基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)探討桔梗元參湯治療過敏性鼻炎的作用機(jī)制

申林強(qiáng)，章淑薇，鄧鑫杰，靳陳麗蕓，劉欣汝，劉碧源*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208）

過敏性鼻炎（allergic rhinitis, AR）又稱變應(yīng)性鼻炎，全世界約有6 億人患病且呈流行增加的趨勢(shì)，歐美國家AR 的患病率為10%～40%[1]。我國近20 年成人和兒童AR 的流行都呈上升趨勢(shì)，有研究報(bào)道，成人AR 的患病率為17.6%[2]。 AR 主要由IgE 介導(dǎo)的一種速發(fā)型超敏反應(yīng)性疾病，臨床表現(xiàn)為鼻塞、鼻癢、打噴嚏和流鼻涕等，其病因尚不完全清楚[3]。 目前，AR 的治療方式以抗過敏藥緩解癥狀為主，不能徹底治愈，復(fù)發(fā)率較高[4]。

中醫(yī)藥具有安全、毒副作用小和復(fù)發(fā)率低等優(yōu)點(diǎn)，從而被廣泛用于AR 的治療[5]。 AR 在中醫(yī)學(xué)歸為“鼻鼽”范疇，臨床以肺氣虛寒證多見。 張仲景對(duì)本病有“清出”和“善嚏”的描述，認(rèn)為寒邪收引、肺氣不宣、津液不布則清出，陰陽互引、正邪相爭則善嚏[6]。 桔梗元參湯出自清朝名醫(yī)黃元御的《四圣心源》，全方由桔梗、元參、法半夏、茯苓、苦杏仁、陳皮、生姜和甘草8 味藥組成，通過調(diào)理脾胃氣機(jī)升降，使胃氣降濁，脾氣升清，補(bǔ)足正氣，從而祛除外邪達(dá)到治療AR 的目的[7]。其中，桔梗可開肺氣、解毒排膿，元參潤燥解毒，苦杏仁、橘皮清理肺氣、化痰降逆，半夏和胃降逆，茯苓助升脾氣去除水濕，甘草補(bǔ)脾胃，生姜散寒。臨床應(yīng)用桔梗元參湯治療AR 可獲得良好的治療效果[8-10]，高健美等[11]對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)桔梗元參湯能降低AR 小鼠鼻黏膜中p38 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,p38MAPK）、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）和黏膜黏蛋白5AC（mucin 5AC, MUC5AC）的表達(dá)，通過調(diào)控p38MAPK/COX-2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而發(fā)揮作用。 但是尚未見桔梗元參湯治療AR 的作用靶點(diǎn)及分子機(jī)制研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過計(jì)算機(jī)軟件和生物數(shù)據(jù)庫，分析疾病的相關(guān)基因與藥物靶點(diǎn)之間的生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，特別適用于中藥及復(fù)方作用機(jī)制的研究[12]。由于桔梗元參湯組成成分復(fù)雜，治療AR 的機(jī)制還未完全了解清楚。因此，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究桔梗元參湯的活性成分以及疾病的相關(guān)靶點(diǎn)，構(gòu)建桔梗元參湯活性成分-靶點(diǎn)-AR 網(wǎng)絡(luò)，探究桔梗元參湯治療AR 的作用機(jī)制，為桔梗元參湯的臨床應(yīng)用及機(jī)制研究提供一定分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 桔梗元參湯活性成分的檢索

通過TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫分別以桔梗、元參、苦杏仁、陳皮、法半夏、茯苓、甘草和生姜為關(guān)鍵詞檢索桔梗元參湯的活性成分。參考藥代動(dòng)力學(xué)ADME 參數(shù)，以口服生物利用度口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%、化合物類藥性(drug likeness, DL)≥0.18 為條件進(jìn)行藥物活性成分的篩選[13]。

1.2 桔梗元參湯活性成分靶點(diǎn)和AR 靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

通過PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫檢索到的活性成分2D 和3D 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入pharmMapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)。 通過OMIM（https://omim.org/）、NCBI Gene（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫獲取AR 相關(guān)靶點(diǎn)。將桔梗元參湯活性成分靶點(diǎn)與AR 疾病靶點(diǎn)相互映射，獲得桔梗元參湯活性成分靶點(diǎn)-AR 疾病靶點(diǎn)。

