分散固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定藥用狗牙花中6種生物堿

樊輕亞，白澤方，汪學猛，王萬好

（1.信陽職業(yè)技術(shù)學院，河南 信陽 464000；2.河南同源制藥有限公司，河南 信陽 464000）

藥用狗牙花是我國特有的夾竹桃科狗牙花植物，主要分布于我國南部各省，具有清熱解毒、降壓、消腫止痛之功效，臨床可用于高血壓、咽喉腫痛、風濕痹痛、腫瘤等疾病的治療［1］。該植物主要含有生物堿和黃酮類化合物，研究者從藥用狗牙花中提取得到了吲哚類生物堿［2-4］，其中冠狗牙花堿、伊波加明、伊波加因、伏康京堿、山辣椒堿、老刺木堿等是含量較多的成分。這些生物堿成分在戒毒、抗腫瘤、降血壓、抗病毒等方面具有較好的藥理活性［5-7］。

生物堿的分離純化方法多為液液萃取法和固相萃取法等，傳統(tǒng)的液液萃取法具有操作繁瑣、有機溶劑用量大、殘留多、成本高和污染環(huán)境等缺點。分散固相萃取法和固相萃取法的原理相似，均是利用目標檢測物與雜質(zhì)的極性不同，選取與雜質(zhì)極性相近的吸附劑從提取試劑中直接去除雜質(zhì)，從而達到富集和凈化樣品的效果。但傳統(tǒng)固相萃取法的操作步驟復(fù)雜且時間長，溶劑消耗量大，不利于大批量樣品的快速分析；且固相萃取小柱種類多，難以選擇一種合適的固相萃取小柱。而分散固相萃取法利用少量吸附劑加入到提取液中吸附雜質(zhì)，具有操作簡單、萃取時間短、選擇性高、重現(xiàn)性好、回收率高等優(yōu)點，且有機溶劑消耗少、凈化過程無需額外的有機試劑，成本低，綠色環(huán)保，在食品、醫(yī)藥化工等農(nóng)藥殘留及痕量檢測領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用［8-12］。目前，分散固相萃取用于中草藥有效成分分離純化方面的研究也有報道，但在藥用狗牙花萃取分離方面的應(yīng)用國內(nèi)外尚未見報道。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-MS/MS）最早于1996 年問世，與傳統(tǒng)高效液相色譜（HPLC）法相比，具有速度快、靈敏度高、分離效果好等優(yōu)點，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用［14-17］。本文采用PSA 和NH2混合吸附劑凈化樣品，并與UPLC-MS/MS 聯(lián)用測定狗牙花中6 種生物堿的含量。該方法簡單快速、凈化效果好、選擇性好，靈敏度和精密度高，可快速檢測狗牙花中6 種生物堿的含量，為狗牙花的進一步開發(fā)利用提供了研究基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

美國Waters Xevo TQ-MS 型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源；冠狗牙花堿、伊波加明、伊波加因、伏康京堿、山辣椒堿、老刺木堿標準品（純度＞98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）；C18、N-丙基乙二胺（PSA）、NH2、N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物固相柱（HLB）、SCX、PCX 吸附劑（上海宸喬生物科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國默克公司）。實驗用狗牙花藥材均購于網(wǎng)絡(luò)藥材市場，經(jīng)鑒定為藥用狗牙花（Ervatamia officinalis Tsiang）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品提取稱取一定量過100目篩的狗牙花樣品于50 mL離心管中，按固液比（g∶mL）1∶20加入一定量的1%氨水甲醇溶液，40 ℃水浴超聲15 min，4000 r/min 離心10 min，吸取上清液，重復(fù)2 次，合并上清液，濃縮。移取上層清液氮吹濃縮至近干，加入5 mL甲醇，渦旋1 min復(fù)溶，備用。

1.2.2 分散固相萃取凈化將上述復(fù)溶液轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中，加入200 mg PSA 和200 mg NH2吸附劑，渦旋2 min，4000 r/min 離心5 min，過濾，氮吹濃縮至干，用UPLC 流動相進行溶解后，待測定。

