以殼聚糖為基底的分子印跡電化學(xué)傳感器研究及倍硫磷測(cè)定

凌 俊，楊光煒，李建平，2*

（1.桂林理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣西 桂林 541004；2.桂林理工大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 桂林 541004）

倍硫磷是一種中等毒性、應(yīng)用廣泛、殘效期長(zhǎng)的有機(jī)磷殺蟲劑［1］，其在環(huán)境中具有一定的持久性，可通過進(jìn)入水體和食物鏈對(duì)人和動(dòng)物構(gòu)成威脅［2-3］。因此，環(huán)境中倍硫磷的檢測(cè)受到人們的廣泛關(guān)注。目前常用的倍硫磷檢測(cè)方法主要有氣相色譜法［4］、液相色譜法［5］、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等［6］，但這些方法對(duì)復(fù)雜樣品中微量物質(zhì)的測(cè)定存在耗時(shí)，樣品處理過程繁雜，且需要復(fù)雜的大型儀器以及訓(xùn)練有素的專業(yè)檢測(cè)人員等缺點(diǎn)［7］，難以用于日常篩查。因此，急需開發(fā)一些成本低、操作簡(jiǎn)單、選擇性好、靈敏度高的農(nóng)藥分析方法。

分子印跡聚合物（MIP）電化學(xué)傳感器集分子印跡技術(shù)的高效識(shí)別特性與電化學(xué)分析靈敏度高、檢測(cè)快速、儀器簡(jiǎn)便、易于小型化等優(yōu)點(diǎn)于一體，廣泛應(yīng)用于環(huán)境樣品中微量污染物的分析測(cè)定［8-11］。但利用MIP 電化學(xué)傳感器測(cè)定倍硫磷少有文獻(xiàn)報(bào)道［12］，已有方法的靈敏度低（檢出限僅為0.05μg/g），不能滿足痕量倍硫磷的檢測(cè)要求。提高M(jìn)IP 電化學(xué)傳感器檢測(cè)方法的靈敏度一直是分析工作者的研究熱點(diǎn)［12］。利用門控制效應(yīng)能顯著提高印跡傳感器檢測(cè)的靈敏度［14-15］。該法利用模板分子洗脫后，以MIP 上留下的印跡孔穴作為電極與溶液界面上的“門”控制從底液到達(dá)電極的探針離子的量。由于底液中的探針濃度高，開啟少量“門”即可使大量探針進(jìn)入，導(dǎo)致電流急劇增加，產(chǎn)生類似三極管的放大效應(yīng)。然而，基于擴(kuò)散電流檢測(cè)的伏安分析方法靈敏度仍有待提高。

殼聚糖是自然界唯一的堿性多糖，價(jià)格低廉，具有良好的粘附性和成膜特性。目前，利用殼聚糖構(gòu)建分子印跡傳感器已有較多報(bào)道［16-18］，然而這些方法中殼聚糖僅作為印跡膜用于模板分子的識(shí)別或僅用于固定功能材料。研究表明殼聚糖分子鏈上分布大量氨基［19-20］，這些氨基在酸性條件下帶正電，能與陰離子以靜電引力結(jié)合［21］，并將陰離子或絡(luò)陰離子吸附于電極表面［22］，從而產(chǎn)生遠(yuǎn)大于擴(kuò)散電流的吸附電流。據(jù)此，本文首次提出了基于殼聚糖修飾層增敏的MIP-門控制效應(yīng)測(cè)量法，并考察了殼聚糖修飾層的增敏效果。通過將殼聚糖修飾至電極，并在其表面電聚合制備倍硫磷的MIP 膜，得到MIP 電化學(xué)傳感器。由于殼聚糖能夠通過靜電引力對(duì)帶負(fù)電的鐵氰酸根陰離子探針產(chǎn)生吸附和富集作用，導(dǎo)致電流信號(hào)急劇增加，方法靈敏度顯著提高，可用于環(huán)境樣品中痕量倍硫磷的測(cè)定。傳感器的制備和檢測(cè)原理見圖1。

圖1 殼聚糖增敏的MIP傳感器的制備過程和檢測(cè)原理Fig.1 Preparation process and detection principle of chitosan-sensitized MIP sensor

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Autolab PGSTAT128N 工作站（Eco Chemie，Utrecht，瑞士）；CHI660E 電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；三電極體系（武漢高仕睿聯(lián)科技有限公司）：鉑絲電極為對(duì)電極，Ag/AgCl電極為參比電極，玻碳電極為工作電極；pHS-2C型精密酸度計(jì)（上海雷磁精密儀器有限公司）。

