木耳多糖提取分離純化、結(jié)構(gòu)表征及生物活性研究進(jìn)展

殷紅，趙時(shí)荊，韓姍姍，高其芳，鞏超黨，張強(qiáng)*

1. 陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所（西安 710043）；2. 柞水中博金米菌業(yè)發(fā)展有限公司（商洛 711400）

食用菌是一大類食品，具有獨(dú)特的滋味和風(fēng)味，其中黑木耳又是常見的一種食用菌。黑木耳（Auricularia auricular）又叫木耳、木蛾、黑菜、云耳、丁楊，擔(dān)子菌門，木耳屬、木耳科，是一種珍貴的藥食同源膠質(zhì)真菌[1]。木耳資源大約占全世界的90%，中國和日本是木耳的主要產(chǎn)地。我國木耳主要集中在東北和秦嶺。黑木耳富含豐富的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、木耳多糖、礦物質(zhì)及維生素等，木耳多糖占木耳的65%，也是木耳主要的生物活性成分。木耳多糖有抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、抗衰老、降血脂、增強(qiáng)免疫力等多種生物功效。木耳多糖的活性成分與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，包括單糖組成、官能團(tuán)和糖苷鍵連接方式等都對(duì)活性有著不同的影響。20世紀(jì)70年代末到80年代Sone等[2]和Misaki等[3]研究發(fā)現(xiàn)黑木耳多糖中含有β-D-葡聚糖和酸性雜多糖，β-D-葡聚糖有水溶性和水不溶性2種。2種β-D-葡聚糖糖苷鍵連接類型一樣都是由β-（1→3）-糖苷鏈連接而成的，但取代基不同。近年來對(duì)木耳多糖的研究主要集中在提取工藝上，對(duì)木耳多糖的結(jié)構(gòu)研究越來越受到重視。對(duì)結(jié)構(gòu)表征和生物活性的影響離不開多糖的提取工藝，其主要的營養(yǎng)調(diào)節(jié)機(jī)制也成為未來開發(fā)新產(chǎn)品的主要研究方向。文章主要對(duì)黑木耳多糖的提取分離純化、結(jié)構(gòu)分析及生物活性現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，為木耳多糖在食品深加工及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供參考。

1 提取與分離純化

1.1 木耳多糖的提取

1.1.1 熱水浸提法

多糖的提取最常見的方法是熱水浸提法。由于熱水浸提法具有操作簡單、成本低等特點(diǎn)，常被大家所采用，多糖是易溶于水，但木耳本身高黏度、易吸水等特性，導(dǎo)致木耳多糖提取上的料液比大而操作困難，其耗時(shí)長。張海燕等[4]對(duì)黑木耳多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出在溫度100 ℃、液料比1∶70（g/mL）、提取時(shí)間4 h時(shí)，黑木耳多糖提取率可達(dá)到42.56%。張婧涵等[5]研究桑木耳多糖提取工藝，在溫度100℃、料液比1∶108（m/V）、時(shí)間3.5 h時(shí)桑木耳多糖提取率達(dá)6.96%，但重復(fù)提取10次后，多糖總得率升高到34.18%。木耳多糖熱水浸提法提取溫度一般在70℃以上，料液比根據(jù)木耳種類不同，適時(shí)調(diào)節(jié)，進(jìn)行重復(fù)浸提，提取率在30%以上。在提取工藝中，溫度和時(shí)間是至關(guān)重要的影響因素，影響著多糖的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物活性，所以水提法提取多糖過程中應(yīng)控制好工藝的各個(gè)影響因素。

