溫肺降濁方聯(lián)合ROCK2-shRNA轉(zhuǎn)染對(duì)血管性癡呆大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

向軍軍，莫雪妮，楊璧璘，李曉瓊，林榮清，黎軍宏，胡躍強(qiáng)

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200)

血管性癡呆的發(fā)病率較高，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚[1]。筆者團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，肺臟虛損及功能失調(diào)在血管性癡呆發(fā)病中起著重要作用，前期研究證實(shí)在此理論基礎(chǔ)上制定的溫肺降濁方可顯著改善血管性癡呆患者及大鼠的認(rèn)知障礙[2-3]，但其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步闡明。目前認(rèn)為學(xué)習(xí)記憶功能與突觸可塑性密切相關(guān)，而神經(jīng)再生是重建突觸聯(lián)系的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[4]。Ras同源基因家族成員A(ras homolog gene family member A,RhoA)是Rho家族的重要成員，其與Rho相關(guān)螺旋卷曲蛋白激酶2(rho-associated coiled coil-forming protein kinase,ROCK2)形成的RhoA/ROCK2信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)有調(diào)控作用，阻斷該通路可促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)和軸突再生[5]，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)基于ROCK2-shRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，探討了溫肺降濁方是否通過(guò)抑制ROCK2生成達(dá)到促進(jìn)海馬神經(jīng)元再生的目的。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠60只，3月齡，體重(250±50)g，由湖南斯萊克景達(dá)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004。大鼠自由飲食、飲水，室溫、60%濕度的受控環(huán)境中，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)流程及動(dòng)物處理遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例；本研究經(jīng)廣西中醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理 DW20211204-196)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 溫肺降濁方由制附子20g、黨參15 g、干姜10 g、酒大黃10 g、田七10 g、炙甘草10 g組成，配方顆粒由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一采購(gòu)備用(每單味藥要求同一產(chǎn)地、同一質(zhì)量層次、同一批次，由江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司提供)，大鼠給藥濃度及等效劑量按體表面積換算。AAV9-ROCK2-shRNA注射液及空載體腺相關(guān)病毒由上海吉滿生物科技有限公司制造。

1.3主要試劑和儀器 Tunel檢測(cè)試劑盒(北京中杉，批號(hào): 11260228)；Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(上海軟隆科技發(fā)展有限公司，型號(hào)BW-MMM101)；MICROM HM355S 型全自動(dòng)石蠟切片機(jī)(德國(guó)美康公司)；JEM-1200EX型透射電子顯微鏡(美國(guó)FEI公司)；大鼠腦立體定位儀(日本成茂公司) 。

1.4分組、模型制備及干預(yù)方法 按隨機(jī)數(shù)字表將大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、中藥組、ROCK2干擾組、陰性對(duì)照組、中藥+ROCK2干擾組，每組10只。除假手術(shù)組外，其余組均參照文獻(xiàn)[7]方法，采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法制備血管性癡呆模型。評(píng)估模型成功后，ROCK2干擾組及中藥+ROCK2干擾組立即注射稀釋至5.07E+12VG/mL的AAV9-ROCK2-shRNA，每只動(dòng)物注射總量4 μL，持續(xù)5 min。注射坐標(biāo)(以前囟為0點(diǎn))-皮質(zhì)(前)：向前1.0 mm，右側(cè)旁開(kāi)2.0 mm，深度1.2 mm；皮質(zhì)(后)向后3.0 mm，右側(cè)旁開(kāi)1.5 mm，深度1.2 mm；海馬：向后3.5 mm，右側(cè)旁開(kāi)2.5 mm，深度3.0 mm。陰性對(duì)照組同法注射等量空載體腺相關(guān)病毒。之后于術(shù)后第1天開(kāi)始，中藥組和中藥+ROCK2干擾組均給予溫肺降濁方2 g/(kg·d)灌胃，其他組給予等量生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)4周。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1學(xué)習(xí)記憶功能 定位航行實(shí)驗(yàn)：術(shù)后1周、4周，每組大鼠每天上下午從4個(gè)象限各訓(xùn)練1次，將大鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間設(shè)置為120 s，記錄大鼠從入水到爬上平臺(tái)所需時(shí)間，即逃避潛伏期，以評(píng)估大鼠空間學(xué)習(xí)能力。 空間搜索實(shí)驗(yàn)：大鼠完成定位航行實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤走平臺(tái)，依次將大鼠從4個(gè)象限放入水中，分別記錄其跨越原來(lái)平臺(tái)的次數(shù)，以評(píng)估大鼠空間記憶能力。

