急性冠脈綜合征患者血清LncRNA XIST和miR-330-3p水平表達(dá)與心臟自主神經(jīng)功能的相關(guān)性研究

劉英華，王玉霞，盧海英，曾 娟，劉亞寧，高曉麗，王 靜

（華北石油管理局總醫(yī)院a.心內(nèi)科；b.功能科；c.檢驗科，河北任丘 062552）

急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）是指冠狀動脈不穩(wěn)定斑塊破裂并形成血栓，進(jìn)而導(dǎo)致心肌急性缺血的臨床綜合征，是造成心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）患者死亡的重要原因[1]。心率變異性（heart rate variability，HRV）是反映調(diào)節(jié)心臟自主神經(jīng)功能的重要指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)，ACS 可導(dǎo)致患者心臟自主神經(jīng)功能紊亂，心血管事件發(fā)生率升高，預(yù)后變差[2]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是近些年的研究熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)其與高血壓、冠心病及心臟衰竭有關(guān)[3-4]。LncRNA X 染色體失活特異轉(zhuǎn)錄物（LncRNA X inactivate-specific transcript，LncRNA XIST）是一種長17 kb 的LncRNA，其通過靶向相應(yīng)的微小RNA（microRNA，miRNA）來調(diào)節(jié)各種疾病的病理過程，包括心肌梗死[5]、動脈粥樣硬化[6]和癌癥[7]。miRNA 是一種高度保守的非編碼RNA，包含22 個左右的核苷酸，通過抑制mRNA 的翻譯或促進(jìn)mRNA 的降解而作為基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)因子[8]。微小RNA（miR）-330-3p 在非小細(xì)胞肺癌[9]、乳腺癌[10]中作為癌基因發(fā)揮作用，并與ACS 患者斑塊破裂有關(guān)[11]。有研究顯示，LncRNA XIST 與miR-330-3p 具有靶向關(guān)系，LncRNA XIST 通過與miR-330-3p 的相互結(jié)合促進(jìn)星形膠質(zhì)源性蛋白（S100B）的表達(dá)，最終阻止小鼠心肌肥大[12]。因此，本研究通過檢測ACS 患者血清LncRNA XIST 和miR-330-3p 水平，分析其與心臟自主神經(jīng)功能的關(guān)系，以期為臨床防治ACS 患者發(fā)生心臟自主神經(jīng)功能障礙提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2020年2月～2021年6月在華北石油管理局總醫(yī)院診斷為ACS 的患者156例，包括不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina，UA）80 例（UA 組），其中男性45 例，女性35 例，年齡55 ～86（61.56±11.55）歲，平均收縮壓146.72±11.51mmHg，平均舒張壓95.43±10.13mmHg，平均體質(zhì)量指數(shù)（BMI）23.35±3.46kg/m2，平均總膽固醇（TC）4.58±0.78mmol/L，平均低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）2.86±0.83mmol/L，平均高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）2.76±0.44mmol/L；吸煙史9 例，飲酒史10 例，高血壓9 例，糖尿病10 例。急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）76 例（AMI 組），其中男性44 例，女性32 例，年齡52 ～83（60.53±11.39）歲，平均收縮壓145.35±11.46mmHg，平均舒張壓95.24±10.15mmHg，平均BMI 22.87±3.32kg/m2，平均TC 4.38±0.79 mmol/L，平均LDL-C 2.71±0.86 mmol/L，平均HDL-C 2.86±0.49 mmol/L；吸煙史10 例，飲酒史11 例，高血壓12 例，糖尿病13 例。另選取同期體檢健康者100 例作為對照組，男性55 例，女性45 例，年齡50 ～82（60.31±10.62）歲，平均收縮壓146.48±11.26 mmHg，平均舒張壓93.75±9.21 mmHg，平均BMI 23.42±3.15 kg/m2，平均TC 4.62±0.75mmol/L，平均LDL-C 2.68±0.85 mmol/L，平均HDL-C 2.74±0.48 mmol/L；吸煙史10 例，飲酒史12 例，高血壓10 例，糖尿病12 例。三組受試者上述資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過，受試者均簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有ACS 患者均經(jīng)冠狀動脈造影證實，符合ACS 診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]；②納入對象年齡＞50 歲；③既往無心律失常發(fā)病史；④有完整的臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)肝、腎功能不全或衰竭者；②有系統(tǒng)性免疫缺陷癥的患者；③精神病患者；④其他原因引起的心絞痛或心肌病。

