HPLC-DAD鑒別皂角刺中摻入野皂角刺的方法研究

劉小燕，夏巧紅，宋平順，張義福，賀軍權，倪 琳*

（1. 甘肅省藥品檢驗研究院 國家中藥材及飲片質(zhì)量控制重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅中醫(yī)藥大學 藥學院，甘肅 蘭州 730030）

《中國藥典》2020年版（一部）收錄的皂角刺為豆科植物皂莢Gleditsia sinensisLam.的干燥棘刺[1]。皂莢系豆科云實亞科皂莢屬植物[2]，是我國特有的鄉(xiāng)土樹種[3]。皂角刺含有多酚、黃酮、香豆素、三萜皂苷、三萜、內(nèi)脂、甾醇等成分[4-5]，具有消腫托毒、排膿、殺蟲之功效，臨床用于癰疽初起或膿成不潰，外用于疥癬麻風[1]等癥的治療，具有抗炎[6]、抑菌[7]、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤[4-5]等藥理活性。

近年來，隨著醫(yī)療市場改革，中藥飲片以次充好、以假亂真的現(xiàn)象層出不窮，嚴重影響了用藥安全和臨床療效[8]。一些摻假中藥材或飲片與正品極為相似，極易混淆。因此，對中藥真?zhèn)蔚蔫b別顯得尤為重要。皂角刺?；靷纹芬砸霸斫谴梯^為多見，野皂角刺為豆科植物野皂莢Gleditsia heterophyllaBunge.帶枝條的棘刺，兩者屬于同科同屬近緣種植物，外觀十分相似[9-11]，傳統(tǒng)的性狀、顯微、理化鑒別方法不能分辨皂角刺正品與偽品。王麗君等[12]建立了皂角刺中野皂角刺摻偽量的近紅外光譜預測模型，但模型預測的準確性直接受到藥材產(chǎn)地及炮制方法等的限制。本研究基于特征圖譜的思路，參考相關文獻資料，并以阿魏酸對照品作為內(nèi)標物，對野皂角刺中的特有峰進行定性分析，擬建立HPLC法鑒別正品皂角刺與偽品野皂角刺。為皂角刺中摻偽野皂角刺情況評價提供依據(jù)，也可為市場其它藥材摻偽摻假分析提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；Waters ARC型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；Mettler MS205DU型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥

阿魏酸對照品（批號：110773-201614，中國食品藥品檢定研究院，純度：99.0%）；皂角刺對照藥材（批號：121210-201504，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈（HPLC級，德國Merck公司），甲酸（優(yōu)級純，阿拉丁試劑有限公司），水為純化水。

共收集到皂角刺正品藥材及飲片7批，其基原為豆科植物皂莢Gleditsia sinensisLam.；收集到偽品野皂角刺6批，其基原為豆科植物野皂莢Gleditsia heterophyllaBunge.。樣品信息見表1。皂角刺與野皂角刺均由甘肅省藥品檢驗研究院宋平順主任藥師收集并鑒定。同時收集皂角刺藥材及飲片樣品26批，編號為Yp01-Yp26。

表1 皂角刺和野皂角刺的相關樣品信息Tab. 1 Sample information of Gleditsia sinensisLam. and Gleditsia heterophylla Bunge.

2 方法與結果

2.1 色譜條件

ODS 色譜柱（型號：5TC-C18；填料：十八烷基硅烷鍵合硅膠； 4.6 mm × 250 mm，5 μm；美國安捷倫科技公司）。流動相A為0.1%甲酸，流動相B為乙腈，按表2進行梯度洗脫，柱溫為30℃；檢測波長為305 nm；流速為0.9 mL/min；進樣量為10 μL。

表2 流動相梯度洗脫程序Tab. 2 The gradient elution program of mobile phase

2.2 溶液的制備

2.2.1 內(nèi)標溶液的制備 取阿魏酸對照品，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.2 陰性對照溶液的制備 取皂角刺對照藥材，過三號篩，取約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率：400 W，頻率：40 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，內(nèi)標溶液1 mL，置同一10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為陰性對照溶液。

2.2.3 陽性對照溶液的制備 取野皂角刺粉末，過三號篩，自“取約0.3g”起，同“2.2.2”法制備。典型色譜圖見圖1。

圖1 陽性對照溶液（a）、陰性對照溶液（b）及內(nèi)標溶液（c）典型色譜圖Fig.1 The typical chromatogram of positive control solution（a）,negative control solution（b） and internal standard solution（c）

