補(bǔ)腎益志方通過(guò)β 淀粉樣蛋白和tau 蛋白調(diào)節(jié)大鼠阿爾茨海默病的實(shí)驗(yàn)研究

曹穎穎，張紹蘭，楊 楠，李 青，李 紅，王雪佼*

（昆明市中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650011）

認(rèn)知障礙（cognitive impairment, CI）是指記憶、語(yǔ)言、視覺(jué)空間、行動(dòng)、理解和判斷等功能中的一個(gè)或多個(gè)方面存在障礙[1-2]。60%以上的CI 患有阿爾茨海默病（Alzheimer's disease, AD）[3]。 隨著中國(guó)人口步入老齡化，AD 患者日益增多，但目前尚缺乏有效的治療方法。 大量臨床研究證實(shí)，中藥可以改善AD患者的認(rèn)知功能、情感狀態(tài)，延緩β 淀粉樣蛋白（βamyloid protein, Aβ）和tau 蛋白的病變，調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的代謝，提高患者的生活質(zhì)量[4-6]。 云南省名中醫(yī)李青主任醫(yī)師繼承了明清以來(lái)醫(yī)家對(duì)“癡呆”的認(rèn)識(shí)，結(jié)合自身臨床經(jīng)驗(yàn)，提出了“癡呆從腎虛血瘀論治”的學(xué)術(shù)思想，認(rèn)為老年人腎中精氣虧虛、腦髓失充，同時(shí)又因年老體衰、正氣不足、血運(yùn)無(wú)力而致氣血痰瘀互結(jié)，上犯顛頂，蒙蔽清竅，導(dǎo)致頭腦靈性漸失，而成本病[7-8]。 本病病位在腦，病性為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜，病理機(jī)制以腎氣虧虛、腎精不足為本，以瘀血阻絡(luò)、痰濁蒙竅為標(biāo)，而益氣補(bǔ)腎、活血益志為本病的基本治療原則[9]。 補(bǔ)腎益志方理論上有助于本病的治療，但是其發(fā)揮作用的機(jī)制尚不清楚。在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中，補(bǔ)腎益志方對(duì)AD 的認(rèn)知功能改善的療效得到很多患者的認(rèn)可，但是其發(fā)揮治療作用的具體作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步確定。 本研究旨在探索補(bǔ)腎益志方對(duì)AD 大鼠認(rèn)知功能的影響及其與Aβ、tau 蛋白之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60 只12 月齡SPF 級(jí)SD 雌性大鼠，體質(zhì)量230～280 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào): SCXK（京）2020-0035。

1.1.2 主要藥物、試劑與儀器 補(bǔ)腎益志方（何首烏15 g，黃精15 g，黃芪30 g，山茱萸15 g，熟地黃15 g，五味子15 g，當(dāng)歸15 g，丹參15 g，赤芍15 g）由本院制劑室提供。鹽酸多奈哌齊片（重慶植恩藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20010723，批號(hào)：HD008003，規(guī)格：5 mg×7 片）；Aβ25-35（美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)：131602-53-4）；HE 染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：C0105S）；Aβ40 檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號(hào)：ml003106）；Aβ42 檢測(cè)試劑盒（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，貨號(hào)：H-11672）；p-tau 蛋白ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，貨號(hào)：JL46213-96T）；兔抗Aβ40 多克隆抗體（貨號(hào)：tcea11340）、HRP 標(biāo)記的二抗（貨號(hào)：C0151）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；兔抗Aβ42多克隆抗體（英國(guó)Biorbyt 公司，貨號(hào)：orb593224）；兔抗p-tau 單克隆抗體 （美國(guó)Invitrogen 公司， 貨號(hào)：MN1020）。 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（武漢一鴻科技公司，型號(hào)：YH-WM-M/R）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio Rad 公司，型號(hào)：DocTMXR+1708195）。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理 將所有大鼠足料足水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。隨機(jī)分為6 組，每組10 只，分別標(biāo)記為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)腎益志方低劑量組、補(bǔ)腎益志方中劑量組、補(bǔ)腎益志方高劑量組、陽(yáng)性組。 除假手術(shù)組外，其余大鼠均進(jìn)行AD 模型制造[10]。

