基于超高分辨率液質(zhì)的北劉寄奴藥材中化學成分分析

胡恩明,王道平

(貴州醫(yī)科大學省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室,貴州 貴陽 550014;貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室,貴州 貴陽 550014)

北劉寄奴為玄參科陰行草屬的干燥全草[1-2],又名陰行草、金鐘茵陳、靈茵草等,首次見載于《本草原始》,民間用于跌打損傷、外傷出血、瘀血經(jīng)閉、血痢、血淋、濕熱黃疸、水腫腹脹等[1-4]。在我國華北、西南等地區(qū)均有分布,現(xiàn)有少量研究中,該藥材中化學成分主要為黃酮類的木犀草素、木犀草苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素;奎尼酸脂類如二咖啡酞基 奎尼酸、3,4,5-三咖啡酞基奎尼酸甲酯、灰氈毛忍冬素、去咖啡酰基類葉升麻苷、crenatoside、isoacteoside、acteoside、7-甲氧基香豆素、胡蘿卜苷、syringin、β-谷甾醇等化學成分,現(xiàn)代藥理學研究表明,北劉寄奴有抗血小板聚集、降低血清膽固醇、抗菌等功效[5-8]。

高分辨率液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在鑒別植物成分及食品添加劑方面綠色[9-10]、可靠、科學、快速等優(yōu)勢,也被廣泛應(yīng)用于保健品違規(guī)添加及中藥中成藥成分分析等[11-14]。當前對北劉寄奴的化學鑒別多集中傳統(tǒng)分離鑒別與高分液相保留時間對比鑒別,尚未有北劉寄奴化學成分UHPLC-HRMS相關(guān)研究,本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜技術(shù),對北劉寄奴藥材水提物與醇提物中化學成分進行推斷分析,為鑒別北劉寄奴及其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用的藥材北劉寄奴購買于安徽毫州市場,經(jīng)鑒定為北劉寄奴(Siphonostegia chinensis Benth.)的全草樣品。藥材經(jīng)40℃恒溫干燥箱烘干后粉碎,樣品經(jīng)60目樣品篩過濾后備用。稱取0.5g樣品粉末至150mL錐形瓶內(nèi),加入50 mL甲醇水溶液(V甲醇∶V水=3∶1),浸泡5小時,待樣品完全被溶劑浸濕,超聲提取60min,靜止后取上清液過0.22μm微孔濾膜后備用。

1.2 儀器與試劑

超高壓液相色譜串聯(lián)高分辨靜電場軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用儀:ThermoFish U3000-QE Focus(美國賽默飛世爾科技公司);數(shù)控超聲波提取儀KQ-500DE(昆山市超聲儀器有限公司);實驗室自超純水(密理博明澈TM-D24UVB);色譜乙腈(美國默克公司);色譜甲酸(天津科密歐有限公司)。

1.3 液質(zhì)方法條件

色譜柱:ACE UltraCore2.5 SuperC18100mm*2.1mm;0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)為流動相,洗脫程序:0～5min,95%A→95%A;5～42min, 95%A→5%A;42～47min; 5%A→5%A.柱溫箱溫度:40℃;流速:0.3mL/min;進樣體積:5μL;

質(zhì)譜掃描參數(shù):采集方式:ESI電噴霧正負離子模式同時采集;噴霧電壓(spray voltage):3.0kv(+)/2.5kv(-);離子傳輸管溫度(capillary temperature):320℃;鞘氣(sheath gas):35arb;輔助氣(aux gas):10arb;探頭加熱器溫度(probe heater temperature):350℃。掃描方法:數(shù)據(jù)依賴型全掃描/二級質(zhì)譜掃描(Full MS-ddms2),質(zhì)量掃描范圍:100～1500m/z;掃描分辨率:全掃描(full ms):70000、二級質(zhì)譜(MS/MS):17500;自動增益控制目標離子數(shù)(AGC target):full ms(1e6)、MS/MS(2e5);最大注入時間(Maximum IT):100ms;歸一化碰撞能量(NCE):20、40、60。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采集數(shù)據(jù)后經(jīng)賽默飛公司自建中藥材數(shù)據(jù)庫與小分子化合物軟件Compound Discoverer3.2中在線化合物庫進行定性分析,根據(jù)其一級精確分子量模擬化合物分子式、根據(jù)二級碎片離子分析化合物可能結(jié)構(gòu),結(jié)合多種以上信息推斷北劉寄奴中所含化學物質(zhì)成分結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 UHPLC-HRMS總離子流圖及數(shù)據(jù)篩查

UHPLC-HRMS對北劉寄奴75%醇提物化學成分進行分離鑒定,正負總離子流圖如圖1所示,根據(jù)采集數(shù)據(jù)得到的保留時間、化合物精確分子量及二級碎片離子,與中藥材數(shù)據(jù)庫及在線數(shù)據(jù)庫對比得到北劉寄奴中藥材化學成分鑒定表,匯總兩種提取成分得表1。

圖1 北劉寄奴(A)正離子模式與(B)負離子模式總離子流圖

表1 北劉寄奴化學成分表

2.2 新化學成分質(zhì)譜裂解解析

本試驗首次從北劉寄奴樣品鑒定到11 種新化合物:苦參堿、桃葉珊瑚苷、地黃苷A、密力特苷、京尼平苷酸、梔子苷、車葉草苷酸、夏佛塔苷、異嗪皮啶、杠柳毒苷、金合歡素,其主要二級碎片裂解途徑如下:

(1)苦參堿

(2)桃葉珊瑚苷

(3)地黃苷A

(4)京尼平苷酸

(5)密力特苷

(6)梔子苷

(7)車葉草苷酸

(8)夏佛塔苷

(9)異嗪皮啶

(10)杠柳毒苷

(11)金合歡素

3 結(jié)論

本實驗運用超高壓液相色譜串聯(lián)軌道阱高分辨質(zhì)譜對中藥材北劉寄奴的75%乙醇提取物(大極性與小極性物質(zhì)在此溶液中都會溶解)進行化學成分分析,高效快捷地鑒定出64種化合物,其中11種為首次從中藥材北劉寄奴中鑒定出,并根據(jù)其碎片離子推測其裂解途徑,該方法可以有效快速地對北劉寄奴化學成分篩查,為鑒別北劉寄奴及其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供數(shù)據(jù)依據(jù),同時為分離北劉寄奴中化合物提供先導參考。