2.2.4 供試品溶液的制備 取本品粉末，過三號篩，自“取約0.3 g”起，同“2.2.2”法制備。

2.2.5 摻偽樣品的制備 分別取皂角刺Gs5及野皂角刺Gh1粉末，過三號篩，按重量百分比（W/W）進行混合，同“2.2.4”法配制成皂角刺中摻入偽品野皂角刺5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%不同比例的溶液。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性試驗 取皂角刺及偽品野皂角刺，按上述“2.2.4”法制備供試品溶液，進樣。結果6批偽品野皂角刺中均檢出一特有峰，與阿魏酸的相對保留時間（relative retention time，RRT）為1.43，7批正品皂角刺在與阿魏酸RRT相同的位置均未出現(xiàn)色譜峰，見圖2；該特有峰經(jīng)HPLC-DAD掃描3D圖提取的光譜圖，見圖3。表明該方法專屬性良好。

圖2 皂角刺（A）與野皂角刺（B）樣品色譜圖Fig.2 The chromatogram of Gleditsia sinensisLam.（A）and Gleditsia heterophylla Bunge.（B）

圖3 3D掃描特有峰典型光譜圖Fig.3 The typical spectra of peak S scanned by 3D

2.3.2 線性關系 取“2.2.5”項下?lián)絺螛悠罚疾煲霸斫谴虛絺伪壤c特有峰峰面積是否呈線性關系。以摻偽比例為橫坐標，以特有峰/阿魏酸峰面積比為縱坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程為

Y= 0.760 1X+ 2.386，r= 0.995 3。

2.3.3 精密度 取摻偽比例為30%的供試品溶液，重復進樣6次，測得特有峰的峰面積RSD為0.4%（n= 6），與阿魏酸RRT的RSD為0.1%（n= 6），表明該方法精密度良好。

2.3.4 重復性 取摻偽比例為30%供試品溶液6份，進樣。摻偽比例分別為29.8%、30.1%、30.5%、30.3%、29.8%、29.6%時，特有峰的峰面積為118.28、123.18、131.70、123.86、126.18、117.65。

RRT的RSD為0.2% （n= 6），表明該方法重復性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性 取摻偽比例為30%供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣，測得特有峰峰面積RSD 為0.8% （n= 8），RRT的RSD為0.1%（n= 8），表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.3.6 檢出限 取摻偽比例為5%的供試品溶液，逐級稀釋至特有峰信噪比為8.2；相當于以Gh1作為偽品，摻偽比例為0.5%時，為檢出限。

2.3.7 定量限 取摻偽比例為5%的供試品溶液，逐級稀釋至特有峰信噪比為9.3；相當于以Gh1作為偽品，摻偽比例為0.75%時，為定量限。

2.3.8 耐用性 比較了Agilent 5TC C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）、Waters X-Bridge TM C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）、日立LaChrom C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）等不同品牌色譜柱；不同柱溫28、30、32℃；及Agilent 1260型、Waters ARC型不同高效液相色譜儀時該方法的耐用性。結果在皂角刺正品中均未檢出特有峰，在野皂角刺中均檢出特有峰，與阿魏酸的RRT約為1.43，表明該方法耐用性良好。

2.4 結果判定

選取3批皂角刺，5批野皂角刺，按重量百分比（W/W）摻入偽品野皂角刺3%的比例，按照表3所示編號，同“2.2.4”配制供試品溶液，并加入阿魏酸內(nèi)標溶液，使其終濃度約為1 μg/mL，每組摻偽樣品平行2份，共計得到20份摻偽比例3%的皂角刺樣品，按照擬定HPLC方法測定。將阿魏酸折算成濃度為1 μg/mL時的峰面積，計算特有峰與阿魏酸峰面積比值，公式如下：

表3 摻偽3%比例的樣品組成與編號Tab. 3 Sample composition and number of 3% adulteration ratio

其中，各參數(shù)如下：P比為特有峰/阿魏酸峰面積之比；A1為特有峰峰面積；A2為阿魏酸峰面積；C2為阿魏酸內(nèi)標溶液濃度（單位： μg/mL）；1代表阿魏酸濃度為1 μg/mL。

結果顯示，當摻偽比例為3%時，20份摻偽樣品特有峰/阿魏酸峰面積之比為0.18～0.80，色譜圖見圖4。在飲片實際加工過程中，可能達到的最低摻偽比例不會低于3%，同時參考《中國藥典》2020年版（通則0212）中關于藥材雜質(zhì)不得過3%的規(guī)定，將皂角刺中摻入野皂角刺3%及以上時，認定為野皂角刺陽性檢出?？紤]到收集的野皂角刺樣品來源有限，并避免某些樣品在貯存運輸中的意外污染而產(chǎn)生誤判，將特有峰/阿魏酸峰面積比值高限值由0.80擴大至1.0。