倍硫磷和鄰苯二胺購自上海阿拉丁生化科技有限公司；無水乙醇、硝酸、乙酸、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、氯化鉀、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉購自西隴科學(xué)股份有限公司。所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 MIP電化學(xué)傳感器的制作

將玻碳電極依次使用0.3、0.05μm 氧化鋁粉在麂皮上打磨拋光后，依次用體積比為1∶1 的硝酸、無水乙醇及水將電極洗凈，晾干備用。

取10μL經(jīng)1%乙酸配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.16%的殼聚糖溶液，滴涂到電極表面，在60 W的白熾燈下照射干燥20 min，得到殼聚糖修飾的電極。

將殼聚糖修飾的電極放至含50 mg/L倍硫磷和1×10-3mol/L鄰苯二胺的PBS緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 7.4）中電聚合制備倍硫磷的MIP膜。電聚合方法為循環(huán)伏安法（CV），在0 ～0.8 V電位下掃描20圈，掃描速率為50 mV/s。將聚合MIP膜的電極用水沖洗，自然放干后，放入乙酸-乙醇（1∶8，體積比）洗脫液中緩慢攪拌，將MIP膜上的倍硫磷洗脫后，即制得有倍硫磷印跡孔穴的MIP電化學(xué)傳感器。電聚合MIP膜的步驟中不加入倍硫磷，其他實(shí)驗(yàn)條件相同，以此制備非分子印跡（nMIP）電化學(xué)傳感器作比較。

1.3 測(cè)試方法

電化學(xué)測(cè)試在5×10-3mol/L 鐵氰化鉀溶液中進(jìn)行。用CV 和交流阻抗法（EIS）對(duì)分子印跡膜進(jìn)行表征，CV 的掃描電位為-0.2 ～0.6 V，掃描速率為50 mV/s，EIS 的交變電壓為5 mV，頻率范圍為100 mHz ～100 kHz。

樣品測(cè)試時(shí)，將制備好的電極放入待測(cè)液中，重吸附270 s，用水沖洗電極后，轉(zhuǎn)移至5×10-3mol/L中，吸附富集90 s，用差分脈沖伏安法（DPV）進(jìn)行電化學(xué)信號(hào)測(cè)試，掃描電位為-0.2 ～0.6 V，振幅為0.05 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 MIP電化學(xué)傳感器的電化學(xué)表征

2.1.1 循環(huán)伏安法表征以作為探針，對(duì)MIP 電化學(xué)傳感器進(jìn)行電化學(xué)表征。結(jié)果如圖2A 所示，曲線a 表明探針在玻碳電極上有明顯的氧化還原峰，這是因?yàn)樵陔姌O表面發(fā)生了氧化還原反應(yīng)；將殼聚糖修飾在玻碳電極上（曲線b），由于殼聚糖帶正電，通過靜電作用對(duì)陰離子探針進(jìn)行吸附富集，氧化還原峰明顯增大；當(dāng)在殼聚糖修飾的電極表面電聚合形成MIP膜后（曲線c），由于電極表面形成了一層致密且導(dǎo)電性差的MIP膜，其氧化還原峰基本消失；對(duì)MIP膜上的倍硫磷進(jìn)行洗脫（曲線d），留下與倍硫磷三維結(jié)構(gòu)相匹配的印跡孔穴，這些印跡孔穴可為探針提供傳遞通道，氧化還原峰明顯增大；但隨著MIP 的重吸附后（曲線e），印跡孔穴對(duì)倍硫磷進(jìn)行識(shí)別與吸附，導(dǎo)致傳遞通道堵塞，氧化還原峰減小。由于nMIP膜不存在倍硫磷，洗脫后不會(huì)產(chǎn)生倍硫磷的印跡孔穴，因此在聚膜（曲線f）、洗脫（曲線g）和重吸附（曲線h）過程中，氧化還原峰無明顯變化。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MIP膜制備成功，該MIP電化學(xué)傳感器對(duì)倍硫磷具有特異性識(shí)別能力。顯然，門控制效應(yīng)原理是上述CV法表征的依據(jù)。

圖2 分子印跡電化學(xué)傳感器的CV（A）及EIS（B）表征Fig.2 CV（A）and EIS（B）characterization of molecularly imprinted electrochemical sensora. bare GCE；b. chitosan-modified GCE；c. electropolymerization MIP；d. after MIP elution；e. after MIP resorption；f. electropolymerization nMIP；g. after nMIP elution；h. after nMIP resorption