1.1.2 超聲波提取法

超聲波提取是采用超聲波輔助溶劑進(jìn)行提取，通過聲波產(chǎn)生高速、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌作用，破壞細(xì)胞壁，使胞內(nèi)物質(zhì)得到釋放，溶劑滲透到細(xì)胞中，使得木耳多糖更快地溶出，從而縮短提取時(shí)間，提高提取率。因此超聲波提取多糖具有提取時(shí)間短、提取效率高的優(yōu)點(diǎn)。與熱水浸提法比，超聲波提取得到的多糖分子三螺旋結(jié)構(gòu)不被破壞而更加完整地被保留，但超聲波提取在時(shí)間上有局限性，不宜過長，否則多糖分子會(huì)斷裂，從而降低提取率且成本較大[6]。吳玉柱等[7]以玉木耳為原料，采用超聲波輔助法提取多糖，在功率210 W、液料比40∶1 mL/g、溫度62 ℃、時(shí)間29 min條件下，多糖的得率為7.43%。馬昱陽等[8]采用超聲波輔助酶提取毛木耳多糖，當(dāng)液料比40∶1（mL/g）、超聲波功率160 W、超聲波時(shí)間31 min、復(fù)合酶酶解溫度64 ℃時(shí)，多糖提取率為14.41%。

1.1.3 酶解提取法

酶解提取法是將各種酶添加到料液中，如蛋白酶、果膠酶、纖維素酶等，酶的作用使物質(zhì)細(xì)胞壁破裂，胞內(nèi)物質(zhì)流出，從而使多糖會(huì)更快地溶出到胞外，提高提取率。酶解提取操作簡單，提取率較高，多糖的結(jié)構(gòu)不被破壞，但為了保持酶活性，對(duì)提取溫度和pH有一定的局限性，所以在操作中要嚴(yán)格控制。黃藝寧等[9]在提取溫度50.2 ℃、纖維素酶添加量3 774 U/g、pH 4.9、提取時(shí)間135 min條件下，得到15.47%白背毛木耳子實(shí)體多糖的提取率。

1.1.4 微波提取法

微波提取法是利用一定強(qiáng)度的電磁波把能量傳播到組織內(nèi)部，在外加電場(chǎng)下使組織內(nèi)部的分子擺動(dòng)加速，產(chǎn)生摩擦，使溫度升高、壓力增高，加速組織裂解和細(xì)胞破裂，促進(jìn)多糖提取。林花等[10]以水為提取劑，料液比為1∶40，微波功率為800 W，浸提溫度為95 ℃，微波輻射時(shí)間為40 min，再用水浴浸提法提取，第一次加水400 mL、1.5 h，第二次加水500 mL、1.5 h，浸提2次，多糖提取率為19.30%。微波提取法在生產(chǎn)中可以節(jié)省成本，又節(jié)能、安全、高效。

綜上所述，木耳多糖的提取方法主要有熱水浸提法、超聲波提取法、酶解提取法、微波提取法或幾種聯(lián)用，不同的提取方法其多糖的提取率也有所不同，不同產(chǎn)地品種的木耳其提取率也不盡相同，所以在木耳多糖提取中要綜合考慮各方面因素，最終選擇合適的方法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。此外，還有一些利用高壓均質(zhì)法、超聲波協(xié)同半仿生法、超高壓微射流等提取木耳多糖，如：郝慧敏等[11]采用超聲波協(xié)同半仿生法提取黑木耳多糖的工藝，料液比1∶30（g/mL），超聲溫度60 ℃，超聲功率500 W，超聲時(shí)間 60 min時(shí)，黑木耳多糖提取率為22.52%；秦令祥等[12]采用動(dòng)態(tài)超高壓微射流技術(shù)提取黑木耳多糖，其最佳工藝條件為提取時(shí)間2 h、料液比1∶40（g/mL）、微射流壓力140 MPa、提取溫度90 ℃，黑木耳多糖得率為22.13%；孔沛筠等[13]采用高溫蒸汽浸提木耳多糖，料液比1∶50（g/mL）、提取溫度120 ℃，提取時(shí)間85 min，此時(shí)多糖得率為48.38%±1.64%。在多糖提取過程中，為不破壞其結(jié)構(gòu)和生物活性，建立一種快速、高效、得率高、活性好、成本低的木耳多糖提取方法有待研究者進(jìn)一步研究。