1.5.2海馬組織結(jié)構(gòu) 術(shù)后4周，大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，斷頭，迅速取出腦組織，取2 mm×2 mm×2 mm大小的海馬區(qū)組織1塊，置于2.5%戊二醛預(yù)固定后加入1%鋨酸繼續(xù)固定，經(jīng)70%、80%、95%乙醇及無(wú)水丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂Epon812浸透和包埋，全自動(dòng)石蠟切片機(jī)超薄切片，厚度約4 μm，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡觀察海馬組織結(jié)構(gòu)。

1.5.3海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài) 選取含海馬區(qū)的組織貼片后放入60 ℃烤片2 h，4%多聚甲醛溶液固定15 min，雙蒸水沖洗2次，每次2 min；添加尼氏染色劑，37 ℃恒溫箱孵育6 min，雙蒸水沖洗2次，每次2 min；95%乙醇脫色脫水5 s，晾干中性樹(shù)脂封片。各組每只大鼠隨機(jī)選取3張切片在100倍視野下用Image-pro Express C圖像分析系統(tǒng)對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.5.4海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況 用石蠟包埋切片機(jī)將海馬組織標(biāo)本切成5 μm厚的切片，貼于涂有多聚賴(lài)氨酸的載玻片上，用4%多聚甲醛液固定20 min，按照Tunel試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以細(xì)胞核中有棕色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞，每組從不同大鼠中隨機(jī)選取5張切片，每張切片在200倍光鏡中選取5個(gè)不同視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞凋亡數(shù)后取平均值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 術(shù)后1周，模型組與各干預(yù)組大鼠逃避潛伏期均明顯長(zhǎng)于假手術(shù)組(P均<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)均明顯少于假手術(shù)組(P均<0.05)，模型組與各干預(yù)組間逃避潛伏期、跨越平臺(tái)次數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。術(shù)后4周，模型組和陰性對(duì)照組大鼠逃避潛伏期均明顯長(zhǎng)于假手術(shù)組(P均<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)均明顯少于假手術(shù)組(P均<0.05)；與模型組比較，中藥組、ROCK2干擾組及中藥+ROCK2干擾組大鼠逃避潛伏期均明顯縮短(P均<0.05)，跨越平臺(tái)次數(shù)均明顯增加(P均<0.05)；與ROCK2組及中藥組比較，中藥+ROCK2干擾組大鼠逃避潛伏期更短(P均<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)更多(P均<0.05)；中藥組與ROCK2干擾組大鼠逃避潛伏期及跨越平臺(tái)次數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 假手術(shù)組及血管性癡呆各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)記憶能力比較

2.2各組大鼠海馬區(qū)超微結(jié)構(gòu) 假手術(shù)組突觸結(jié)構(gòu)正常且清晰，突觸前膜有大量球形突觸小泡，可見(jiàn)清晰的線粒體，突觸間隙寬度及形態(tài)正常，突觸后膜厚度正常且均勻；模型組與陰性對(duì)照組突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清晰，突觸小泡分布零散且形態(tài)模糊；中藥組、ROCK2干擾組及中藥+ROCK2干擾組突觸結(jié)構(gòu)清晰，前膜和后膜形態(tài)正常，可見(jiàn)清晰的線粒體結(jié)構(gòu)，突觸間隙寬度正常。見(jiàn)圖1。

圖1 假手術(shù)組及血管性癡呆各組大鼠術(shù)后4周海馬區(qū)電鏡下超微結(jié)構(gòu)(×10 000)

2.3各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài) 假手術(shù)組大鼠海馬組織中神經(jīng)元圓潤(rùn)飽滿、排列整齊、結(jié)構(gòu)完整，可見(jiàn)豐富的尼氏小體，尼氏小體計(jì)數(shù)(34.71±7.72)個(gè)；模型組和陰性對(duì)照組大鼠海馬組織中神經(jīng)元散亂，結(jié)構(gòu)破壞，大量尼氏小體消失，尼氏小體計(jì)數(shù)分別為(13.58±3.55)個(gè)、(14.65±3.87)個(gè)，均明顯少于假手術(shù)組(P均<0.05)；中藥組、ROCK2干擾組、中藥+ROCK2干擾組大鼠海馬組織中神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)完整，可見(jiàn)較豐富的尼氏小體，尼氏小體計(jì)數(shù)分別為(19.50±5.56)個(gè)、(20.34±5.49)個(gè)、(27.22±6.74)個(gè)，均明顯多于模型組(P均<0.05)，且中藥+ROCK2干擾組明顯多于中藥組與ROCK2干擾組(P均<0.05)，中藥組與ROCK2干擾組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 假手術(shù)組及血管性癡呆各組大鼠術(shù)后4周海馬組織尼氏染色表現(xiàn)(×100)