2.1.2 交流阻抗表征采用交流阻抗法表征該MIP 電化學(xué)傳感器在制備和使用的不同階段時(shí)，其電極表面阻抗的變化（見圖2B）。結(jié)果顯示，玻碳電極的阻抗很小（曲線a）；修飾殼聚糖后電極的阻抗依然很?。ㄇ€b）；在修飾殼聚糖的電極表面電聚合MIP膜后，由于MIP膜致密且導(dǎo)電性差，阻抗急劇增大（曲線c）；將MIP上的倍硫磷洗脫后，印跡膜上出現(xiàn)印跡孔穴，探針可通過通道到達(dá)電極表面，阻抗減?。ㄇ€d）；MIP傳感器上的印跡膜重吸附倍硫磷后，部分印跡孔穴被重新占據(jù)，探針的傳遞通道減少，電極表面阻抗增大（曲線e）。該EIS 表征結(jié)果與CV 表征結(jié)果基本一致，證明對(duì)倍硫磷有識(shí)別能力的MIP電化學(xué)傳感器已成功制備。

2.2 殼聚糖對(duì)測(cè)量信號(hào)的影響

考察了修飾殼聚糖后對(duì)MIP電極信號(hào)的影響。圖3中a0和b0分別為洗脫后的殼聚糖修飾MIP電極和無殼聚糖MIP 電極在5 × 10-3mol/L Fe溶液中的空白電流曲線，a 和b 分別為吸附50 pg/mL 倍硫磷后的電流曲線?？煽闯鰵ぞ厶切揎桵IP 電極的空白信號(hào)明顯高于無殼聚糖修飾MIP 電極；而吸附相同濃度倍硫磷后，殼聚糖修飾MIP 電極的電流變化值ΔIa明顯大于無殼聚糖修飾MIP 電極的ΔIb，前者約為后者的2.6倍。

圖3 殼聚糖的加入對(duì)測(cè)量信號(hào)的影響Fig.3 Effect of chitosan on the measurement signala0 and a were chitosan-modified MIP electrode in blank solution and 50 pg/mL fenthion；b0 and b were the molecularly imprinted sensor without chitosan modification in blank solution and 50 pg/mL fenthion，respectively

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 殼聚糖滴涂量的優(yōu)化考察了殼聚糖滴涂量對(duì)電流信號(hào)的影響。在2 ～10μL 范圍內(nèi)，隨著殼聚糖滴涂量的增加，電極表面逐漸形成殼聚糖修飾層，實(shí)現(xiàn)對(duì)探針的吸附富集，導(dǎo)致電化學(xué)信號(hào)逐漸增大；而當(dāng)?shù)瓮苛砍^10μL時(shí)，電流值反而逐漸減小。這是由于殼聚糖修飾層厚度較大時(shí)，電極導(dǎo)電性變差，電流反而減小。因此，選擇殼聚糖的最佳滴涂量為10μL。

2.3.2 MIP 膜模板分子洗脫和重吸附時(shí)間的優(yōu)化考察了MIP 的洗脫時(shí)間和重吸附時(shí)間的影響，結(jié)果如圖4所示。隨著洗脫時(shí)間的增加，倍硫磷不斷被洗脫，孔穴增多，產(chǎn)生的信號(hào)增大，但當(dāng)洗脫到120 s 時(shí)，信號(hào)基本不變，表明MIP 電化學(xué)傳感器已基本洗脫完成，故選擇最佳洗脫時(shí)間為120 s（圖4 曲線a）。在30 ～270 s 內(nèi)，隨著吸附時(shí)間的增加，倍硫磷的吸附量逐漸增加，導(dǎo)致印跡孔穴被堵塞，探針的電信號(hào)減少；當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)270 s 時(shí)，吸附達(dá)到飽和，電流值保持不變。因此，選擇270 s為最佳重吸附時(shí)間。

圖4 洗脫時(shí)間（a）及重吸附時(shí)間（b）的優(yōu)化Fig.4 Optimization of elution time（a）and resorption time（b）

2.3.3 探針吸附富集時(shí)間的優(yōu)化殼聚糖在靜電作用下對(duì)陰離子探針進(jìn)行吸附富集。因此，考察了探針的吸附富集時(shí)間對(duì)電流信號(hào)的影響。結(jié)果表明，在0 ～90 s 內(nèi)，隨著吸附時(shí)間不斷增加，電流信號(hào)不斷變大；當(dāng)吸附時(shí)間超過90 s時(shí)，電流信號(hào)趨于平穩(wěn)，表明殼聚糖對(duì)探針已吸附飽和。因此，選擇最佳吸附時(shí)間為90 s。