大鼠AD 模型的制造方法：麻醉后的大鼠左右兩側(cè)的側(cè)腦各注射5 μL 的Aβ25-35，留針3 min。結(jié)束后進(jìn)行消炎，連續(xù)肌內(nèi)注射青霉素3 d。 進(jìn)行Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)和自主活動(dòng)時(shí)間監(jiān)測(cè)，造模組大鼠的逃避潛伏期、目標(biāo)象限游泳時(shí)間、游泳總路程和自主活動(dòng)時(shí)間均明顯延長(zhǎng)，則說(shuō)明建模成功[11]。

給藥方案：建模后，補(bǔ)腎益志方低、中、高劑量組分別采用補(bǔ)腎益志方（13.00、6.50、3.25 g/kg）每日灌胃給藥1 次，連續(xù)60 d；陽(yáng)性組采用多奈哌齊（10 mg/kg）灌胃，1 d/次，連續(xù)60 d；假手術(shù)組、模型組均每日灌胃等劑量的生理鹽水，連續(xù)60 d。

戊巴比妥鈉麻醉大鼠，眼眶靜脈采血（-20 ℃保存?zhèn)溆茫?，斷頸法處死，剝離海馬組織，液氮保存或4%多聚甲醛溶液浸泡。

1.2.2 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)[12]大鼠末次給藥的次日進(jìn)行學(xué)習(xí)訓(xùn)練。 使用Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)對(duì)大鼠進(jìn)行適應(yīng)性學(xué)習(xí)，每天4 次（間隔至少20 min），連續(xù)訓(xùn)練5 d。第6 日開(kāi)始記錄大鼠的逃避潛伏期、目標(biāo)象限游泳時(shí)間、游泳總路程，每組大鼠按照同樣的方法測(cè)試，并記錄成績(jī)，取平均值。

1.2.3 自主活動(dòng)時(shí)間檢測(cè)[13]各組大鼠在末次給藥后，用自主活動(dòng)記錄儀監(jiān)測(cè)大鼠5 min 的自主活動(dòng)情況。監(jiān)測(cè)的前5 min 不記錄，為大鼠適應(yīng)時(shí)間。 后5 min 開(kāi)始記錄大鼠的活動(dòng)時(shí)間，取平均值。自主活動(dòng)的區(qū)域包括中央?yún)^(qū)、周邊區(qū)、總區(qū)域。 自主活動(dòng)包括大鼠的衛(wèi)生清理、站立、采食飲水等。

1.2.4 HE 染色觀察大鼠海馬組織 取出4%多聚甲醛固定24 h 的海馬組織，用濃度梯度的乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%） 脫水，二甲苯作透明劑置換出組織中的乙醇，再用溶化的石蠟包埋組織塊，待蠟塊冷卻固定，用于切片、展片、脫蠟、染色。染色過(guò)程按照HE 染色試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作，染色后用乙醇脫水，二甲苯透明，最后用樹(shù)脂膠封固切片，顯微鏡下觀察。

1.2.5 ELISA 法檢測(cè)大鼠血清中Aβ40、Aβ42、p-tau的含量 將采集的新鮮大鼠血漿，3000 r/min 離心3 min（離心半徑3 cm），取血清做樣本，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作要求操作，測(cè)定血清樣本Aβ40、Aβ42、p-tau 的含量。

