酪乳中乳脂肪球膜成分的制備工藝

徐蘊(yùn)桃，劉佳袆，孫顏君，劉振民，萬嗣寶

1. 乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院（上海 200436）；2. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（上海 200444）

乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）是包裹于牛乳中脂肪球表面的三層膜結(jié)構(gòu)。其富含極性脂質(zhì)，如鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿等[1]。它們具有調(diào)控膽固醇代謝、抗神經(jīng)退化等作用[2]。在MFGM表面鑲嵌多種蛋白質(zhì)，如嗜乳脂蛋白、黃嘌呤脫氫酶/氧化酶等，它們具有防止細(xì)胞衰亡、提高機(jī)體免疫力的功能[3]。將MFGM作為功能性乳成分添加到不同產(chǎn)品中能提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[4]。

酪乳（Buttermilk，BM）是黃油加工的副產(chǎn)物，是稀奶油經(jīng)攪打后稀出的水相成分[5-6]，攪打時(shí)脂肪球之間碰撞，MFGM脫落到水相。工業(yè)生產(chǎn)黃油時(shí)，酪乳常丟棄或用于動(dòng)物飼料[7]。隨著對(duì)MFGM深入了解，試驗(yàn)開始研究分離MFGM的方法和添加到乳制品中[8-9]。將酪乳作為分離MFGM原料，能降低成本的同時(shí)也提高附加值[10]。

Holzmuller等[11]以酪乳為原料，經(jīng)凝乳酶處理后用80 nm陶瓷膜超濾，可較好地去除酪蛋白和乳清蛋白。0.1～1.4 μm的陶瓷膜、0.22 μm聚偏氟乙烯膜等膜包[12～14]已應(yīng)用于MFGM的分離處理，需考察不同分離參數(shù)對(duì)分離的影響[15]。過膜壓力、溫度等因素影響MFGM分離效果[16-17]，非優(yōu)化條件得到的MFGM膜蛋白和極性脂質(zhì)損失大。膜包材料和過濾系統(tǒng)也很關(guān)鍵，如改良聚醚砜膜材和聚偏二氟乙烯膜材表現(xiàn)出優(yōu)良通透性及低膜蛋白吸附率[18-19]。切向流過濾系統(tǒng)可減少富集物堆積，提高過濾效率[20]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪乳（實(shí)驗(yàn)室自制）；Lacprodan?MFGM-10（阿拉）；酪乳粉（恒天然）；0.22 μm Pellicon2Mini PVDF膜包（Milipore）；100 kDa Centramate T系列PES膜包（Pall）；BeyoGel? Plus PAGE預(yù)制膠、蛋白上樣緩沖液、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（10～150 kDa）、考馬斯亮藍(lán)快速染液、SDS-PAGE電泳液（Tris-Gly）（上海碧云天）。檸檬酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、無水氯化鈣（國(guó)藥集團(tuán)）；凝乳酶（DANSICO）。

1.2 儀器與設(shè)備

PROTEAN3電泳儀、Geldoc-XR+凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad）；CentramateTM table切向流過濾系統(tǒng)（Pall）；320型pH計(jì)（德國(guó)Mettler-Toledo）；Free-Zone-12L冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Labconco）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 預(yù)處理方式對(duì)分離效果的影響

1.3.1.1 凝乳酶處理法

1 kg酪乳加0.03%凝乳酶，pH 調(diào)至6.8后45 ℃水浴30～60 min，結(jié)束后將酪蛋白凝乳液攪拌破碎，靜置1 h，收集上清液[11]。上清液使用100 kDa濾膜分離：過膜壓力0.5 bar，溫度25 ℃。超濾結(jié)束后向截留液中倒入與滲透液體積等量去離子水，并在相同分離條件下進(jìn)行洗濾，重復(fù)5次，收集第1次截留液U0和經(jīng)5次洗濾后的截留液U5，進(jìn)行成分分析。

1.3.1.2 檸檬酸鈉處理法

1 kg酪乳加2%檸檬酸鈉解離，于4 ℃冷藏過夜[21]。解離液0.22 μm微濾分離，分離條件和洗濾過程同1.3.1.1小節(jié)。收集第1次截留液M0和經(jīng)過5次洗濾后的截留液M5，進(jìn)行成分分析。

1.3.2 洗濾次數(shù)對(duì)分離效果的影響

根據(jù)1.3.1小節(jié)成分分析結(jié)果，選擇合適的預(yù)處理方式。稱取預(yù)處理后酪乳500 g，過膜壓力0.5 bar、溫度25 ℃、料液pH 6.5過膜分離。洗濾重復(fù)8～10次，收集每次的截留液W0～W10，進(jìn)行成分分析。

