參照說(shuō)明書(shū)中人用劑量進(jìn)行大鼠實(shí)驗(yàn)劑量換算，低劑量組為70 mg/kg，中劑量組為135 mg/kg，高劑量組為200 mg/kg，用蒸餾水配制成指定濃度的丹白顆粒溶液，劑量為0.5 mL/只，每天給藥3 次，連續(xù)給藥2 周；假手術(shù)組和模型組給予等體積的蒸餾水，灌胃治療過(guò)程中，觀(guān)察大鼠生理狀態(tài)、精神狀態(tài)等情況；末次給藥后每組大鼠均給予2 U 縮宮素，觀(guān)察大鼠痛經(jīng)狀況，隨后常規(guī)麻醉頸椎脫臼處死大鼠，剖取異位子宮內(nèi)膜組織，部分使用組織固定液固定以制備病理切片，剩余組織于低溫冰箱（-80 ℃）凍存。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定 （1）標(biāo)本采集及測(cè)量：末次給藥24 h 后，吸入乙醚麻醉大鼠后處死，開(kāi)腹觀(guān)察各組大鼠異位子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)情況，測(cè)量在位內(nèi)膜厚度，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量異位組織體積大小并稱(chēng)重，保存?zhèn)溆?；腹主?dòng)脈取血約5 mL，靜置后離心（3 000 r/min，15 min，r=10 cm），收集上清液，低溫（-80 ℃）保存?zhèn)溆茫唤馄嗜〕鲎訉m，剝離假手術(shù)組正常子宮內(nèi)膜組織和其余組異位子宮內(nèi)膜組織，漂洗后分成兩部分，一部分用10%甲醛固定，HE 染色，切片，通過(guò)顯微鏡進(jìn)行病理組織學(xué)檢查；剩余部分各剪取約0.5 g凍存在液氮中備用。

（2）血管生成相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immuno sorbent assay, ELISA）檢測(cè)大鼠血清中VEGF 含量， 取血清置于冰水浴中解凍，采用ELISA 法檢測(cè)其中VEGF 水平，具體操作參照各自說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行。

（3）大鼠異位子宮內(nèi)膜組織微血管密度（microvessel density, MVD）檢測(cè)：找出各組子宮異位內(nèi)膜組織中微血管最密集的部位進(jìn)行觀(guān)察并記錄，結(jié)果以3 個(gè)200 倍視野下血管數(shù)目的平均數(shù)來(lái)表示，在內(nèi)膜組織中與鄰近微血管、腺體組織分界清楚的任何一個(gè)染成棕色的細(xì)胞或細(xì)胞叢均被認(rèn)為是1 個(gè)新生血管[8]。

（4）相關(guān)因子水平檢測(cè)：采用ELISA 法測(cè)定異位子宮內(nèi)膜組織相關(guān)因子水平含量，取部分異位子宮內(nèi)膜組織于離心管中，加入0.9%氯化鈉溶液0.9 mL制備組織勻漿液，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒的操作說(shuō)明測(cè)定各組異位子宮內(nèi)膜組織中FSH、LH 水平。 采用放射免疫法檢測(cè)E2、P 含量。

（5）氧化應(yīng)激指標(biāo)水平檢測(cè)：取部分異位子宮內(nèi)膜組織，低溫研磨制備組織勻漿，嚴(yán)格按照各試劑盒的說(shuō)明書(shū)測(cè)定異位子宮內(nèi)膜組織中的SOD、MDA、GSH-Px 水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用EXCEL 與SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用以“±s”表示，進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，多組獨(dú)立、正態(tài)、方差齊資料組間比較采用單方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜組織比較

假手術(shù)組無(wú)異位組織生長(zhǎng)，模型組、陽(yáng)性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組均有異位組織生長(zhǎng)。與模型組相比，陽(yáng)性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠的異位組織體積、異位組織重量、在位內(nèi)膜厚度降低（P＜0.05）；與陽(yáng)性藥組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠的異位組織體積、異位組織重量、在位內(nèi)膜厚度升高（P＜0.05）。 詳見(jiàn)表1。

表1 子宮內(nèi)膜組織檢測(cè)結(jié)果（n=8）

2.2 內(nèi)膜組織病理觀(guān)察

假手術(shù)組大鼠內(nèi)膜組織上皮細(xì)胞排列整齊，界限清晰，間質(zhì)細(xì)胞排列均勻；模型組大鼠異位病灶較厚，內(nèi)膜組織上皮細(xì)胞呈矮柱狀，腺體形態(tài)改變明顯，細(xì)胞間質(zhì)增多，細(xì)胞間隙變小，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、大量腺體、組織增生；陽(yáng)性藥組與丹白顆粒不同劑量組大鼠異位內(nèi)膜均受到不同程度的抑制，大鼠異位病灶明顯變薄，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、組織增生及血液供應(yīng)不同程度減少。 詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組內(nèi)膜組織病理觀(guān)察

2.3 血管生成相關(guān)指標(biāo)比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠VEGF、MVD 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠的VEGF、MVD 水平降低（P＜0.05），其中高劑量組與陽(yáng)性藥組大鼠VEGF、MVD 水平趨近于假手術(shù)組。 詳見(jiàn)表2、圖2。

圖2 各組內(nèi)膜組織MVD（×100）

表2 各組異位子宮內(nèi)膜組織VEGF、MVD 表達(dá)水平（n=8）

2.4 相關(guān)因子水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠FSH、LH、E2 表達(dá)水平升高，P 表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠FSH、LH、E2 表達(dá)水平較低，P 表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與陽(yáng)性藥組比較，模型組與低中劑量組的FSH、LH、E2 表達(dá)水平高，同時(shí)P 表達(dá)水平低（P＜0.05），高劑量組的FSH、LH、E2 表達(dá)水平與陽(yáng)性藥組接近，P高于陽(yáng)性藥組（P＜0.05）。 詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織相關(guān)因子水平檢測(cè)結(jié)果比較（n=8）