1.2.3 對照品溶液的制備精密稱取6 種對照品（冠狗牙花堿、伊波加明、伊波加因、山辣椒堿、老刺木堿、伏康京堿）各10.0 mg，分別用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 mg/mL的儲備液。精密吸取6種儲備液各1 mL，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，即得0.1 mg/mL的混合對照品溶液。

1.3 樣品分析條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BHE C18（50 mm × 2.1 mm，1.7 μm，美國Waters 公司）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸銨（B），梯度洗脫程序：0～3 min，2%～10%A；3～10 min，10%～50%A；10～17 min，50%～85%A；17～20 min，85%～2%A；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：3μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子模式；離子源溫度：130 ℃；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣（N2）流速：9.0 L/min；毛細管電壓：3.0 kV；錐孔氣流量：50 L/h；碰撞氣流量：2.5 L/h。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

中藥材中有效成分提取是基于各種成分在有機溶劑中的溶解性能差異，因此提取溶劑對各待測物的提取率有較大影響。本實驗分別選擇水、甲醇、乙醇、乙腈、1%氨水甲醇作為提取溶劑，考察了不同溶劑對6種生物堿提取率的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1 可知，上述5 種提取溶劑對狗牙花的提取率相差較大，在水和乙醇中的提取效果相對不佳，且水和乙醇提取的色素、脂肪等非極性干擾物較多，不利于后續(xù)凈化。甲醇和乙腈的提取率較優(yōu)，由于乙腈價格高于甲醇，選擇甲醇作為提取溶劑。進一步在甲醇中加入一定比例的氨水，結(jié)果顯示，由于狗牙花中生物堿在植物細胞中大部分以鹽的形態(tài)存在，加入氨水使得生物堿游離為分子狀態(tài)，能有效抑制分析物發(fā)生離子化反應(yīng)，從而增加分析物在有機相中的分配比例，因此1%氨水甲醇比純甲醇的提取效率更高。且1%氨水甲醇提取后的色譜圖中雜質(zhì)較少，基線和峰形好，所以選擇1%氨水甲醇作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對6種生物堿提取率的影響Fig.1 Effect of different solvents on the yields of six alkaloids

提取溶劑的用量對提取效率亦有較大影響，本實驗選擇最佳提取溶劑，進一步考察了待測樣品用量與溶劑用量的固液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）對6 種生物堿提取率的影響。結(jié)果顯示，固液比在1∶10以下時的提取率較低，這是由于提取溶劑用量較少時，待測物濃度較大，不能很好地提取出各待測物，且會造成較強的基質(zhì)抑制效應(yīng)。隨著固液比的增加，待測物的提取率逐漸增加，當固液比超過1∶20時，提取率增加不多，且溶劑過多會增加氮吹時間，因此選擇固液比為1∶20。

2.2 吸附劑的選擇

狗牙花中黃酮類、脂類、糖類等成分會干擾待測物的分析，而且會損壞檢測儀器和色譜柱。實驗考察了C18、PSA、NH2、HLB、SCX、PCX 6 種吸附劑對6 種生物堿回收率的影響（見圖2）。由圖2 可知，弱陽離子吸附劑HLB、C18的凈化回收率一般，這是由于C18吸附劑具有疏水作用，對非極性的組分有吸附；HLB 吸附劑是一類用于酸性、中性和堿性化合物的通用型吸附劑，對極性化合物具有較強的保留，因此對待測生物堿也有一定的吸附作用。SCX 柱和PCX 柱是利用聚合物填料合成的新型陽離子交換樹脂，具有表面親水和強陽離子交換特性，對生物堿的吸附較強，不利于凈化。PSA 和NH2的凈化效果較好，且對生物堿無吸附，這是由于PSA 吸附劑在硅膠上鍵合乙二胺-N-丙基官能團，主要作用力是弱陰離子交換作用，可與金屬離子產(chǎn)生鰲合作用，有效去除脂肪酸、有機酸、極性色素及糖；NH2是由硅膠鍵合氨丙基，兼具極性吸附和弱陰離子交換作用，可通過弱陰離子交換或極性吸附達到保留作用。因此，選擇PSA和NH2兩種填料作為吸附劑。

