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    基于溴化銀-銀-碳納米管復(fù)合物與核酸適配體的陰極光電化學(xué)傳感器檢測赭曲霉素A

    2022-08-17 01:39:24周建紅令玉林曾伯平鄧克勤
    分析測試學(xué)報(bào) 2022年8期
    關(guān)鍵詞:光電子光電流陰極

    周建紅,令玉林,曾伯平,張 衡,鄧克勤

    (1.遵義師范學(xué)院 生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,貴州 遵義 563006;2.遵義師范學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院,貴州 遵義 563006;3.湖南科技大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,湖南 湘潭 411201)

    赭曲霉素A(OTA)是幾種菌株的有毒次生代謝物,其毒性大、分布范圍廣,易對農(nóng)產(chǎn)品、食品造成污染[1-2]。由于人類與OTA 的過度接觸具有致畸、致癌等風(fēng)險(xiǎn),世界不同的國家和組織均制定了嚴(yán)格的OTA限量標(biāo)準(zhǔn)。如歐盟委員會(huì)(EU)對谷物產(chǎn)品中的OTA限量小于3μg/kg[3],中國國家標(biāo)準(zhǔn)限定谷類、豆類中的OTA標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)低于5μg/kg[4]。

    OTA 常見的檢測方法有色譜法[5-6]和免疫分析法[7-8]。適配體傳感器作為一種成本低廉、制備簡單、靈敏度高的分析技術(shù)[9-11],也被用于OTA 的檢測,并顯示了對目標(biāo)分子的特異性生物識(shí)別能力。近年來,新涌現(xiàn)的光電化學(xué)傳感器(尤其是陰極光電化學(xué)傳感器)具有操作方便、背景低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),引起了廣泛關(guān)注[12-16],進(jìn)一步開發(fā)特殊的陰極光電活性材料可提高陰極光電化學(xué)傳感器的性能。AgBr 具有光學(xué)不穩(wěn)定性,通過部分被還原為金屬Ag 顯示的局域表面等離子體共振效應(yīng)(LSPR)可提高光吸收效率。此外,金屬Ag 的LSPR 效應(yīng)還與周圍介質(zhì)密切相關(guān),通過采用各種支撐材料(如g-C3N4、CNTs、BiOI等)優(yōu)化金屬Ag附近的電場,可增強(qiáng)光吸收,提高光活性材料的性能[15-16]。

    目前,基于OTA 適配體的陰極光電化學(xué)傳感器研究不多。本文通過簡單的水熱法和光還原法制備了AgBr-Ag-CNTs,利用金屬Ag 的LSPR 效應(yīng)和CNTs優(yōu)異的電子傳輸性能,將AgBr 的光生電子快速傳輸給溶液中的光電子受體K3[Fe(CN)6],有效地降低了光生電子——空穴復(fù)合,顯著提升了陰極光電流強(qiáng)度;進(jìn)一步采用AgBr-Ag-CNTs 作為陰極傳感界面固定OTA 核酸適配體,對目標(biāo)分子進(jìn)行特異性識(shí)別,因形成的適配體/OTA 配合物具有剛性的三級(jí)結(jié)構(gòu)和弱導(dǎo)電性,能有效阻礙傳感界面對光的吸收及抑制光電子向電子受體傳遞[17],顯著降低光電流信號(hào)(原理如圖1 所示),以此構(gòu)建了用于檢測OTA 的光電適配體傳感器。本傳感器制備簡單、成本低、靈敏度高、抗干擾強(qiáng),可用于實(shí)際樣品中OTA的測定,具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

    圖1 檢測OTA的示意圖Fig.1 Schematic diagram for detection of OTA

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器與試劑

    采用X-射線光電子能譜(XPS,PHI5300)、掃描電子顯微鏡(SEM,Sigma 500,德國Zeiss公司)、能量色散光譜儀(EDS,XFlash 6130,布魯克科技有限公司)、X-射線衍射儀(XRD-6000,日本島津公司)表征材料。光電測試使用光電化學(xué)系統(tǒng)(PEAC 200A,天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司)和CHI 760C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)。實(shí)驗(yàn)采用LED白光光源(20 mW/cm2),三電極體系分別為ITO工作電極、Pt絲對電極和飽和甘汞輔助電極(SCE)。