1.2 儀器與試劑 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）儀（型號7700 型，美國Applied biosygtems 公司）；動態(tài)心電圖檢測儀（型號TLC4000，秦皇島康泰醫(yī)學(xué)公司）；Trizol 試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光定量PCR 試劑盒（批號RP1579-11，RP1105-50T，RL6079-09，上海吉至生化科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：ACS 患者在入院后次日、對照組體檢時，清晨空腹經(jīng)肘靜脈抽取外周血5 ml，靜置30 min，室溫3 000 r/min，離心15 min，離心半徑15cm，吸取上清液分別裝入EP 管中，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 qRT-PCR 法檢測血清中LncRNA XIST 和miR-330-3p 水平：按照Trizol 法提取血清樣本中總RNA，分光光度計測總RNA 純度及濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照熒光定量PCR 試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，LncRNA XIST（內(nèi)參GAPDH），miR-330-3p（內(nèi)參U6）引物序列見表1。引物由上海吉至生化科技有限公司合成。反應(yīng)條件為：95℃10 min；40 個PCR 循環(huán)（95 ℃ 10s，60 ℃ 60s，72℃15 s）。采用2-ΔΔCt方法計算血清中LncRNA XIST 和miR-330-3p 相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3.3 24 h 動態(tài)心電圖檢測：受試者均接受holter檢測，并進(jìn)行HRV 時域分析，檢測參數(shù)包括24 h內(nèi)正常R-R 間期標(biāo)準(zhǔn)差（SDNN）、每5 min R-R間期平均值的標(biāo)準(zhǔn)差（SDANN）、每5 min R-R 間期標(biāo)準(zhǔn)差的平均值（SDNN index）、相鄰R-R 間期之差的均方根（RMSSD）及相鄰R-R 間期相差＞50 ms 心搏數(shù)占總心搏數(shù)的百分比（PNN50）。1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料經(jīng)檢驗均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料以[n（%）]描述，行卡方檢驗；采用Pearson 法分析ACS 患者血清LncRNA XIST，miR-330-3p 水平與HRV 時域指標(biāo)的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清LncRNA XIST 和miR-330-3p 水平比較 見表2。與對照組比較，UA 組和AMI 組血清LncRNA XIST 水平升高（t=10.084，21.299，均P＜0.05），miR-330-3p 水平降低（t=12.787，30.011，均P＜0.05）；與UA 組比較，AMI 組血清LncRNA XIST 水平升高（t=10.792，P＜0.05），miR-330-3p 水平降低（t=16.538，P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 受試者血清LncRNA XIST 和miR-330-3p 水平比較（±s）

表2 受試者血清LncRNA XIST 和miR-330-3p 水平比較（±s）

項目對照組（n=100）UA 組（n=80）AMI 組（n=76）FP LncRNA XIST1.09±0.221.37±0.261.69±0.31113.5870.000 miR-330-3p1.03±0.180.82±0.150.53±0.12225.2010.000

2.2 HRV 時域指標(biāo)水平比較 見表3。與對照組比較，UA 組和AMI 組SDANN，SDNN，SDNN index，RMSSD，PNN50 水平均降低（t=8.520，16.571；9.525，14.381；11.585，20.497；10.426，17.254；11.261，23.119，均P＜0.05）；與UA 組比 較，AMI 組SDANN，SDNN，SDNN index，RMSSD，PNN50 水平均降低（t=7.764，4.743，8.625，6.628，11.418，均P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2.3 ACS 患者血清LncRNA XIST，miR-330-3p 水平與HRV 時域指標(biāo)的相關(guān)性 見表4。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ACS 患者血清LncRNA XIST，miR-330-3p 水平與SDANN，SDNN 無相關(guān)性（均P＞0.05）；LncRNA XIST 與SDNN index，RMSSD，PNN50 呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05）；miR-330-3p 與SDNN index，RMSSD，PNN50 呈正相關(guān)（均P＜0.05）。

表3 受試者HRV 時域指標(biāo)水平比較（±s）

表3 受試者HRV 時域指標(biāo)水平比較（±s）

項目對照組（n=100）UA 組（n=80）AMI 組（n=76）FP SDANN（ms）133.43±21.01115.96±19.5798.96±16.5769.1380.000 SDNN（ms）136.41±31.53113.84±15.26101.84±11.2254.9230.000 SDNN index（ms）64.68±10.6454.68±6.7246.73±5.14107.1340.000 RMSSD（ms）36.48±8.6227.48±5.6221.37±3.64118.9280.000 PNN50（%）10.72±3.217.58±2.834.18±1.13134.0140.000

表4 ACS 患者血清LncRNA XIST，miR-330-3p水平與HRV 時域指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

急性冠脈綜合征（ACS）屬于臨床常見嚴(yán)重型慢性靜脈功能不全（chronic venous disorder，CVD），也是最危險、最致命的冠心病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，在歐洲，CVD 每年造成超過400 萬人死亡，接近所有死亡的45%，其中冠心病占20%[14]。2015年，中國大陸地區(qū)冠心病死亡率約為110/10 萬，且逐年上升[15]。此外，ACS 還導(dǎo)致心臟自主神經(jīng)功能紊亂，表現(xiàn)為心臟交感神經(jīng)興奮增強(qiáng)，迷走神經(jīng)活動減少，造成交感神經(jīng)機(jī)制占優(yōu)勢和心電不穩(wěn)定，此類疾病往往導(dǎo)致心臟交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)不可逆的損傷。因此，探究ACS 患者心臟自主神經(jīng)功能及其影響因素，可能有助于防治ACS 患者心臟自主神經(jīng)功能失調(diào)。