圖2 6種吸附劑對生物堿回收率的影響Fig.2 Effect of six adsorbents on the recovery of alkaloids

實驗對NH2和PSA兩種吸附劑的用量進行了優(yōu)化。設(shè)計了5個質(zhì)量水平，5 mL提取液中分別加入吸附劑的用量為50 mg NH2+ 50 mg PSA、100 mg NH2+ 100 mg PSA、150 mg NH2+ 150 mg PSA、200 mg NH2+200 mg PSA、250 mg NH2+250 mg PSA。結(jié)果表明，當吸附劑用量較低時，凈化不完全，目標化合物的提取率較低。隨著吸附劑用量的增加，生物堿的提取率增加，當吸附劑用量增至200 mg時，提取率達到最大，此后增加吸附劑的用量提取率反而降低。這是由于吸附劑用量過高時，會對目標化合物產(chǎn)生吸附，從而降低目標化合物的提取率。實驗最終選擇吸附劑的用量為200 mg PSA和200 mg NH2。

2.3 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.3.1 色譜條件的優(yōu)化對狗牙花經(jīng)分散固相萃取后的提取液進行UPLC-MS/MS分析，考察了有機相溶劑（甲醇、乙腈）中加入不同種類的緩沖液（三乙胺、乙酸銨、甲酸銨、氨水等）作為流動相時對待測物分離效果和質(zhì)譜電離的影響。結(jié)果表明，采用乙腈作為有機相的待測物峰形及響應(yīng)值均優(yōu)于甲醇。在有機相中添加甲酸銨可使質(zhì)譜電離過程的離子化程度更高，質(zhì)譜響應(yīng)更強，且有利于改善色譜峰峰形。因此，本實驗選擇梯度洗脫方式，以乙腈-0.1%甲酸銨溶液為流動相，6種生物堿獲得良好的分離度，峰形好、柱效高，可滿足狗牙花中生物堿的快速分析要求。狗牙花經(jīng)分散固相萃取后的總離子流色譜圖見圖3。

圖3 狗牙花經(jīng)分散固相萃取后的總離子流色譜圖Fig.3 Chromatogram of extract from Ervatamia officinalis Tsiang by dispersive solid phase extraction1. coronaridine；2. ibogamine；3. ibogaine；4. voacangine；5. tabernaemontanine；6. vobasine

2.3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化及裂解途徑采集全掃描模式下正離子、負離子信號，結(jié)果顯示負離子模式下幾乎無質(zhì)譜響應(yīng)，因此選擇響應(yīng)良好的ESI（+）作為離子化模式，分別找出6 種化合物的［M+H］+，作為準分子離子峰。將母離子進行碰撞誘導(dǎo)產(chǎn)生子離子，進一步優(yōu)化干燥氣流速、碰撞電壓和錐孔電壓等參數(shù)，選擇2 個響應(yīng)較強的子離子作為監(jiān)測碎片離子，選擇響應(yīng)值最大的子離子進行定量分析，6種化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 6種生物堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 6 alkaloids

在ESI（+）-MS/MS 條件下，6 種化合物主要發(fā)生側(cè)鏈斷裂，根據(jù)質(zhì)譜二級數(shù)據(jù)可推測其裂解途徑。本文的6 種生物堿母核均有吲哚環(huán)，伊波加因和伏康京堿為10-位甲氧基取代的吲哚類生物堿，發(fā)生10-位甲氧基斷裂，其他4 種生物堿為未取代的吲哚類生物堿；伊波加明和伊波加因的16位未被取代，冠狗牙花堿、山辣椒堿、老刺木堿、伏康京堿的16 位均有—COOCH3，均發(fā)生脫—COOCH3反應(yīng)；6 種生物堿共同的質(zhì)譜斷裂特征為20位發(fā)生斷裂，老刺木堿的20位脫去乙烯基，其它5種生物堿發(fā)生20位脫乙基反應(yīng)。6種生物堿的質(zhì)譜裂解途徑見圖4。