1.3.3 膜分離條件對(duì)分離效果的影響

取預(yù)處理后酪乳500 g，進(jìn)行過膜條件優(yōu)化。按過膜壓力0.25，0.50，0.75，1.00和1.25 bar，分離溫度5，15，25，35和45 ℃，料液pH 5，6，7，8和9，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。洗濾5次，最終截留液即為MFGM富集物。記錄截留液質(zhì)量和入料酪乳質(zhì)量，計(jì)算非膜蛋白清除率。各因素各水平試驗(yàn)平行3次。

1.3.4 膜通量的測(cè)定

預(yù)處理后的酪乳進(jìn)行膜分離，收集截留液。對(duì)截留液多次洗濾。記錄每次洗濾后滲透液質(zhì)量M（kg），每次過濾時(shí)長(zhǎng)T（h），膜包的面積為A（m2），膜通量[kg/（m2·h）]按式（1）計(jì)算。

1.3.5 非膜蛋白去除率和膜蛋白保留率的測(cè)定

采用標(biāo)記型SDS-PAGE電泳法[22]對(duì)入料酪乳、截留液中非膜蛋白和膜蛋白進(jìn)行相對(duì)定量。用Image Lab進(jìn)行凝膠條帶分析。根據(jù)相對(duì)定量結(jié)果計(jì)算非膜蛋白去除率、膜蛋白保留率。結(jié)合試驗(yàn)記錄的MBM、MMFGM及N，非膜蛋白清除率及膜蛋白保留率按式（2）和（3）計(jì)算。

式中：MBM、MMFGM為酪乳和MFGM富集物的質(zhì)量（g）；NBM、NMFGM為酪乳和MFGM富集物上樣稀釋倍數(shù)；RCMFGM中非膜蛋白和RCBM中非膜蛋白為Image Lab分析的MFGM富集物和酪乳中非膜蛋白的相對(duì)含量（單位為1）。

1.4 數(shù)據(jù)分析和處理

采用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析；Design-Expert.V 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析；Image Lab進(jìn)行凝膠圖灰度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理方式對(duì)分離效果的影響

由圖1蛋白電泳結(jié)果可知，酪乳經(jīng)檸檬酸鈉和凝乳酶沉淀處理后5次洗濾，酪蛋白和乳清蛋白顯著降低，洗濾顯著提高非膜蛋白去除率。經(jīng)凝乳酶沉淀處理酪蛋白膠束后，酪蛋白含量顯著減少，同時(shí)膜蛋白也顯著減少，因?yàn)槔业鞍装l(fā)生凝聚時(shí)，部分乳清蛋白和膜蛋白被包裹在酪蛋白聚合體中[15]。圖2對(duì)比2種預(yù)處理方式對(duì)截留液中各類蛋白質(zhì)含量的影響，經(jīng)檸檬酸鈉處理，0.22 μm微濾得到的MFGM富集物中酪蛋白和乳清蛋白的去除率達(dá)48.6%和64%，且MFGM膜蛋白保留率可達(dá)70%。凝乳酶處理后經(jīng)100 kDa超濾得到的MFGM富集物中酪蛋白去除率接近100%，乳清蛋白去除率達(dá)60%，而膜蛋白損失較為嚴(yán)重，損失率達(dá)82.56%。Holzmuller等[11]采用凝乳酶處理酪蛋白后使用80 nm材質(zhì)膜包超濾分離，結(jié)果顯示酪蛋白、乳清蛋白去除率能達(dá)100%，各類膜蛋白損失率在20%～75%。凝乳酶處理會(huì)對(duì)膜蛋白造成無法避免的損失，優(yōu)化凝乳條件后膜蛋白損失也達(dá)50%～70%[23]。

圖1 檸檬酸鈉解離（上）后經(jīng)膜洗濾截留液和凝乳酶沉淀（下）后經(jīng)膜洗濾截留液的蛋白質(zhì)電泳圖

圖2 酪蛋白、乳清蛋白和MFGM膜蛋白保留率隨分離過程的變化

2.2 洗濾次數(shù)對(duì)分離效果的影響

單次膜分離會(huì)隨著濃縮倍數(shù)的增加，膜表面出現(xiàn)濃差極化效應(yīng)[24]，膜通量達(dá)到最大值后出現(xiàn)急劇下降趨勢(shì)，并趨于平穩(wěn)[17]。單次分離膜通量低，分離效果差，無法較好去除酪蛋白和乳清蛋白。補(bǔ)入洗濾液稀釋能使料液濃度下降，降低濃差極化效應(yīng)，恢復(fù)膜通量[25]，有效改善分離效果[26]。以水為洗濾液能在低離子強(qiáng)度條件下增加膠體斥力，避免MFGM片段間碰撞、解體，最大限度減少M(fèi)FG破損[27]。