1.3 桔梗元參湯靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將桔梗元參湯活性成分靶點(diǎn)-AR 疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（https://STRING-db.org），得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network, PPI）。 將該蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1軟件，采用Network analyzer 計(jì)算Degree 值，獲得桔梗元參湯治療AR 的關(guān)鍵靶點(diǎn)，構(gòu)建桔梗元參湯-成分-靶點(diǎn)-AR 網(wǎng)絡(luò)模型。通過Network Analyzer 軟件對(duì)構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行深度分析。

1.4 桔梗元參湯治療AR 功能和通路富集分析

將PPI 中的靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/），對(duì)桔梗元參湯治療AR 的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集和KEGG 通路富集分析，明確桔梗元參湯治療AR的相關(guān)活性成分與靶點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生反應(yīng)的位置、涉及的分子功能和生物學(xué)過程。

1.5 分子對(duì)接

通過PubChem 數(shù)據(jù)庫下載化合物3D 結(jié)構(gòu)SDF格式，并利用PDB（https://www.rcsb.org/）篩選并下載分辨率小于2.5A 的靶點(diǎn)的結(jié)晶復(fù)合式，采用Autodock Vina 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，刪除靶點(diǎn)內(nèi)水分子，添加氫原子，抽取蛋白原配體，生成對(duì)接空腔。 運(yùn)用PyMol 2.4.0對(duì)分子對(duì)接的結(jié)果進(jìn)行可視化處理，通過觀察對(duì)接親和力得分來反映分子間結(jié)合的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 桔梗元參湯活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索桔梗元參湯中的所有成分。獲取桔梗元參湯含活性成分155 個(gè)，其中桔梗7 個(gè)、元參9 個(gè)、苦杏仁19 個(gè)、橘皮5 個(gè)、半夏13個(gè)、茯苓15 個(gè)、甘草92 個(gè)、生姜5 個(gè)，有11 個(gè)為共有活性成分。 根據(jù)桔梗元參湯活性成分進(jìn)行作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，刪除冗雜和無靶點(diǎn)活性成分，篩選出98 個(gè)活性成分，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)239 個(gè)。桔梗元參湯的主要活性成分見表1。

表1 桔梗元參湯治療AR 的主要活性成分

2.2 AR 相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

通過NCBI Gene、GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫獲取AR 相關(guān)的靶點(diǎn)。 刪除重復(fù)，得到AR 相關(guān)基因2206 個(gè)，再經(jīng)UniProt 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

續(xù)表1

2.3 桔梗元參湯活性成分-AR 疾病靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

將桔梗元參湯活性成分對(duì)應(yīng)的239 個(gè)靶點(diǎn)與AR2206 個(gè)靶點(diǎn)相互映射，繪制韋恩圖，得到共有靶點(diǎn)120 個(gè)。 詳見圖1。

圖1 桔梗元參湯活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)-AR 相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 桔梗元參湯活性成分靶點(diǎn)-AR 靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)

將桔梗元參湯活性成分所對(duì)應(yīng)的239 個(gè)靶點(diǎn)基因與AR 相關(guān)的2206 個(gè)靶基因相互映射，得到120個(gè)共有靶點(diǎn)基因。將靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，刪除網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點(diǎn)，并通過Cytoscape 3.8.1 將PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化，顏色深淺和形狀大小與該基因在網(wǎng)絡(luò)中的作用強(qiáng)弱呈正比，結(jié)果表明STAT3、JUN、MAPK1 和IL-6 等為桔梗元參湯治療AR 的核心靶點(diǎn)。 詳見圖2。

圖2 桔梗元參湯成分-AR 靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)可視化

2.5 桔梗元參湯-成分-靶點(diǎn)-AR 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape 3.8.1 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果如圖3 所示。 該網(wǎng)絡(luò)中共有218 個(gè)節(jié)點(diǎn)（98 個(gè)成分節(jié)點(diǎn)和120 個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和1398 條邊。

圖3 桔梗元參湯-活性成分-靶點(diǎn)-AR 網(wǎng)絡(luò)

2.6 桔梗元參湯成分-AR 靶點(diǎn)的GO 功能富集分析

通過對(duì)桔梗元參湯活性成分-AR 靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析。 確定了2232 個(gè)GO 條目（P＜0.05）。其中，生物過程（Biological process, BP）主要涉及對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)和對(duì)抗生素的反應(yīng)等2052 個(gè)；細(xì)胞組成（cellular component,CC）主要包括膜筏、膜微區(qū)和膜區(qū)等52 個(gè)；分子功能（molecular function, MF）主要涉及細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合和核受體活性等128 個(gè)。 根據(jù)P 值大小篩選出排名前10 位的功能分析，詳見圖4。