1.2.6 Western blot 法檢測(cè)海馬組織Aβ40、Aβ42、p-tau 蛋白 將無(wú)菌研磨的海馬組織用RIPA 裂解

液充分裂解，提取總蛋白。 使用BCA 定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，沸水浴煮沸10 min 對(duì)蛋白進(jìn)行變性。用變性后的蛋白上清進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白電泳上樣。將膠上的蛋白用轉(zhuǎn)膜儀濕轉(zhuǎn)至NC 膜，并用含有2.5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉處理2 h。洗膜后，滴加稀釋的一抗溶液（兔抗Aβ40 多克隆抗體、兔抗Aβ42 多克隆抗體、兔抗p-tau 單克隆抗體，稀釋比例均為1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜，滴加稀釋的二抗溶液（HRP 標(biāo)記的二抗，稀釋比例為1∶500），于37 ℃，孵育2 h。洗膜，滴加ECL 發(fā)光液顯影，曝光。用目的條帶的灰度值與內(nèi)參GAPDH 條帶的灰度值之間的比值表示目的蛋白的表達(dá)情況。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)均使用統(tǒng)計(jì)學(xué)專用軟件SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料使用“±s”表示。 3 組以上的數(shù)據(jù)之間的比較使用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。 P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎益志方對(duì)AD 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠逃避潛伏期、目標(biāo)象限游泳時(shí)間、游泳總路程均顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，補(bǔ)腎益志方低、中、高劑量組及陽(yáng)性組大鼠逃避潛伏期、目標(biāo)象限游泳時(shí)間、游泳總路程均顯著降低（P<0.05）；與補(bǔ)腎益志方低劑量組相比，補(bǔ)腎益志方中、高劑量組及陽(yáng)性組大鼠逃避潛伏期、游泳總路程均顯著降低（P<0.05），補(bǔ)腎益志方高劑量組及陽(yáng)性組大鼠目標(biāo)象限游泳時(shí)間顯著降低（P<0.05）；補(bǔ)腎益志方中、高劑量組及陽(yáng)性組大鼠逃避潛伏期、目標(biāo)象限游泳時(shí)間、游泳總路程比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期、目標(biāo)象限游泳時(shí)間和總路程比較（±s，n=10）

表1 各組大鼠逃避潛伏期、目標(biāo)象限游泳時(shí)間和總路程比較（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與補(bǔ)腎益志方低劑量組比較，△P<0.05。

分組假手術(shù)組模型組補(bǔ)腎益志方低劑量組補(bǔ)腎益志方中劑量組補(bǔ)腎益志方高劑量組陽(yáng)性組逃避潛伏期/s 33.13±4.02 70.15±7.03*50.26±4.87#42.78±4.67#△40.35±5.04#△40.51±4.88#△目標(biāo)象限游泳時(shí)間/s 30.17±5.34 53.14±5.54*47.69±6.14#45.46±6.06#43.24±5.26#△43.53±5.02#△游泳總路程/cm 189.36±42.65 2 122.36±205.12*1 536.67±189.54#650.69±102.35#△644.37±98.61#△649.21±78.96#△

2.2 補(bǔ)腎益志方對(duì)AD 大鼠自主活動(dòng)時(shí)間的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠自主活動(dòng)時(shí)間顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，補(bǔ)腎益志方低、中、高劑量組及陽(yáng)性組大鼠自主活動(dòng)時(shí)間均顯著降低（P<0.05）；與補(bǔ)腎益志方低劑量組相比，補(bǔ)腎益志方中、高劑量組及陽(yáng)性組大鼠自主活動(dòng)時(shí)間均顯著降低（P<0.05）；補(bǔ)腎益志方中、高劑量組及陽(yáng)性組大鼠自主活動(dòng)時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠自主活動(dòng)時(shí)間比較（±s，n=10）

表2 各組大鼠自主活動(dòng)時(shí)間比較（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與補(bǔ)腎益志方低劑量組比較，△P<0.05。

分組假手術(shù)組模型組補(bǔ)腎益志方低劑量組補(bǔ)腎益志方中劑量組補(bǔ)腎益志方高劑量組陽(yáng)性組活動(dòng)時(shí)間/s 70.36±17.14 150.15±21.45*122.46±18.36#91.45±11.34#△90.35±12.28#△92.11±10.03#△