2.2.1 洗濾次數(shù)對(duì)膜通量影響

圖3中洗濾至第5次時(shí)，膜通量趨于平穩(wěn)，洗濾第5次（W5）和第8次（W8）不存在顯著性差異（P＞0.05）。W5和W0～W3存在顯著性差異（P＜0.05）。膜通量趨于穩(wěn)定是因?yàn)樵诮?jīng)過5次洗濾后，料液中被截留的物質(zhì)不斷減少，并趨于穩(wěn)定，加水稀釋后固形物濃度趨于穩(wěn)定，膜通量也趨于定值[25]。

圖3 平均膜通量隨洗濾次數(shù)的變化

2.2.2 洗濾次數(shù)對(duì)蛋白的影響

圖4中非膜蛋白去除率隨洗濾次數(shù)增加呈上升趨勢(shì)，洗濾至第6次時(shí)達(dá)到最高值62.19%，之后趨于平穩(wěn)，這與Jukkola等[17]的研究結(jié)果類似。乳清蛋白洗濾第1次時(shí)達(dá)較高去除率約84.05%，隨洗濾次數(shù)增加，去除率保持恒定是因?yàn)椴糠秩榍宓鞍着c膜蛋白或MFGM片段通過二硫鍵結(jié)合[28]，被保留在截留液中無法去除，洗濾至第8次乳清蛋白去除率為87.88%。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)增加洗濾次數(shù)帶來的剪切力會(huì)使部分MFGM片段發(fā)生解體，造成MFGM上小粒徑物質(zhì)脫落[29]。因此洗濾次數(shù)5次較佳。

圖4 洗濾次數(shù)對(duì)非膜蛋白去除率的影響

2.3 分離條件對(duì)分離效果的影響

2.3.1 過膜壓力對(duì)分離效果的影響

如圖5所示，非膜蛋白去除率隨壓力增加先上升后下降，壓力0.5 bar時(shí)達(dá)最大值60.41%。一定壓力范圍內(nèi)，過膜壓力越大，膜滲透通量越高，蛋白滲透通量隨之增加[17]。試驗(yàn)采用切向流過濾裝置，壓力作用方向與膜面平行，可滲透的物質(zhì)靠膜上孔徑攔截，料液流速過快，減少料液與膜包接觸時(shí)間，造成小分子物質(zhì)進(jìn)入截留管道，因此去除率反而下降[20]。

圖5 過膜壓力對(duì)非膜蛋白去除率的影響

2.3.2 分離溫度對(duì)分離效果的影響

如圖6所示，非膜蛋白去除率隨溫度增加先上升后下降，溫度35 ℃時(shí)達(dá)最大值78.21%。溫度降低，料液黏度會(huì)增加，膜通量降低，造成膜部分堵塞[25]。溫度適當(dāng)升高，料液黏度降低，膜通透性增強(qiáng)。溫度超過40 ℃，乳清蛋白和料液中酪蛋白或MFGM片段結(jié)合，降低發(fā)生結(jié)合作用物質(zhì)的透過率，從而降低非膜蛋白去除率。同時(shí)適當(dāng)增加溫度能降低磷脂的膜透過率[12]，減少極性脂質(zhì)損失。

圖6 過膜溫度對(duì)非膜蛋白去除率的影響

2.3.3 料液pH對(duì)分離效果的影響

如圖7所示，pH從5～9時(shí)，非膜蛋白去除率先上升后下降，pH 7時(shí)達(dá)最大值77.07%，pH較低時(shí)，蛋白之間發(fā)生集聚，粒徑增大，部分非膜蛋白無法透過膜包，減少膜通透性。pH增至堿性時(shí)，非膜蛋白去除率逐漸下降，在堿性條件下，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生肽鍵斷裂或高級(jí)結(jié)構(gòu)改變[30]，發(fā)生聚集沉淀。在非中性條件下，膜包和蛋白所帶相反電荷會(huì)增多，增加相互排斥力。在中性條件下處于零電位，排斥力降到最小，增加了透過率[31]。Rombaut等研究發(fā)現(xiàn)膜分離時(shí)料液pH從4.6增至7.5，極性脂質(zhì)的保留率從64%升至98%[14]，pH接近中性能降低極性脂質(zhì)損失率。