1.2 木耳多糖分離純化

木耳中的多糖溶于水后，需分離除去蛋白質(zhì)等其他大分子而達(dá)到單純的木耳多糖。木耳經(jīng)提取后得到的是粗多糖，還含有蛋白質(zhì)、脂肪、色素等大分子物質(zhì)，為了獲得單一的純多糖組分，必須除去粗多糖中一些非糖成分及雜質(zhì)后再進(jìn)一步分離純化，所以進(jìn)行脫蛋白、脫脂或脫色處理是必要的步驟。

脫蛋白的常用方法主要有Sevage法、三氟三氯乙烷、鞣酸法、三氯乙酸法、聚酰胺吸附法和酶解法。

木耳提取液中蛋白脫除后還有約1.2%的粗脂肪，根據(jù)相似相溶原理，一般采用有機(jī)溶劑脫除，如石油醚，也可采用超臨界脫脂法。木耳提取液經(jīng)過脫蛋白、脫脂處理后，溶液顏色較深，有時(shí)還需進(jìn)一步脫色。常用的是活性炭吸附、大孔樹脂吸附及過氧化氫氧化。活性炭脫色在吸附中會(huì)損失多糖，與其他兩種脫色方法比較大孔樹脂吸附更常用，對(duì)多糖損耗也較小。其他的一些小分子化合物通過透析、超濾等方法可以去除[14]。

經(jīng)過上述分離處理之后得到的粗多糖還需進(jìn)一步純化處理，為后續(xù)研究多糖的組成、結(jié)構(gòu)等奠定基礎(chǔ)。常用的純化方法有柱層析法、沉淀法和膜分離法。王理文[15]采用超聲提取法對(duì)玉木耳進(jìn)行了粗多糖的提取，并用Sevage法除去蛋白質(zhì)后，用DEAEcellulose-52柱分離出純化后的玉木耳多糖，其得率為487.23±12.23 mg/g。許海林[16]將2種黑木耳多糖AAP-10和AAP-80進(jìn)行分離純化，進(jìn)行DEAE-52離子交接層析分離純化，用不同濃度的NaCl溶液洗脫2種黑木耳多糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在去離子水、0.3%和1.5%濃度的NaCl溶液洗脫過程出現(xiàn)洗脫峰，且以1.5%濃度的NaCl溶液洗脫的為主峰，收集此組分，命名為AAP-10-Ⅲ和AAP-80-Ⅲ。對(duì)2種黑木耳多糖組分（AAP-10-Ⅲ和AAP-80-Ⅲ）進(jìn)行Sephacry1TMS-400HR凝膠層析柱分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種黑木耳多糖組分均一，命名為AAP-10-Se和AAP-80-Se。王銀平[17]使用DEAE-纖維素DE-52離子交換柱和Sepharose CL-6B凝膠柱對(duì)玉木耳多糖進(jìn)行分離純化，得到ACPN-1a，ACPN-1b，ACPA-1a，ACPA-1b，ACPA-2a。多糖的分離純化很復(fù)雜，所以通常選用2種或者2種以上的方法結(jié)合，得到純度較高的多糖。

2 木耳多糖結(jié)構(gòu)表征

多糖是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子物質(zhì)，多糖結(jié)構(gòu)與生物活性息息相關(guān)，對(duì)多糖結(jié)構(gòu)表征具有重要的研究意義。要研究木耳多糖的結(jié)構(gòu)，首先要知道多糖的純度、分子量大小，其次確定多糖的單糖組成、糖苷鍵種類，確定糖苷鍵的連接方式。明確結(jié)構(gòu)中哪些鍵影響著多糖的性質(zhì)。

2.1 木耳多糖純度鑒定及分子量的測(cè)定

木耳多糖的純度一般采用比旋光法和凝膠色譜法測(cè)定。比旋光度法是根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)來判定，相同結(jié)構(gòu)的多糖具有相同的旋光性。若某個(gè)多糖樣品在純化前后旋光度沒有變化，可認(rèn)為是均一多糖。凝膠色譜法采用HPLC，通過凝膠柱檢測(cè)樣品，形成的峰形為對(duì)稱的、單一的峰，則說明多糖為單一組分。