長鏈非編碼RNA(LncRNA)在CVD 的病理生理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。LncRNA 被定義為是超過200 個核苷酸的轉(zhuǎn)錄物，功能分析表明，LncRNA 可以在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，或直接調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性。LncRNA XIST基因位于人染色體Xq13.2，與X染色體失活有關(guān)[16]。XIAO 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下小鼠心肌細(xì)胞中XIST 表達(dá)上調(diào)；沉默XIST 表達(dá)可提高細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，并通過降低凋亡相關(guān)蛋白水平抑制心肌梗死，提示XIST 參與了心肌梗死的發(fā)生，其水平的調(diào)節(jié)可作為心肌梗死治療的新策略或潛在靶點(diǎn)。ZHANG 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA XIST 通過調(diào)控多種miRNA 參與AMI 的進(jìn)程中，如在AMI大鼠模型心臟組織中發(fā)現(xiàn)，LncRNA XIST 基因敲除可通過下調(diào)miR-449 水平抑制AMI 模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡。缺氧損傷后大鼠心肌細(xì)胞中LncRNA XIST 過度表達(dá)，XIST 的沉默減輕了細(xì)胞損傷；XIST 的上調(diào)通過競爭性結(jié)合微小RNA（miR）-150-5p 促進(jìn)B 細(xì)胞淋巴瘤2 相關(guān)X 蛋白的表達(dá)，可能作為AMI 治療的重要靶點(diǎn)[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AMI 組血清LncRNA XIST 水平最高，其次為UA 組，對照組血清LncRNA XIST 水平最低，提示LncRNA XIST 升高可能參與ACS 發(fā)生。原因可能與LncRNA XIST 參與血管生成、斑塊形成及血管平滑肌細(xì)胞的凋亡等調(diào)節(jié)過程有關(guān)。

與LncRNAs 不同，miRNAs 是一個進(jìn)化上保守的內(nèi)源性家族，可通過不完全互補(bǔ)性與mRNA 的3’非翻譯區(qū)結(jié)合，在血小板聚集、心臟損傷及內(nèi)皮細(xì)胞活化等多種病理過程中發(fā)揮重要作用[8]。研究顯示，低氧無血清培養(yǎng)的心肌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的miR-330-3p 能抑制心肌細(xì)胞凋亡率，是抗心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子[20]。有研究通過高通量測序技術(shù)，篩查出miR-330-3p 在缺氧性人AC16 心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可能為在急性缺氧條件下靶向心肌細(xì)胞的新的診斷或治療策略上提供重要參考[21]。miR-330-3p在動脈粥樣硬化病變形成過程中起著關(guān)鍵性作用，LI 等[11]研究報道，血漿miR-330-3p 表達(dá)變化與斑塊破裂有一定關(guān)系，可作為區(qū)分ST 段抬高型心肌梗死患者斑塊表型的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組、UA 組和AMI 組血清miR-330-3p 水平依次降低，與LI 等[11]研究結(jié)果具有相似性，提示miR-330-3p降低可能與ACS發(fā)生及病情進(jìn)展有關(guān)。相關(guān)研究顯示，LncRNA XIST 與miR-330-3p 具有靶向關(guān)系[12]，所以二者可能共同參與了ACS 的致病過程，但具體作用機(jī)制尚不明確，下一步需補(bǔ)充相關(guān)實驗繼續(xù)探討。

心率變異性(HRV)是公認(rèn)的評價心臟自主神經(jīng)功能的非創(chuàng)傷性方法。SCOVELLE 等[22]在ACS 診斷后的12 個月時觀察HRV，發(fā)現(xiàn)HRV 有性別差異，女性HRV 較低，其心臟自主神經(jīng)功能也相對較差。高青豹等[23]研究顯示，ACS 患者HRV 各項指標(biāo)均降低，與病情嚴(yán)重程度有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組、UA 組、AMI 組SDANN，SDNN，SDNN index，RMSSD，PNN50 水平依次降低，與高青豹等[23]的研究結(jié)果一致。此外，本研究經(jīng)Pearson分析發(fā)現(xiàn)，ACS 患者血清LncRNA XIST 與SDNN index，RMSSD，PNN50 呈負(fù)相關(guān)；miR-330-3p 與SDNN index，RMSSD，PNN50 呈正相關(guān)。提示LncRNA XIST，miR-330-3p 可能與ACS 患者心臟自主神經(jīng)功能有關(guān)，猜測可能是LncRNA XIST 水平升高后，抑制miR-330-3p 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致UA 或AMI 的發(fā)生。

綜上所述，ACS 患者血清LncRNA XIST 水平升高，miR-330-3p 水平降低，與心臟自主神經(jīng)功能有關(guān)，可能作為防治ACS 的重要靶點(diǎn)。本研究未分析ACS 患者炎癥因子與LncRNA XIST，miR-330-3p 的關(guān)系，可能對于ACS 的心臟自主神經(jīng)功能障礙的發(fā)生揭示不夠全面，有待后續(xù)深入研究。