圖7 料液pH對(duì)非膜蛋白去除率的影響

2.3.4 響應(yīng)面分析膜分離條件對(duì)分離效果的影響

2.3.4.1 試驗(yàn)結(jié)果

通過單因素試驗(yàn)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析過膜壓力、過膜溫度、料液pH對(duì)非膜蛋白去除率具有顯著影響，因此選取過膜壓力（A）、溫度（B）和料液pH（C）為自變量，以非膜蛋白去除率為響應(yīng)值（T），進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ突貧w方差分析

通過Design-Expert.V 8.0.6軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，二次多項(xiàng)回歸方程為T=78.48+2.01A-0.49B-0.97C-2.19AB+0.20AC+4.63BC-4.40A2-6.71B2-0.39C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)二次模型進(jìn)行系數(shù)顯著性檢驗(yàn)及回歸方差分析。結(jié)果表明，模型P=0.001 7＜0.01，表明模型差異極顯著，試驗(yàn)方案可靠。失擬項(xiàng)P=0.456 5＞0.05，表明該模型不存在失擬因素，該方程具有較好的擬合性。擬合系數(shù)R2=0.939 3，該模型能描述93.93%的響應(yīng)值結(jié)果，非膜蛋白去除率93.93%的變化來自于所選變量，具有代表性，可用于分離條件優(yōu)化。變異系數(shù)為2.74%，模型置信度較高，能較為準(zhǔn)確分析3個(gè)變量對(duì)酪乳得率的影響。最終確定：過膜壓力0.58 bar，溫度30.66 ℃，pH 6時(shí)，非膜蛋白去除率可達(dá)80.454 8%。

2.3.4.2 響應(yīng)面分析

圖8～圖10展示任意一個(gè)因素取零水平，其余2個(gè)因素對(duì)非膜蛋白去除率的交互影響。過膜壓力和溫度的交互作用強(qiáng)于溫度與pH和過膜壓力與pH之間的交互作用。

圖8 過膜壓力與料液溫度的交互影響

圖9 料液pH與過膜壓力的交互影響

圖10 料液pH與料液溫度的交互影響

2.3.4.3 條件優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)

考慮試驗(yàn)操作性，對(duì)條件作調(diào)整：過膜壓力0.6 bar，料液溫度31 ℃，料液pH 6。在此條件下制備非膜蛋白去除率79.07%，與理論值相近。經(jīng)優(yōu)化后非膜蛋白去除率從58.82%升至79.07%，顯著性提升20.25%（P＜0.05）。

2.4 自制MFGM富集物與市售產(chǎn)品對(duì)比

優(yōu)化工藝后制備MFGM富集物并冷凍干燥，與市售BMP、市售MFGM成分對(duì)比，由表4可知，相同固形物質(zhì)量的BMP中酪蛋白占蛋白含量約70%，膜蛋白占22.07%。市售MFGM中乳清蛋白含量占比較高為30.68%，酪蛋白含量顯著低于其他2組（P＜0.05）。自制MFGM中乳清蛋白占比為1.39%，比市售MFGM乳清蛋白（30.68%）降低29.29%（P＜0.05）。自制中膜蛋白占比41.81%，比市售提高8.79%。自制MFGM極性脂質(zhì)占固形物含量1.54%，與市售BMP（1.56%）無顯著性差異（P＞0.05），與市售MFGM相比顯著提高0.68%（P＜0.05），說明工藝優(yōu)化后制得的MFGM中極性脂質(zhì)損失較低。

表4 3種MFGM產(chǎn)品中各成分含量

3 結(jié)論

以黃油加工副產(chǎn)物酪乳為原料，并對(duì)MFGM分離純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，提高酪乳中非膜蛋白去除率，制得膜蛋白占比高，極性脂質(zhì)損失少的MFGM富集物。通過對(duì)比，選擇添加2%檸檬酸鈉解離酪蛋白預(yù)處理酪乳，選擇0.22 μm孔徑的聚偏氟乙烯微濾膜包作為分離MFGM膜包材料。確定微濾洗濾次數(shù)為5次，以非膜蛋白去除率為指標(biāo)優(yōu)化分離條件，確定過膜壓力0.6 bar、料液溫度31 ℃、料液pH 6條件下制得的MFGM富集物非膜蛋白去除率為79.07%，與未優(yōu)化分離條件的去除率相比提高20.25%。分離條件的優(yōu)化能顯著提高膜蛋白在MFGM富集物中的占比，減少非膜蛋白比例，同時(shí)保證極性脂質(zhì)保留率，純化效果較佳。