清肺解毒丸的提取工藝研究

康紹建 王 飄 朱志坤 郭媛媛 陳凌云*

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南省食品藥品審核查驗(yàn)中心，云南 昆明 650011；3.云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500

清肺解毒丸由金銀花、梔子、皂角刺等十七味中藥組成，該方具有清熱解毒、燥濕散結(jié)之功效。適用于肺胃濕熱所致的痤瘡、粉刺，癥見顏面、胸背部丘疹樣改變，或有膿皰、癢痛，伴有口渴、小便赤黃、便秘、舌紅苔黃膩等癥。方中君藥金銀花主要含有黃酮類化合物，具有抗炎和解熱之功效[1]；梔子含有環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸、黃酮、香豆素等成分，現(xiàn)代藥理研究[2]表明梔子具有抗炎、抗氧化、利膽、利尿、抗腫瘤、解熱、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性；皂角刺中含有黃酮、酚類、三萜等成分[3]，常用于治療癰疽腫毒；白芷主要有效成分是香豆素類和揮發(fā)油，具有抗菌消炎、解熱鎮(zhèn)痛、止咳平喘等作用[4]；該方原為湯劑，烏梢蛇打粉沖服，處方中金銀花、烏梢蛇、蒼術(shù)等所含有效成分熱不穩(wěn)定或水溶性差，難以煎出和保留，因此擬將其開發(fā)成濃縮丸，使患者服用、攜帶方便。本文就制備工藝中的提取工藝進(jìn)行了研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Diamonsil C18色譜柱[迪馬科技(天津)有限公司，4.6 mm×250 mm，5 μm]；SK2200HP超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；AB265-SMETTLER TOLEDO分析天平(瑞士梅特勒-托利多集團(tuán))；T-1000型電子天平(美國雙杰兄弟有限公司)；真空干燥箱(蘇州江東 DZF-6020)。

1.2 試藥 梔子苷對(duì)照品(批號(hào)：110749-201919，純度97.6%)購至中國食品藥品檢定研究院。皂角刺、梔子等所用飲片均由昆明市中醫(yī)醫(yī)院提供，經(jīng)四川千方中藥股份有限公司鑒定與檢驗(yàn)合格。水為娃哈哈純凈水，色譜甲醇(德國Merck公司)，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 因素水平的確定 實(shí)驗(yàn)在預(yù)實(shí)驗(yàn)以及查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，選擇加水倍數(shù)(A)、提取時(shí)間(B)和提取次數(shù)(C)3個(gè)因素，各因素取3個(gè)水平，以L9(34)正交試驗(yàn)表安排實(shí)驗(yàn)，以干膏得率和梔子苷轉(zhuǎn)移率綜合評(píng)分為指標(biāo)進(jìn)行考察，并對(duì)其進(jìn)行方差分析，考察各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響程度大小，最終確定各參數(shù)的水平，篩選出最佳提取工藝條件[5]。因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.2 干膏得率 稱取1/8倍處方量的飲片共 23 g，置于圓底燒瓶中，按表1正交試驗(yàn)表進(jìn)行回流提取，濾液轉(zhuǎn)移至 1000 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，精密移取 50 mL 至已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于 105 ℃ 干燥 3 h，取出，置干燥器中冷卻 0.5 h 后迅速稱定其質(zhì)量，計(jì)算干膏得率(干膏得率=干浸膏量×20/生藥量)[6]。

2.3 梔子苷轉(zhuǎn)移率[7]

2.3.1 色譜條件 Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱；乙腈-水(8∶92)為流動(dòng)相；檢測波長 238 nm；進(jìn)樣體積 10 μL；流速 1 mL/min；柱溫 25 ℃；理論塔板數(shù)按梔子苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 取梔子苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為 248.8 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 稱取1/8倍處方量的飲片共 23 g，進(jìn)行回流提取，濾過，合并提取液，加蒸餾水定容至 1 000 mL，搖勻，精密移取 20 mL，加水飽和正丁醇振搖提取3次，每次 20 mL，合并正丁醇層，水浴揮至近干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容?5 mL，即得。

2.3.4 陰性對(duì)照溶液制備 按照處方比例稱取除梔子以外的其余飲片，同供試品溶液制備方法制得缺梔子的陰性對(duì)照溶液。

2.3.5 專屬性考察 取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，如圖1，結(jié)果表明專屬性良好。