2.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠SOD、GSH-Px 表達(dá)水平降低，MDA 表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠SOD、GSH-Px 表達(dá)水平升高，MDA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與陽(yáng)性藥組比較，模型組與低劑量組的SOD、GSH-Px 表達(dá)水平低，同時(shí)MDA 表達(dá)水平高（P＜0.05），中高劑量組的SOD、MDA 表達(dá)水平與陽(yáng)性藥組接近，中劑量組的GSH-Px 低于陽(yáng)性藥組，高劑量組的GSH-Px 高于陽(yáng)性藥組（P＜0.05）。 詳見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織SOD、MDA、GSH-Px 表達(dá)水平比較（n=8）

3 討論

EMT 是具有生長(zhǎng)功能的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在宮腔被覆黏膜以外其他部位的雌激素依賴(lài)性疾病，在育齡婦女中發(fā)病率約為10%，嚴(yán)重影響女性的生殖健康和生活質(zhì)量[8]。 子宮內(nèi)膜受多種內(nèi)分泌激素調(diào)節(jié)，激素分泌失衡參與子宮內(nèi)膜癥的發(fā)生和發(fā)展，異位子宮內(nèi)膜的異位過(guò)程可概括為：黏附→侵襲→血管形成，血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行侵襲過(guò)程中，可以通過(guò)釋放細(xì)胞因子、蛋白水解酶等物質(zhì)，增加內(nèi)膜細(xì)胞在異位組織上的侵襲能力，促進(jìn)異位內(nèi)皮細(xì)胞在異位組織的增殖生長(zhǎng)[9]。 EMT 患者存在免疫缺陷、侵襲、血管生成等內(nèi)膜微環(huán)境改變，而各種信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)控體內(nèi)酶及細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而影響異位內(nèi)膜的黏附、侵襲、血管生成及凋亡，參與EMT 的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[10-11]。

現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為，“陽(yáng)虛寒凝，沖任、胞宮氣血不暢，瘀血內(nèi)阻”可導(dǎo)致瘀血阻滯，臨床治療以活血化瘀散結(jié)為主，女子易胞宮虛寒，氣血不暢，經(jīng)血瘀滯，以溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血和營(yíng)、化瘀止痛為治法[12-13]。 丹白顆粒由牡丹皮、大血藤、紫花地丁、三棱、莪術(shù)、敗醬草、白英、白花蛇舌草、川芎、白芍、土茯苓、墓頭回、椿皮、當(dāng)歸14 味中藥組成，具有清熱化瘀、祛濕止痛的功效；本方以中醫(yī)臨床辨證論治為核心，牡丹皮清熱涼血、活血散瘀，大血藤敗毒消癰、活血通絡(luò)、祛風(fēng)殺蟲(chóng)，紫花地丁清熱解毒、涼血消腫，三藥合用，共奏清熱化瘀、祛濕止痛之效，共為君藥；三棱苦降辛開(kāi)，平而不烈，性非猛而建功甚速，配莪術(shù)行氣破血、消積止痛，且兩者均入肝、脾經(jīng)，可消肝郁之積、理脾虛之滯，敗醬草乃手足陽(yáng)明厥陰藥也，善排膿破血，川芎辛溫，走而不守，行氣開(kāi)郁，活血止痛，可“上行頭目，下行血?！?，4 味中藥行滯活血、化瘀止痛，為臣藥共滌瘀滯以通脈止痛；白英、白花蛇舌草、川芎、白芍、土茯苓、墓頭回、椿皮合用以清熱解毒利濕、固澀止帶，為佐藥；當(dāng)歸味甘辛，溫而不燥，行而不猛，甘緩調(diào)和，能引諸藥入沖任，調(diào)經(jīng)血，用之為使；本方君臣佐使俱全，組方合理，用藥精當(dāng)，共奏活血化瘀、祛濕止痛之功。

上述研究中，丹白顆粒可以抑制子宮異位內(nèi)膜組織的生長(zhǎng)，降低異位子宮內(nèi)膜的體積和重量，并通過(guò)抑制VEGF 蛋白的表達(dá)，抑制新生血管生成，降低異位子宮內(nèi)膜組織的MDV；對(duì)EMT 大鼠高水平的FSH 和LH 均有抑制作用，降低血清E2 水平，升高P 水平，降低外周血中激素水平，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)的紊亂，高劑量組使其趨于正常水平；調(diào)節(jié)機(jī)體免疫失調(diào)和氧化還原失衡，抑制EMT 大鼠血清中MDA 等應(yīng)激因子的積累，使其趨于正常水平。上述研究從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的角度證實(shí)丹白顆?？梢越档痛笫笱逖趸瘧?yīng)激水平，表明丹白顆粒可能是通過(guò)某種炎性通路影響EM 的發(fā)展，但仍未闡明其具體的機(jī)制，在下一步的研究中，我們擬探明丹白顆粒治療EMT 的具體信號(hào)通路機(jī)制，為其在EMT 中的臨床應(yīng)用提供理論支持。 綜上所述，不同劑量丹白顆粒對(duì)EMT 具有不同程度的改善作用，其機(jī)制主要通過(guò)調(diào)節(jié)激素的分泌和抑制過(guò)氧化物的積累發(fā)揮作用，丹白顆粒具有抗炎和抗氧化作用，通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)起到抑制異位內(nèi)膜黏附、血管生成的作用，從而緩解EMT 病情的發(fā)展。