2.3 補(bǔ)腎益志方對(duì)AD 大鼠海馬組織的影響

假手術(shù)組大鼠海馬組織神經(jīng)元排列緊密、規(guī)則；模型組大鼠海馬組織神經(jīng)元數(shù)量稀少，排列疏松，呈現(xiàn)空泡樣變；補(bǔ)腎益志方低、中、高劑量組大鼠海馬組織神經(jīng)元排列緊密，補(bǔ)腎益志方高劑量組、陽(yáng)性組大鼠海馬組織神經(jīng)元最接近假手術(shù)組。 詳見(jiàn)圖1。

2.4 補(bǔ)腎益志方對(duì)AD 大鼠血清中Aβ40、Aβ42、ptau 含量的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中Aβ40、Aβ42、p-tau 的含量均顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，補(bǔ)腎益志方低、中、高劑量組及陽(yáng)性組大鼠血清中Aβ40、Aβ42、p-tau 的含量均顯著降低 （P<0.05）；與補(bǔ)腎益志方低劑量組相比，補(bǔ)腎益志方中、高劑量組及陽(yáng)性組大鼠血清中Aβ40、Aβ42、p-tau的含量均顯著降低（P<0.05）；補(bǔ)腎益志方中、高劑量組及陽(yáng)性組大鼠血清Aβ40、Aβ42、p-tau 的含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清中Aβ40、Aβ42、p-tau 含量比較（±s，n=9）

表3 各組大鼠血清中Aβ40、Aβ42、p-tau 含量比較（±s，n=9）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與補(bǔ)腎益志方低劑量組比較，△P<0.05。

分組假手術(shù)組模型組補(bǔ)腎益志方低劑量組補(bǔ)腎益志方中劑量組補(bǔ)腎益志方高劑量組陽(yáng)性組Aβ40/（μg·L-1）217.10±31.12 376.33±45.76*358.78±41.72#275.39±32.55#△248.79±29.65#△249.06±26.54#△Aβ42/（μg·L-1）36.84±5.05 69.43±8.22*63.34±7.29#49.57±5.48#△43.45±5.37#△45.05±5.11#△p-tau/（ng·L-1）17.32±4.12 42.31±6.19*38.44±6.21#31.35±3.58#△26.69±3.64#△27.09±3.02#△

2.5 補(bǔ)腎益志方對(duì)AD 大鼠海馬組織Aβ40、Aβ42、p-tau 蛋白表達(dá)量的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬組織Aβ40、Aβ42、p-tau 的蛋白表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，補(bǔ)腎益志方低、中、高劑量組及陽(yáng)性組大鼠海馬組織Aβ40、Aβ42、p-tau 的蛋白表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）；與補(bǔ)腎益志方低劑量組相比，補(bǔ)腎益志方中、高劑量組及陽(yáng)性組大鼠海馬組織Aβ40、Aβ42、p-tau 蛋白表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）；補(bǔ)腎益志方中、高劑量組及陽(yáng)性組大鼠海馬組織Aβ40、Aβ42、p-tau 的蛋白表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 詳見(jiàn)圖2、表4。

圖2 各組大鼠海馬組織Aβ40、Aβ42、p-tau 的蛋白條帶圖

表4 各組大鼠海馬組織Aβ40、Aβ42、p-tau 蛋白表達(dá)量比較（±s，n=4）

表4 各組大鼠海馬組織Aβ40、Aβ42、p-tau 蛋白表達(dá)量比較（±s，n=4）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與補(bǔ)腎益志方低劑量組比較，△P<0.05。

分組假手術(shù)組模型組補(bǔ)腎益志方低劑量組補(bǔ)腎益志方中劑量組補(bǔ)腎益志方高劑量組陽(yáng)性組Aβ40 0.24±0.04 0.74±0.09*0.66±0.06#0.34±0.06#△0.29±0.04#△0.34±0.06#△Aβ42 0.33±0.05 0.65±0.03*0.49±0.06#0.41±0.06#△0.40±0.04#△0.48±0.05#△p-tau 0.17±0.04 0.42±0.05*0.35±0.06#0.23±0.05#△0.21±0.04#△0.27±0.06#△