2.3.6 線性與范圍 分別精密移取對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，至 10 mL 容量瓶內(nèi)，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列梯度濃度的溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，梔子苷濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程:Y=12.532X-11.536(r=0.9998)，結(jié)果表明梔子苷對(duì)照品含量在24.88～248.8 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3.7 儀器精密度 取對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果梔子苷峰面積的RSD值為0.95%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.8 重復(fù)性 從同一份提取液中，取6份樣品，每份 20 mL，分別制成供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算梔子苷含量的RSD值為1.01%(n=6)，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.3.9 穩(wěn)定性 取上述供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，梔子苷峰面積的RSD值為1.58%(n=6)，結(jié)果表明，供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.10 準(zhǔn)確度 精密量取已知含量的提取液(91.25 μg·mL-1)6份，每份 5 mL，分別加入 1.5 mL 已知濃度的梔子苷對(duì)照品溶液(248.8 μg·mL-1)，按供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，進(jìn)樣，計(jì)算梔子苷含量和回收率。梔子苷的平均回收率為98.71%，RSD為2.53%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3.11 飲片含量測定 取梔子飲片3份，按《中國藥典》2020年版一部梔子“含量測定”項(xiàng)下方法分別進(jìn)行測定，計(jì)算含量，結(jié)果得梔子苷平均含量為2.16%，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 正交試驗(yàn)安排與結(jié)果 按表1所設(shè)計(jì)因素水平表和表2正交表，依次進(jìn)行提取，測定各試驗(yàn)的干膏得率、梔子苷轉(zhuǎn)移率。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 綜合評(píng)分方差分析

綜合評(píng)分[8]：梔子苷轉(zhuǎn)移率及干膏得率權(quán)重系數(shù)分別為70%和30%，以得出的綜合評(píng)分作為指標(biāo)。綜合評(píng)分=(梔子苷轉(zhuǎn)移率/梔子苷最大轉(zhuǎn)移率×0.7+干膏得率/干膏得率最大值×0.3)×100。

根據(jù)表2正交試驗(yàn)結(jié)果和表3綜合評(píng)分方差分析結(jié)果可知，加水倍數(shù)(A)和提取次數(shù)(C)對(duì)綜合評(píng)分的影響具有顯著性意義，3個(gè)因素影響從大到小排序?yàn)樘崛〈螖?shù)、加水倍數(shù)、提取時(shí)間，按綜合評(píng)分表中最高值優(yōu)選出最佳提取工藝為A2B2C3，即煎煮3次，每次加10倍量水，煎煮 1.5 h 。

2.5 工藝驗(yàn)證 為保證工藝的合理可行，對(duì)優(yōu)選出的提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證。取處方量飲片3份，按A2B2C3條件提取，分別測定其干膏得率及梔子苷轉(zhuǎn)移率，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表4。結(jié)果顯示干膏得率和梔子苷轉(zhuǎn)移率平均值均接近正交試驗(yàn)中最佳提取工藝結(jié)果，表明此方法具重現(xiàn)性，可作為最佳提取工藝條件。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

清熱解毒方由金銀花、梔子、皂角刺等十七味藥組成，該方原為湯劑，烏梢蛇打粉沖服，其余藥味以水煎煮。為使患者服用、攜帶方便，本研究擬開發(fā)其新劑型，若改為液體制劑或顆粒劑，烏梢蛇有效成分難以煎出，且烏梢蛇氣腥，煎煮難以掩蓋其氣味，若制成片劑或硬膠囊，因處方量較大，則每次服用片數(shù)或粒數(shù)過多，因此選擇將其開發(fā)為丸劑(濃縮丸)，水溶性差和熱不穩(wěn)定成分可打粉入藥，含有水溶性成分的藥采用水提，能較好保留原料藥有效成分，更好發(fā)揮藥效，濃縮丸表面打光還可掩蓋烏梢蛇的特殊氣味，便于服用。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)可知，本方中金銀花、烏梢蛇、白芷、浙貝母、蒼術(shù)、連翹中含有游離黃酮類、萜類、苯丙素類、香豆素類、生物堿類等難溶于水的成分[1-4,8-10]，因此以上六味采用打粉入藥。其余皂角刺、紫花地丁等適宜煎煮的飲片采用水提，能較好保留原料藥有效成分，更好發(fā)揮藥效。方中君藥皂角刺含有黃酮類、酚類、三萜類、香豆素類等成分[3]。在2020版中國藥典中，未記載其含量測定方法；紫花地丁主要有效成分是秦皮乙素，含量測定的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道并不多；梔子的主要成分為梔子苷，是環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)，易溶于水，受其他成分干擾小，易于測定，故選用梔子苷轉(zhuǎn)移率作為指標(biāo)來考察提取工藝。

此次試驗(yàn)利用HPLC法對(duì)梔子苷進(jìn)行測定，從HPLC圖可看出，梔子苷的分離度高，無雜質(zhì)峰干擾，專屬性強(qiáng)，該條件下測定結(jié)果的準(zhǔn)確性、精密度、重復(fù)性較為良好，可作為其理想測定方法，為以梔子苷含量為指標(biāo)的測定方法提供了參考依據(jù)。

正交試驗(yàn)具有科學(xué)性高、步驟簡單、節(jié)省時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，在中藥提取工藝優(yōu)化設(shè)計(jì)中被廣泛應(yīng)用[11]，本實(shí)驗(yàn)采用多指標(biāo)信息熵權(quán)重分析法，結(jié)合正交設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝，以加水倍數(shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)作為考察因素，以干膏得率和梔子苷轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果表明，提取次數(shù)對(duì)綜合評(píng)分影響最大，其次是加水倍數(shù)、提取時(shí)間。綜合干膏得率和梔子苷轉(zhuǎn)移率評(píng)價(jià)指標(biāo)，得出其最佳提取工藝為煎煮3次，每次加10倍量水，煎煮 1.5 h。