    碳納米管(CNTs,直徑20 ~30 nm,長度0.5 ~2.0 μm)、AgNO3、K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]、KBr、乙醇胺、殼聚糖(CS)、Tris-HCl、戊二醛(GLD)購于上海阿拉丁公司。玉米赤霉烯酮(ZEA)、赭曲霉素A(OTA)、赭曲霉素B(OTB)、黃曲霉素B1(AFB1)由英格蘭New England Biolabs,Inc. 提供。OTA 的核酸適配體5’-NH2-(CH2)6-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3′由上海生工公司合成。所用試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

    1.2 AgBr-Ag-CNTs的制備

    先將多壁碳納米管(CNTs)在濃HNO3和H2SO4(3∶1,體積比)中酸化處理[18],然后采用溶劑熱法制備AgBr-Ag-CNTs。具體方法如下:分別使用25 mL 乙二醇溶解240 mg KBr 和340 mg AgNO3,將20 mg CNTs 加入AgNO3溶液中,緩慢磁攪拌1 h 后,將KBr 溶液緩慢滴加到上述懸浮液中,攪拌30 min,置于紫外光下照射1 h 后,將混合液倒入高壓反應(yīng)釜中,160 ℃下加熱6 h,離心、洗滌并干燥,制得AgBr-Ag-CNTs。為了比較性能,采用相似方法,在不加入CNTs 的條件下制備AgBr-Ag。AgBr也在無CNTs和紫外光照下制得。

    1.3 核酸適配體傳感器的制備與OTA的檢測

    將AgBr-Ag-CNTs分散在0.1%殼聚糖(CS)溶液中,取8μL AgBr-Ag-CNTs分散液(5.0 mg/mL)滴于潔凈的ITO表面,干燥后,用戊二醛(2.5%)活化CS膜30 min,然后將8μL核酸適配體(1.0μmol/L)滴于ITO表面并在4 ℃下培育12 h,最后用乙醇胺封閉活性位點(diǎn)30 min。傳感器在制備過程的每一步都需仔細(xì)清洗。

    OTA的檢測采用Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl和20 mmol/L MgCl2,pH 8.0)。取10μL不同濃度的OTA樣品溶液滴加至傳感器表面,室溫反應(yīng)30 min,洗凈。在0.1 V電壓下,以0.1 mol/L KCl為電解質(zhì)溶液,20μmol/L K3[Fe(CN)6]作為光電子受體,檢測傳感器與OTA反應(yīng)前/后的光電流強(qiáng)度(I0/I)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 材料的表征

    利用掃描電鏡(SEM)表征了AgBr-Ag-CNTs復(fù)合物的形貌和尺寸。從圖2A可觀察到,復(fù)合物呈類立方體形態(tài),CNTs嵌入或覆蓋在立方體表面,其尺寸約0.4 ~2.0μm。AgBr-Ag-CNTs的EDS譜圖表明其特征峰分別對應(yīng)C、O、Br、Ag四種元素(圖2B),證實(shí)了復(fù)合材料中存在CNTs和AgBr。其中,Ag原子占32.86%,Br原子占26.41%。過量的Ag原子(6.46%)可能來自Ag+的還原。圖2C為AgBr-Ag-CNTs的XRD譜圖,其在31.0°、44.3°、55.0°、64.5°、73.2°的特征衍射峰,分別對應(yīng)AgBr立方晶相的(200)、(220)、(222)、(400)、(420)晶面(JCPDS No. 06-0438)[19]。未發(fā)現(xiàn)明顯的Ag特征峰,可能是由于AgBr-Ag-CNTs中金屬Ag含量較低或粒徑太小所致。進(jìn)一步利用XPS分析AgBr-Ag-CNTs的元素組成和化學(xué)狀態(tài)(圖2D-F)。C 1s和O 1s的特征峰來自CNTs(圖2D)。Ag的XPS峰可拆分為4個(gè)擬合峰。367.1 eV和373.2 eV處的兩個(gè)峰屬于AgBr中Ag 3d5/2和Ag 3d3/2,368.0 eV和374.2 eV處的兩峰屬于金屬Ag[20],這表明Ag0的存在(圖2E)。Br 3d在68.0 eV和69.1 eV處有擬合峰,分別屬于Br 3d5/2和Br 3d3/2的結(jié)合能(圖2F),表明元素Br主要以Br-存在[20]。