2.7 桔梗元參湯活性成分-疾病靶點(diǎn)的KEGG 通路富集分析

通過對(duì)桔梗元參湯活性成分-AR 靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析。限定P＜0.05，獲得165 條富集結(jié)果。 根據(jù)P 值的大小得到排名前20 的代謝通路，包括AGE-RAGE、IL-17、TNF、HIF-1、PI3K-Akt 等通路。 詳見圖5-6。

圖5 桔梗元參湯活性成分-AR 靶點(diǎn)KEGG 通路分析

2.8 分子對(duì)接分析

將桔梗元參湯中幾味重要中藥的主要成分β谷甾醇、茯苓酸、橙皮苷和姜醇與核心靶點(diǎn)的對(duì)接結(jié)果通過PyMol 進(jìn)行可視化處理，匹配度良好，化合物與靶點(diǎn)結(jié)合的最優(yōu)構(gòu)象以氫鍵的方式呈現(xiàn)，結(jié)合活性良好。 詳見表2、圖7。

圖7 桔梗元參湯中活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接的可視化圖

表2 桔梗元參湯中活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)合能（kcal·mol-1）

3 討論

近年來，隨著環(huán)境條件和生活方式的改變，AR發(fā)病率不斷升高[14]。 中醫(yī)學(xué)將該病歸屬于“鼻鼽”范疇，認(rèn)為與脾、肺和腎相關(guān)，肺氣虛弱，衛(wèi)表不固，風(fēng)寒襲肺，鼻竅堵塞，則出現(xiàn)鼻鼽。一般采用祛風(fēng)解表、溫肺益氣和宣通鼻竅等治療為主[15]。 《嚴(yán)氏濟(jì)生方》中描述：“鼻者，肺之所主，職司清化，調(diào)適得宜。”肺通竅于鼻，調(diào)節(jié)氣的升降出入。 而鼻為肺之門戶，氣機(jī)借鼻腔出入。 外感邪氣，由鼻入肺，出現(xiàn)鼻竅不利，肺金不清，宣降失常，導(dǎo)致氣機(jī)出入不暢。 桔梗元參湯治療流清鼻涕的AR，通過升降氣機(jī)，去除寒邪，調(diào)理脾胃氣機(jī)升降，調(diào)暢肺氣，使得正氣得以伸張[7]。

圖6 桔梗元參湯活性成分-AR 靶點(diǎn)KEGG 部分通路圖

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)桔梗元參湯進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有98 個(gè)活性成分。其中，槲皮素屬于黃酮類化合物，具有抗過敏、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能[16]。研究發(fā)現(xiàn)，AR 患者鼻黏膜受感覺神經(jīng)、交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)的支配，受到外界變應(yīng)原刺激后，感覺神經(jīng)能產(chǎn)生P 物質(zhì)（substance P, SP）和降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）等神經(jīng)肽，刺激鼻黏膜的血管擴(kuò)張、水腫并激活炎癥細(xì)胞，促進(jìn)AR 的發(fā)生發(fā)展[17]。 KASHIWABARA 等[18]發(fā)現(xiàn)，槲皮素可減輕致敏大鼠鼻神經(jīng)源性炎癥和過敏樣癥狀，可能是通過抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases1/2, ERK1/2）和核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）信號(hào)通路，降低SP 和CGRP 等神經(jīng)肽的水平。 另有研究發(fā)現(xiàn)SP 和CGRP 降低可抑制巨噬細(xì)胞的活化，減少IL-1β、IL-3 和TNF-α 等促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制鼻過敏樣癥狀的發(fā)展[19]。 TANAKA 等[20]報(bào)道槲皮素在體外可抑制IL-4 誘導(dǎo)的CD4+T 細(xì)胞產(chǎn)生IL-5和IL-13，調(diào)節(jié)Th1/Th2 細(xì)胞因子平衡，達(dá)到治療過敏性疾病包括AR 的目的。 高健美等[21]用桔梗元參湯治療AR 小鼠，發(fā)現(xiàn)血清中Th1 型細(xì)胞因子（IFN-γ 和IL-2）含量明顯升高，Th2 型細(xì)胞因子（IL-4 和IL-10）降低。 因此，桔梗元參湯中的槲皮素可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，保持Th1/Th2 平衡，在AR 的治療過程中可能發(fā)揮重要的作用。 木犀草素是一種天然的黃酮類化合物，具有良好的抗過敏作用。 通過塵螨致敏建立AR 小鼠模型，發(fā)現(xiàn)木犀草素可抑制該模型小鼠中pSTAT6 和GATA3 表達(dá)，減少分泌IL-4 的脾細(xì)胞數(shù)量，降低血清特異性IgE 水平，減少嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和小鼠鼻上皮粘液分泌，有效減輕AR的癥狀[22]。 黃芩素也是一種有效抗過敏的黃酮類化合物，有研究發(fā)現(xiàn)其能減輕AR 小鼠的組織學(xué)改變、異常組織修復(fù)和炎癥反應(yīng)，抑制血液和鼻腔灌洗液中TNF-α、IL-1β 和IL-6 等炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，同時(shí)減少嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤，其機(jī)制是減少STAT3 磷酸化和調(diào)節(jié)核的轉(zhuǎn)位[23]。 鄭永艷等[24]發(fā)現(xiàn)兒茶素可明顯抑制組胺所致腸管收縮，提示兒茶素是抗過敏作用的重要活性物質(zhì)。另有研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素可有效減輕AR 的癥狀，其機(jī)制是通過NF-κB/TSLP 途徑抑制胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin, TSLP）的表達(dá)，降低血清中IL-5、IL-13 和IgE 的水平，調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫平衡[25]。