多糖的分子量大小一般從幾千萬到百萬以上，用不同的方法測(cè)定多糖分子量也不盡相同。多糖分子量分布比較分散，分子量的表征有采用HPLC測(cè)定的平均分子量Mp，滲透壓法測(cè)定的數(shù)均分子量Mn，光散射法測(cè)定的重均分子量Mw等。木耳多糖相對(duì)分子質(zhì)量在20～3 000 kDa之間。

2.2 木耳多糖結(jié)構(gòu)分析

多糖的結(jié)構(gòu)分為一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)。確定木耳多糖的結(jié)構(gòu)，要明確木耳多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)分子質(zhì)量、單糖組成、糖苷鍵類型及糖苷鍵連接方式。木耳多糖的相對(duì)分子量的測(cè)定通常采用高效凝膠滲透色譜法和高效液相凝膠色譜法。多糖的單糖組成及結(jié)構(gòu)決定著其生物活性。所以對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)鑒定首要知道其單糖組成，多糖的單糖組成檢測(cè)首先利用TFA將糖降解為單糖，由于缺少紫外吸收和熒光吸收基團(tuán)，需對(duì)多糖進(jìn)行衍生化處理之后再運(yùn)用高效液相色譜法、氣相色譜法、紙層色譜、薄層層析色譜、氣質(zhì)聯(lián)用等測(cè)定。通過傅里葉變換紅外光譜，檢測(cè)吡喃環(huán)或呋喃環(huán)形式。常用高碘酸氧化法、還原裂解、Smith降解和乙?；椒ㄅ袛嗵擒真I位置和相鄰單糖基的連接方式。對(duì)木耳多糖的高級(jí)結(jié)構(gòu)研究還比較少，常采用X射線衍射法、核磁共振技術(shù)、圓二色譜法、熒光分析法等，分析多糖的三維結(jié)構(gòu)和構(gòu)象。

木耳多糖單糖組成主要包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖還含有少量巖藻糖和阿拉伯糖。Sun等[18]從毛木耳子實(shí)體中提取得到的多糖單糖組成主要有葡萄糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖醛酸。Xu等[19]從黑木耳中分離純化出的水溶性中性多糖為β-（1→3）-D-glucan，含有β-（1→6）-D-Glcp側(cè)鏈；4個(gè)多糖組分的多糖純度幾乎都達(dá)到90%以上，且不含核酸和蛋白等；2個(gè)中性多糖（ACPN-1a和ACPN-1b）的分子量較大，分別為2.18×106Da和2.07×106Da；ACPA-1a展現(xiàn)較寬的分子量分布（5×105～2×106Da），ACPA-2a 的分子量約為 8.5 ×105Da；2個(gè)中性多糖組分（ACPN-1a和ACPN-1b），單糖組成主要都包括葡萄糖（96.17%和95.79%），2個(gè)酸性多糖組分（ACPA-1a和ACPA-2a）均為雜多糖，單糖組成主要包括甘露糖（44.85%和56.40%）、葡萄糖（16.17%和1.06%）、葡萄糖醛酸（9.35%和10.89%）、木糖（24.26%和28.52%）和其他少量的單糖。鄢為唯[20]研究的黑木耳多糖進(jìn)一步純化后單糖組成結(jié)果表明AAP1-20僅由葡萄糖（77.82%）組成，AAP1-60含有4種單糖，其中主要是甘露糖（51.91%）與木糖（43.62%），還含有少量的葡萄糖及半乳糖。甲基化分析結(jié)果表明，AAP1-20的主要?dú)埢?, 4,6-linked Glcp、1, 3, 6-linked Glcp、1, 6-linked Glcp和T-linked Glcp，其中1, 3, 6-linked Glcp含量最高；AAP1-60的主要?dú)埢═-linked Galp、1, 3-linked Xylp、1, 4, 6-linked Manp、1, 4-linked Manp和1,6-linked Glcp，其中1, 4-linked Manp含量最高，并且2種組分的分支度都較高。王秀秀[21]研究2種不同方法提取的木耳多糖的單糖組成，主要含有葡萄糖、木糖、半乳糖、巖藻糖和甘露糖。劉茜等[22]采用熱水浸提法提取西北秦巴山區(qū)黑木耳多糖，單糖主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖組成，相對(duì)摩爾百分比為60.87∶20.83∶9.86。Ma等[23]分離的水溶酸性黑木耳多糖經(jīng)過氣相-質(zhì)譜法和核磁共振法分析其結(jié)構(gòu)，由α-（1-3）-甘露聚糖為主鏈，在0-6或0-2位上連接β-D-木糖、β-D-葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸。苗晶囡等[24]提取出一種黑木耳酸性多糖，通過測(cè)定發(fā)現(xiàn)其是由葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、木糖和半乳糖組成。秦丹丹[25]采用高效液相色譜（HPLC）、凝膠滲透層析色譜（GPC）、紅外光譜（FT-IR）及核磁共振氫譜（1H NMR）分析C-EAAP的結(jié)構(gòu)。試驗(yàn)結(jié)果表明，C-EAAP主要由甘露糖（57.1%）、葡萄糖（22.5%）、葡萄糖醛酸（10.0%）、木糖（6.0%）、半乳糖（2.9%）、巖藻糖（1.1%）和鼠李糖（0.4%）構(gòu)成。AAP和C-EAAP均含有α、β這2種糖苷構(gòu)型。