    圖2 AgBr-Ag-CNTs的SEM圖(A)、EDS譜圖(B)、XRD譜圖(C)和XPS譜圖(D-F)Fig.2 SEM image(A),EDS spectrum(B),XRD pattern(C)and XPS spectrum(D-F)of AgBr-Ag-CNTs

    進(jìn)一步比較了幾種材料的陰極光電化學(xué)活性(見圖3)。在外加偏壓0.1 V條件下,AgBr顯示較低的陰極光電流,AgBr-Ag的陰極光電流強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。與前二者相比,AgBr-Ag-CNTs的光電流強(qiáng)度大大提升,其強(qiáng)度分別為AgBr的2.7倍和AgBr-Ag的2.1倍,這表明AgBr-Ag-CNTs擁有更高的陰極光電化學(xué)活性。

    圖3 不同材料修飾的ITO玻璃在0.1 V偏壓下的光電流Fig.3 Photocurrent of ITO glass modified by different materials at potential of 0.1 V

    2.2 K3[Fe(CN)6]的影響

    為提高AgBr-Ag-CNTs在光激發(fā)下的電子-空穴對(e-/h+)的分離效率,提高光電流信號(hào),構(gòu)建高性能傳感器,本實(shí)驗(yàn)考察了K3[Fe(CN)6]作為光電子受體時(shí)的信號(hào)變化。由圖4A可見,無K3[Fe(CN)6]時(shí),光照下的電流(曲線a’)比無光照時(shí)的電流(曲線a)明顯增強(qiáng);加入K3[Fe(CN)6]后,開啟燈源時(shí)電流急劇增加(圖4B,b’),與曲線a’相比,對應(yīng)電位的電流大大增強(qiáng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證K3[Fe(CN)6]的作用,本實(shí)驗(yàn)采用恒電位法比較了AgBr-Ag-CNTs/ITO電極在有/無K3[Fe(CN)6]時(shí)的光電流。結(jié)果顯示,在0.1 V電位下,當(dāng)存在K3[Fe(CN)6]作為光電子受體時(shí),電極的光電流是無K3[Fe(CN)6]時(shí)的2.9倍,且光電流在瞬間達(dá)到最大。這表明光照條件下,AgBr導(dǎo)帶激發(fā)出的光電子可經(jīng)CNTs快速傳遞到溶液中的K3[Fe(CN)6],促進(jìn)其還原為K4[Fe(CN)6]。由于CNTs具有優(yōu)良的電荷傳輸效率,可加速電荷分離并抑制電子-空穴對(e-/h+)復(fù)合,從而顯著增強(qiáng)光電流信號(hào)[16]。

    2.3 傳感器的構(gòu)建

    利用電化學(xué)阻抗譜(EIS)研究了核酸適配體傳感器的制備過程。圖5A顯示AgBr-Ag-CNTs/ITO的電荷轉(zhuǎn)移電阻(Rct)相對較低(曲線a)。修飾CS膜后,增強(qiáng)了Rct值(曲線b);固定適配體和封閉乙醇胺后,Rct值顯著增加(曲線c);與OTA反應(yīng)后進(jìn)一步降低了Rct(曲線d)。采用瞬態(tài)光電流對傳感器的制備進(jìn)行考察(見圖5B),可觀察到AgBr-Ag-CNTs/ITO產(chǎn)生極高的陰極光電流(曲線a)。隨著CS的修飾、核酸適配體的固定和乙醇胺的封閉,光電流逐步降低(曲線b、c)。與OTA反應(yīng)后,光電流密度進(jìn)一步減?。ㄇ€d),這表明傳感器已成功制備且實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)OTA的特異性識(shí)別。

    圖5 不同電極在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中的電化學(xué)阻抗譜(A),以及0.1 V偏壓下,不同電極在20μmol/L K3[Fe(CN)6]中的光電流(B)Fig.5 EIS curves of different electrodes in 5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]solution(A),and photocurrent response of different electrodes at 0.1 V in 0.1 mol/L KCl containing 20μmol/L K3[Fe(CN)6](B)a:AgBr-Ag-CNTs/ITO;b:after CS modification;c:after aptamer and ethanolamine immobilization;d:after incubation with OTA(1.0 ng/mL)