2.4各組大鼠海馬細(xì)胞凋亡情況比較 假手術(shù)組、模型組、陰性對(duì)照組、中藥組、ROCK2干擾組、中藥+ROCK2干擾組大鼠海馬細(xì)胞凋亡數(shù)分別為(4.39±1.60)個(gè)、(28.12±6.54)個(gè)、(29.52±5.58)個(gè)、(18.98±4.22)個(gè)、(19.38±4.07)個(gè)、(10.65±2.96)個(gè)，模型組、陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯多于假手術(shù)組(P均<0.05)，中藥組、ROCK2干擾組、中藥+ROCK2干擾組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯少于模型組(P均<0.05)，且中藥+ROCK2干擾組明顯少于中藥組與ROCK2干擾組(P均<0.05)，中藥組與ROCK2干擾組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 假手術(shù)組及血管性癡呆各組大鼠術(shù)后4周海馬細(xì)胞凋亡情況(×200)

3 討 論

突觸結(jié)構(gòu)的可塑性是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)[7]。突觸連接可以完成神經(jīng)元對(duì)信號(hào)的接收與處理功能，而神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性在很大程度上由突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)、數(shù)量及功能狀態(tài)決定[8]。神經(jīng)元中的神經(jīng)突觸、軸突變化是神經(jīng)退行性和神經(jīng)保護(hù)的標(biāo)志[9]，所以促進(jìn)和保護(hù)神經(jīng)突觸的生長(zhǎng)和神經(jīng)細(xì)胞損傷后的修復(fù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的治療顯得尤為重要。研究已證實(shí)ROCK2可能參與神經(jīng)突觸異常、免疫炎性反應(yīng)和神經(jīng)變性，抑制ROCK2表達(dá)與改善炎癥誘導(dǎo)的突觸損傷及神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)[10]。ROCK抑制劑可以明顯促進(jìn)損傷后神經(jīng)突觸、軸突再生及功能恢復(fù)，從而可能成為一種新的疾病治療途徑[11]。Sung等[12]研究證實(shí)阻斷RhoA或者ROCK的活性能夠抑制Nogo對(duì)軸突生長(zhǎng)的抑制作用，促進(jìn)軸突再生和代償性萌芽。在小鼠的局部腦缺血模型中，缺血皮質(zhì)區(qū)ROCK快速激活，其抑制劑法舒地爾或Y-27632能夠明顯增加缺血半暗帶和中心壞死區(qū)的腦血流量[13]。

本團(tuán)隊(duì)在國(guó)內(nèi)首先提出“從肺論治癡呆”的新觀點(diǎn)，并創(chuàng)制了溫肺降濁方。該方附子與黨參合用，溫陽(yáng)化氣，既補(bǔ)益脾肺，更資肺衛(wèi)宣發(fā)之源；干姜助附子溫陽(yáng)，滋肺生精；田七活血化瘀，亦有補(bǔ)益之功；大黃瀉下降濁，蕩滌腸胃，推陳致新；炙甘草補(bǔ)中緩急，調(diào)和藥性。諸藥合用，有溫有補(bǔ)，有走有守，有升有降，各有兼顧。前期研究從線粒體相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)、血管內(nèi)皮功能方面證實(shí)該方可改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及認(rèn)知功能[14-15]。

體外RNA干擾為新興的基因阻斷技術(shù)，在人類(lèi)基因功能研究及基因治療方面顯示出巨大前景，有望應(yīng)用于神經(jīng)損傷未知功能基因的研究、藥物靶標(biāo)的確認(rèn)和治療。腺相關(guān)病毒(AAV)載體具有較高的安全性、低免疫原性、可持續(xù)表達(dá)等特性，目前是神經(jīng)系統(tǒng)研究以及基因治療的重要工具之一[16]。本研究創(chuàng)新性地運(yùn)用體外RNA干擾技術(shù)，探討溫肺降濁方的作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫肺降濁方可能通過(guò)抑制ROCK2的表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)海馬神經(jīng)元再生，從而改善海馬組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，減輕神經(jīng)元損傷，這為血管性癡呆的中西醫(yī)結(jié)合治療提供了新的思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。