桔梗元參湯與AR 相互作用的靶點(diǎn)基因功能富集分析顯示，絕大部分功能富集在信號(hào)傳導(dǎo)中，主要涉及AGE-RAGE、IL-17、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、TNF、C 型凝集素受體和HIF-1α等信號(hào)通路，其中IL-17 信號(hào)通路在AR 的發(fā)病中可能起著比較重要的作用。 有研究發(fā)現(xiàn)，AR 患者的血清IL-17 水平明顯高于正常人[26]。 從AR 患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中去除Th17 細(xì)胞后，IgE 水平降低，而加入重組IL-17 后可恢復(fù)IgE 水平。 同時(shí)，與正常對(duì)照組相比，IL-17 可促進(jìn)AR 患者B 細(xì)胞產(chǎn)生IgE[27]。 有研究發(fā)現(xiàn)，AR 患者鼻黏膜中的抗原提呈細(xì)胞能向初始T 淋巴細(xì)胞遞呈過敏原，導(dǎo)致效應(yīng)性T 淋巴細(xì)胞的分化、產(chǎn)生Th2 型細(xì)胞因子和抗原特異性IgE。 其中， 調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells,Tregs）可抑制細(xì)胞因子的分泌，維持免疫耐受[28]。PALOMARES 等[29]發(fā)現(xiàn)Tregs 能夠抑制IgE 的產(chǎn)生，對(duì)于健康免疫應(yīng)答和免疫耐受的產(chǎn)生必不可少。AKDI 等[30]研究報(bào)道過敏人群中過敏原特異性Tregs數(shù)量顯著減少。上述均提示，桔梗元參湯中的有效活性成分可能通過調(diào)節(jié)T 受體細(xì)胞通路，誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞向Tregs 分化，從而抑制IgE 的分泌，防治AR的發(fā)生發(fā)展。

高健美等[11]研究發(fā)現(xiàn)桔梗元參湯能夠顯著改善AR 模型小鼠的癥狀，降低血清IgE 水平。同時(shí)，顯著降低了模型小鼠鼻黏膜中p38MAPK、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）和MUC5AC 的蛋白表達(dá)，表明桔梗元參湯可通過p38MAPK/COX-2 信號(hào)通路調(diào)節(jié)MUC5AC 的表達(dá)而發(fā)揮治療AR 作用。 本研究也發(fā)現(xiàn)，MAPK 信號(hào)通路是桔梗元參湯治療AR的關(guān)鍵信號(hào)通路。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)桔梗元參湯治療AR 的作用機(jī)制進(jìn)行了初步分析，發(fā)現(xiàn)桔梗元參湯活性成分-疾病靶點(diǎn)分析顯示活性成分通過多條信號(hào)通路發(fā)揮作用。 這些結(jié)果表明桔梗元參湯是通過多成分-多靶點(diǎn)-多途徑發(fā)揮治療AR 的作用，活性成分與信號(hào)通路的相互作用為下一步研究提供了方向。