    2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

    外加電位是影響光電流信號(hào)的重要因素。如圖4B所示,陰極光電流強(qiáng)度隨掃描電位(0.6 ~0.05 V)的降低而升高,但掃描電位<0 V時(shí),AgBr-Ag-CNTs不穩(wěn)定,當(dāng)掃描電位低于0.05 V時(shí),負(fù)向電流急劇升高,這可能是由于AgBr-Ag-CNTs復(fù)合物中的Ag+被快速還原所致。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇0.1 V作為偏置電位。

    圖4 AgBr-Ag-CNTs/ITO在0.1 mol/L KCl(A)和20μmol/L K3[Fe(CN)6](B)溶液中于黑暗(a,b)和光照(a’,b’)條件下的循環(huán)伏安圖Fig.4 CV curves of AgBr-Ag-CNTs/ITO in 0.1 mol/L KCl solution(A)and 20μmol/L K3[Fe(CN)6](B)under darkness(a,b)and light irradiation(a’,b’)

    核酸適配體在光電陰極界面的固定密度影響光電化學(xué)響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在適配體濃度為0 ~1.0μmol/L范圍內(nèi),光電流強(qiáng)度隨濃度的升高急劇下降。在1.0 ~5.0μmol/L范圍,光電流緩慢下降最后趨于穩(wěn)定。考慮到高密度的適配體會(huì)阻礙光電子轉(zhuǎn)移,而低密度的適配體不能有效捕獲OTA并與之反應(yīng)。因此,本實(shí)驗(yàn)采用1.0μmol/L的適配體濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    2.5 性能檢測

    在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,測試了傳感器與不同濃度OTA 反應(yīng)后的陰極光電流響應(yīng)(圖6A)。在4.0 pg/mL ~2.5 ng/mL 范圍內(nèi),光電流密度隨OTA 質(zhì)量濃度的升高而降低,且降低的光電流ΔI(I-I0)與OTA質(zhì)量濃度的對數(shù)(logC)呈線性關(guān)系,線性方程為:ΔI(μA)=-0.179+0.917 logC(pg/mL)(圖6A,插圖),相關(guān)系數(shù)(r2)為0.994,檢出限(LOD)為1.5 pg/mL,遠(yuǎn)低于歐盟和中國規(guī)定的谷物和豆類原料中OTA的限定含量[3-4]。

    圖6 光電流響應(yīng)與OTA濃度的關(guān)系(A),及方法對OTA檢測的特異性(B)Fig.6 Relationship between photocurrent response and concentration of OTA(A),and specificity of the method for OTA assay(B)concentration of OTA:1.0 ng/mL;concentration of aflatoxin B1(AFB1),zearalenone(ZEA),and ochratoxin B(OTB):50.0 ng/mL;inset:the log-linear correlation between ΔI and content of OTA

    利用AgBr-Ag-CNTs/ITO 對1.0 ng/mL OTA 進(jìn)行特異性測試。如圖6B所示,與空白溶液相比,傳感器對質(zhì)量濃度為50.0 ng/mL 的黃曲霉素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEA)、赭曲霉素B(OTB)的光電流響應(yīng)降低小于7.5%;當(dāng)三者與OTA 混合后,傳感器響應(yīng)的光電流與僅含OTA 反應(yīng)液的光電流相似。結(jié)果表明該方法對OTA具有良好的選擇性。

    為驗(yàn)證該傳感器的可靠性,本課題組從當(dāng)?shù)爻匈徺I了紅酒、豆?jié){和花生牛奶3 種不同樣品,采用加標(biāo)的方式考察其回收率,每個(gè)樣品的加標(biāo)質(zhì)量濃度為100 pg/mL,平行測定3 次,測得回收率為92.0%~108%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)低于9.3%,表明該傳感器可用于實(shí)際樣品中OTA的檢測。

    3 結(jié)論

    本文采用水熱法和光化學(xué)還原法制備了具有優(yōu)良陰極光電化學(xué)活性的AgBr-Ag-CNTs復(fù)合納米材料。采用該材料作為陰極光電傳感基底,以K3[Fe(CN)6]作為光電子受體,制備了OTA 適配體傳感器,于4.0 pg/mL ~2.5 ng/mL范圍實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)分子OTA 的選擇性檢測,檢出限為1.5 pg/mL。本傳感器制備簡單、成本低、靈敏度高、抗干擾強(qiáng),具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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