圖4 6種生物堿的二級質(zhì)譜圖與質(zhì)譜裂解途徑Fig.4 MS/MS spectra and fragmentation pathways of 6 alkaloids

2.4 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

分別稱取一定量的6 種生物堿標準溶液5 mL，配制成1、5、10、20、40、80、100 mg/L 系列標準工作溶液，按UPLC-MS/MS 條件進行測定，以待測物的色譜峰面積（Y）和對應(yīng)質(zhì)量濃度（X）繪制標準工作曲線，得出線性回歸方程。分別以信噪比S/N=3 及S/N=10 計算該方法的檢出限和定量下限。由表2 可知，6 種生物堿的線性范圍均為1～100 mg/L，相關(guān)系數(shù)不低于0.9837，檢出限為0.05～0.10 mg/L，定量下限為0.15～0.35 mg/L，表明本方法的靈敏度良好。

2.5 回收率與相對標準偏差

分別準確稱取3 份樣品，測得6 種生物堿的含量分別為冠狗牙花堿（690 μg/g）、伊波加明（302 μg/g）、伊波加因（268 μg/g）、伏康京堿（211 μg/g）、山辣椒堿（445 μg/g）、老刺木堿（395 μg/g）。分別添加1、10、50 mg/L 3 個質(zhì)量濃度的6 種生物堿混合對照品溶液，采用本方法進行前處理和測定，平行測定6 次，結(jié)果見表2。6 種生物堿的加標回收率為93.2%～98.1%，相對標準偏差（RSD）為1.7%～2.9%，表明本方法的準確度和精密度良好。

表2 6種生物堿的線性關(guān)系、檢出限、定量下限、加標回收率及相對標準偏差（n=6）Table 2 Linear relations，detection limits，quantitation limits，recoveries and RSDs of 6 alkaloids（n=6）

2.6 實際樣品檢測

在優(yōu)化的萃取條件下，精密稱取6 個產(chǎn)地狗牙花藥材各10 g，按照本方法進行前處理和測定，并進行3個水平（1、10、50 mg/L）的加標回收實驗，每個水平測定6次（見表3）。

表3 6個產(chǎn)地狗牙花中生物堿的分析結(jié)果（n=6）Table 3 Analytical results of 6 alkaloids in Ervatamia officinalis Tsiang from 6 place of origin（n=6）

由表3可知，6個產(chǎn)地的狗牙花中均檢出6種生物堿，含量為0.07～0.86 mg/g，其中冠狗牙花堿的含量最高，伊波加明、伊波加因、伏康京堿在各產(chǎn)地中的含量相差較大；海南產(chǎn)地的6 種生物堿含量整體高于其它產(chǎn)地，而四川產(chǎn)地的6 種生物堿含量整體低于其他產(chǎn)地，這些含量和分布的差別可能與該植物生長時所需的溫度與地質(zhì)條件有關(guān)。因此在提取狗牙花中生物堿時，應(yīng)根據(jù)其組成和含量分布進行產(chǎn)地篩選，以獲得更高的提取率，降低生產(chǎn)成本。6 個產(chǎn)地狗牙花中6 種生物堿的加標回收率為91.5%～98.6%，RSD 為1.1%～2.9%，說明所建立方法具有良好的精密度和準確度，適用于不同產(chǎn)地狗牙花中6種生物堿的檢測。

3 結(jié)論

本文將分散固相萃取技術(shù)應(yīng)用于狗牙花中生物堿的萃取，采用單因素實驗考察了各因素對6 種生物堿提取率的影響，并與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法聯(lián)用測定了狗牙花中6 種生物堿的含量。該方法前處理操作簡單，凈化效果好，靈敏快速，是一種具有發(fā)展前景的萃取技術(shù)，可為后繼藥物的研究和開發(fā)提供理論及數(shù)據(jù)支撐。