由于木耳產(chǎn)地不同，分類有黑木耳、毛木耳、玉木耳等，對(duì)木耳多糖的提取及分離純化的方法也不盡相同，木耳多糖在相對(duì)分子量、單糖組成和結(jié)構(gòu)表征上都存在差異。對(duì)木耳多糖的單糖組成主要由葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖構(gòu)成，糖苷鍵連接方式也不同，主要由α、β-D-1, 3-葡萄糖和α、β-D-1, 6-葡萄糖連接。

3 木耳多糖生物活性

黑木耳多糖中含有多種糖組分，國內(nèi)大量研究表明這些多糖組分具有抗腫瘤、抗凝血、抗氧化、抗血栓、提高免疫力、抗炎抗病毒等多種生物活性功能。木耳多糖的提取工藝和結(jié)構(gòu)特征對(duì)其生物活性有很大影響。

3.1 抗腫瘤作用

多糖對(duì)腫瘤有抑制作用，從而提高細(xì)胞的免疫活性，其原因可能是多糖改變了細(xì)胞膜成分，使細(xì)胞膜上脂肪酸呈游離狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，要進(jìn)一步研究抗腫瘤機(jī)制，需要更深入地了解多糖的結(jié)構(gòu)特征。甘霓等[26]研究不同濃度黑木耳多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和傷痕愈合率的影響。結(jié)果表明，黑木耳多糖在體內(nèi)外都有明顯抗腫瘤作用，與環(huán)磷酰胺聯(lián)合使用，抑制率隨著多糖的濃度增加而也大大提高。

3.2 免疫作用

免疫活性的高低與多糖的結(jié)構(gòu)也有一定的關(guān)系，黑木耳多糖的β構(gòu)型、多糖的（1→3）、β-（1→6）糖苷鍵有較高的免疫活性。高濃度的木耳多糖，對(duì)傷口愈合有促進(jìn)作用。修飾后的木耳多糖其抗病毒活性也會(huì)增加，可作為新型抗病毒藥物的組成。許海林[16]研究2種木耳多糖組分在環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠模型中的免疫調(diào)節(jié)活性。得到的2種多糖組分對(duì)小鼠脾臟指數(shù)和巨噬細(xì)胞的吞噬功能、脾淋巴細(xì)胞增殖和NK細(xì)胞活性均有所提高，說明這2種木耳多糖組分對(duì)免疫細(xì)胞都有影響。