2.4 MIP電化學(xué)傳感器的分析性能

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，將制備好的MIP電化學(xué)傳感器置于不同濃度的倍硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液中進(jìn)行重吸附270 s，放入Fe（CN）4-6/Fe（CN）3-6中對(duì)探針進(jìn)行吸附富集90 s，然后用DPV 法記錄電流值，結(jié)果如圖5所示。隨著倍硫磷質(zhì)量濃度的增大，電流信號(hào)逐漸減小，表明MIP對(duì)倍硫磷的吸附量不斷增加。其中，電流變化值（ΔI）與倍硫磷濃度在1 ～10000 pg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，線性方程為ΔI=23.09logC（pg/mL）+12.65，線性相關(guān)系數(shù)r2=0.9981。根據(jù)檢出限（DL）=3δb/K計(jì)算得到DL為0.35 pg/mL。與其他倍硫磷檢測(cè)方法相比，本方法具有更低檢出限（表1）。

圖5 重吸附不同濃度倍硫磷溶液后的DPV響應(yīng)曲線及校準(zhǔn)曲線Fig.5 DPV response curves and calibration curve after resorption of different concentrations of fenthion fenthion concentration（a-m）：0，1，2.5，5，25，50，100，250，500，1000，2500，5000，10000 pg/mL

表1 不同倍硫磷檢測(cè)方法的性能比較Table 1 Performance comparison of different methods for the detection of fenthion

2.5 MIP電化學(xué)傳感器的選擇性

為了驗(yàn)證分子印跡電化學(xué)傳感器的特異性識(shí)別能力，考察了質(zhì)量濃度為50 ng/mL（100 倍）的草甘膦、氟樂林、氟蟲腈、甲基對(duì)硫磷、殺草強(qiáng)、西維因等農(nóng)藥對(duì)測(cè)定500 pg/mL倍硫磷的影響。將制備的傳感器分別放入上述干擾物中進(jìn)行重吸附后，進(jìn)行電信號(hào)的檢測(cè)（圖6）。結(jié)果顯示，這些農(nóng)藥對(duì)倍硫磷的干擾較小，表明該傳感器具有良好的選擇性。

圖6 MIP電化學(xué)傳感器的選擇性Fig.6 Selectivity of MIP electrochemical sensor

2.6 傳感器的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

在相同條件下制備5個(gè)傳感器，對(duì)質(zhì)量濃度為500 pg/mL 倍硫磷的信號(hào)變化進(jìn)行考察，5 支電極的電流值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%，說明該傳感器的重現(xiàn)性良好。

將制備好的MIP電極置于5 ℃冰箱中保存不同時(shí)間后對(duì)500 pg/mL 倍硫磷溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，放置3 d 后對(duì)倍硫磷的響應(yīng)值減小1.1%，7 d后減小3.6%，15 d 后僅減小5.9%。說明該傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

2.7 實(shí)際樣品的檢測(cè)

為考察該MIP 電化學(xué)傳感器實(shí)際應(yīng)用的可行性，對(duì)蔬菜水果中的倍硫磷進(jìn)行檢測(cè)。稱取來源于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的蔬菜水果各10 g，剪碎，加入10 mL乙腈作為提取劑，經(jīng)超聲、離心后，取上清液，放進(jìn)5 ℃冰箱待用。將制備好的MIP 電化學(xué)傳感器置于待測(cè)液中重吸附270 s 后，放入Fe（CN）4-6/Fe（CN）3-6中吸附富集90 s，再測(cè)量DPV 電流信號(hào)。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)傳感器的實(shí)際性能進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。分析結(jié)果的加標(biāo)回收率為99.0%～109%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.9%～2.9%。表明該傳感器在實(shí)際檢測(cè)中具有較好的檢測(cè)效果。

表2 蔬菜水果樣品中倍硫磷的檢測(cè)及加標(biāo)回收率Table 2 Detection and recovery of fenthion in vegetable and fruit samples

3 結(jié)論

本文研制了殼聚糖修飾的倍硫磷分子印跡電化學(xué)傳感器，利用殼聚糖對(duì)探針陰離子的富集作用，提高分子印跡傳感器檢測(cè)的靈敏度。該傳感器對(duì)倍硫磷的測(cè)定檢出限達(dá)0.35 pg/mL，已應(yīng)用于蔬菜水果樣品中倍硫磷的測(cè)定。本方法靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好。這種利用殼聚糖對(duì)探針陰離子的富集作用提高靈敏度的檢測(cè)方法為研制其它分子印跡傳感器提供了有益的借鑒。