3 討論

據(jù)報(bào)道，山茱萸環(huán)烯醚萜苷對(duì)APP/PSI/tau 三轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的AD 老年小鼠具有十分顯著的認(rèn)知功能改善作用，并促進(jìn)腦內(nèi)突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)[14]。何首烏二苯乙烯苷和黃精對(duì)CI 均有治療功效。在治療CI 的處方中，當(dāng)歸、赤芍也是廣泛使用的中藥組合，有研究表明，當(dāng)歸芍藥散用于治療AD 等神經(jīng)退行性疾病也具有較好的功效[15]。LIN 等[16]在對(duì)83 位AD患者的研究中報(bào)道，使用調(diào)補(bǔ)心腎方治療后，患者癡呆綜合征評(píng)分較對(duì)照組明顯降低，臨床上初步驗(yàn)證了中藥復(fù)方制劑改善AD 患者CI 的有效性。 本研究所用補(bǔ)腎益智方在臨床上給很多患者帶來(lái)福音，但是其發(fā)揮作用的具體機(jī)制及藥物成分尚不清楚。本研究建立了AD 大鼠模型，觀察大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力變化發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的逃避潛伏期、目標(biāo)象限游泳時(shí)間、游泳總路程和自主活動(dòng)時(shí)間都明顯延長(zhǎng)，說(shuō)明建模成功。 而經(jīng)過(guò)補(bǔ)腎益志方給藥治療后，大鼠的上述指標(biāo)均明顯降低，趨向假手術(shù)組，再次驗(yàn)證了補(bǔ)腎益志方對(duì)AD 患者的治療價(jià)值。通過(guò)HE 染色觀察大鼠海馬組織發(fā)現(xiàn)，不同劑量補(bǔ)腎益志方治療的大鼠海馬組織都有不同程度的改善，并且補(bǔ)腎益志方高劑量組大鼠的海馬組織恢復(fù)得最好。Aβ蛋白及tau 蛋白作為AD 的明星因子，猜測(cè)其有可能參與補(bǔ)腎益志方的藥理作用機(jī)制。

AD 是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，其特征是記憶喪失和多種認(rèn)知障礙[17-19]。 幾十年的深入研究表明，多種細(xì)胞變化與AD 的發(fā)展有關(guān)，包括線粒體損傷、突觸功能障礙、Aβ 和p-tau 的形成和積累[20]。最近大量研究表明，Aβ 和p-tau 誘導(dǎo)的缺陷性自噬和絲裂吞噬是AD 發(fā)病機(jī)制中的突出變化，并且Aβ 和p-tau 水平隨年齡的增加而升高[21]。 多年來(lái)，普遍認(rèn)可的AD 發(fā)病機(jī)制為Aβ 的沉積會(huì)加速疾病進(jìn)程，并引發(fā)級(jí)聯(lián)的有害反應(yīng)，如tau 病理和神經(jīng)退行性變[22]。有研究報(bào)道，基于調(diào)補(bǔ)心腎理論的益氣補(bǔ)腎活血方對(duì)臨床180 位老年輕度CI 患者有治療作用，通過(guò)Western blot 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，治療后患者血清中tau 蛋白的表達(dá)明顯受到抑制[23]。 本研究通過(guò)ELISA法和Western blot法檢測(cè)了大鼠海馬中Aβ40、Aβ42、p-tau 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益志方給藥的大鼠海馬中Aβ40、Aβ42、p-tau 的表達(dá)均明顯下降，且補(bǔ)腎益志方高劑量組大鼠海馬最接近假手術(shù)組大鼠，說(shuō)明補(bǔ)腎益志方有助于改善AD 患者認(rèn)知功能，可能與抑制Aβ40、Aβ42、p-tau 相關(guān)。

綜上所述，補(bǔ)腎益志方可減輕AD 大鼠的認(rèn)知功能損害，其作用機(jī)制與抑制Aβ、p-tau 表達(dá)有關(guān)，為補(bǔ)腎益志方在AD 患者中的臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。