3.3 降血糖、血脂作用

研究黑木耳多糖的降血糖、血脂效果，采用正常小鼠和模型小鼠對(duì)比，木耳多糖能降低血糖水平，血脂水平。說明黑木耳多糖和酯化后多糖不僅降低血糖值，而且促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)化為肝糖原，增加肝糖的原合成。通過檢測(cè)小鼠血清中低密度脂蛋白（LDL）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和高密度脂蛋白（HDL）4個(gè)指標(biāo)，對(duì)LDL、TG、和TC水平有顯著降低，HDL水平有所升高，所以多糖能夠調(diào)節(jié)血脂[27]。

3.4 抗衰老作用

抗衰老作用可通過檢測(cè)自由基清除或者建立小鼠模型，對(duì)小鼠血漿、小鼠血清、肝臟及腦中SOD、MDA及GSH-PX進(jìn)行測(cè)定，黑木耳多糖能起到抗衰老的作用[28]。

3.5 抗氧化作用

從黑木耳中分離純化得到不同的多糖組分，通過超氧陰離子和羥基自由基、Fe2+螯合能力檢測(cè)木耳多糖的抗氧化活性，研究發(fā)現(xiàn)多糖抗氧化活性與其所含糖醛酸的量呈正相關(guān)。說明含有糖醛酸的黑木耳多糖濃度越高，其抗氧化活性越強(qiáng)。張磊等[29]采用酶解法提取2種不同的食藥用真菌多糖，均具有清除自由基作用。在同一濃度條件下，木耳多糖清除率優(yōu)于其他多糖。王秀秀[21]以羥基、超氧陰離子和DPPH自由基清除率及還原力為指標(biāo)，分析2種木耳多糖的體外抗氧化性活性，結(jié)果表明它們都具有一定抗氧化活性。孔沛筠等[13]通過清除試驗(yàn)、ABTS+·自由基清除試驗(yàn)及DPPH·清除試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)木耳多糖具有良好的天然抗氧化活性。

3.6 抑菌作用

多糖抑菌作用即對(duì)病原菌的殺傷能力，不僅要抑制更重要的還要能夠修復(fù)調(diào)節(jié)受損傷的機(jī)體，從而提高機(jī)體免疫力和對(duì)病原菌的防御功能。黑木耳多糖不僅對(duì)細(xì)菌有抑制，對(duì)部分真菌酵母菌也有抑制作用，對(duì)霉菌沒有明顯的抑制作用[30]。

4 展望

木耳是一種藥食同源的食用菌，營養(yǎng)豐富、分布廣泛，木耳多糖作為天然的高分子化合物，具有一系列生物活性功能如，提高免疫力、抗腫瘤等。將木耳多糖可作為一種新型藥物開發(fā)，替代一些抗生素等藥物來治療疾病，具有廣泛的市場(chǎng)前景。由于木耳本身膠質(zhì)吸水特性，分子量大，空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點(diǎn)，在研究木耳多糖方面具有一定的難度。對(duì)木耳多糖研究主要集中在多糖的提取工藝和一級(jí)結(jié)構(gòu)表征包括單糖組成、分子量大小、糖苷鍵類型和連接方式上，對(duì)其高級(jí)結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)研究還不夠深入，為進(jìn)一步明確活性效應(yīng)機(jī)制，探究木耳多糖結(jié)構(gòu)與活性的互作關(guān)系，木耳多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)表征鑒定，增加動(dòng)物模型確定活體應(yīng)用下的多糖效果與機(jī)制，提高臨床應(yīng)用等，對(duì)開發(fā)新型藥物或者功能性食品發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

5 結(jié)語

木耳多糖屬于大分子物質(zhì)，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，本身有著高吸水性和膠質(zhì)性，所以選取合適的提取工藝有利用提高木耳多糖的得率。此次研究為木耳多糖的深加工及產(chǎn)業(yè)提供理論參考，推動(dòng)小木耳、大產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。