圖4 摻偽3%比例樣品色譜圖Fig.4 The chromatogram of adulteration 3 % ratio samples

結果判定：供試品溶液色譜中，若出現(xiàn)與阿魏酸色譜峰相對保留時間為1.43的色譜峰，采用二極管陣列檢測器比較陽性對照溶液中特有峰與該色譜峰在190～400 nm波長范圍內(nèi)紫外-可見光吸收光譜，二者應不相同；若吸收光譜相同，且該色譜峰與阿魏酸峰面積之比大于1.0，則視為野皂角刺陽性檢出。

2.5 樣品的測定

對收集到的26批皂角刺樣品，經(jīng)甘肅省藥品檢驗研究院宋平順主任藥師鑒定，其中摻偽樣品5批，摻偽檢出率為19.2%。按照擬定HPLC法進行測定，結果7批樣品檢出野皂角刺；19批中未檢出野皂角刺，摻偽檢出率為26.9%，結果見表4。

表4 皂角刺樣品中野皂角刺檢測結果Tab. 4 The determination results of Gleditsia heterophylla Bunge. in Gleditsia sinensisLam. samples

3 討論

3.1 測定方法的建立

文獻中皂角刺提取方法多是關于多組分測定及指紋圖譜研究[13-15]，如回流提取法、冷浸法及萃取法等。而本研究的目的是找出偽品野皂角刺中的特有成分。研究中對甲醇超聲法及回流提取法提取樣品進行了比較分析，并考察了提取溶劑、超聲時間、提取時間等因素的影響。色譜條件參考了文獻[13]：乙腈-0.1%甲酸為流動相，C18為色譜柱。方法建立過程中重點對流動相色譜洗脫程序進行了優(yōu)化，以確定系統(tǒng)適應性達到要求，并排除假陽性干擾。預試驗結果顯示皂角刺與野皂角刺HPLC圖譜有較大差異，野皂角刺圖譜中可見一特有峰，其在190～400 nm范圍內(nèi)最大吸收波長為328 nm。研究中在保證特有峰響應靈敏度的前提下，正品皂角刺中的可干擾雜質(zhì)峰去除為原則，最終選定的測定波長為305 nm。

3.2 內(nèi)標法的確定

在本方法中，對皂角刺樣品中是否含有特有峰進行準確定性分析是該方法是否可行的關鍵。關于皂角刺中化學成分及藥理作用的相關文獻多有報道[5,16-17]，而對于偽品野皂角刺中化學成分無可參考資料。本研究顯示特有峰含量的高低直接與皂角刺中野皂角刺的摻偽比例呈正相關，而該組份僅存在于偽品野皂角刺中，可見該特有峰并無皂角刺相關的藥理作用，對其進行結構確證意義一般。研究中所擬HPLC方法用于鑒別皂角刺中摻入野皂角刺仍然可行。

因此，筆者利用加入的一種內(nèi)標物質(zhì)，對未知組分特有峰采用色譜RRT及紫外光譜進行聯(lián)合定性。在篩選了多種化學組分后，最終確定以阿魏酸對照品作為內(nèi)標物，特有峰相對于阿魏酸的RRT為1.43，介于0.5～1.5之間。經(jīng)穩(wěn)定性試驗顯示，阿魏酸在加入至皂角刺供試品溶液后，在24 h內(nèi)的峰面積RSD為0.6% （n= 8），保留時間RSD為0.2% （n= 8）。表明以阿魏酸對照品作為內(nèi)標物進行野皂角刺中特有峰的檢測，穩(wěn)定性好，簡便易得，方法可行。

3.3 陽性檢出限值的判斷

研究中以摻偽3%野皂角刺的測定結果作為陽性檢出限值，樣品測定結果陽性檢出率較之經(jīng)驗鑒別高出了7.7%，方法靈敏度較高。鑒于此次僅收集到6批偽品野皂角刺，其來源、產(chǎn)地并未達到全國范圍野皂角刺生長區(qū)域全覆蓋，對于特有峰/阿魏酸峰面積比測定確定的限度值存在一定的局限性。因此，對于陽性檢出限值還需要進一步采集更多的偽品野皂角刺進行確認，以免出現(xiàn)假陽性而產(chǎn)生誤判。

4 結論

本研究建立的HPLC-DAD內(nèi)標法為快速鑒別皂角刺中摻入野皂角刺的情況提供了實驗基礎，可作為皂角刺質(zhì)量評價的補充檢驗方法，為市場上皂角刺藥材及飲片的質(zhì)量監(jiān)督提供依據(jù)。采用加入的一種內(nèi)標物對偽品中特有峰進行定性，為一個新方法新思路，省去了結構確證等耗時耗資的過程，也可為市場其它藥材摻偽摻假分析提供參考。