基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討金柴飲治療新型冠狀病毒肺炎的作用機(jī)制

劉 瑩 ,申 力，王兆博，曹洪欣

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)，北京 100029）

新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）屬于中醫(yī)“疫病”范疇，流行廣泛、傳變迅速，具有寒熱毒邪錯(cuò)雜、邪居肺衛(wèi)與少陽(yáng)、虛實(shí)并見、邪盛正衰等特點(diǎn)。透邪解毒法是導(dǎo)師曹洪欣教授結(jié)合近年突發(fā)疫病特點(diǎn)提出的治療方法，用于治療嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）、甲流等突發(fā)性呼吸道病毒感染類疾病及各類感冒發(fā)熱、皰疹性咽峽炎等[1-4]。透邪解毒法防治疫病，一方面給邪以出路，將疫毒之邪透達(dá)于外；另一方面扶助正氣，激發(fā)人體驅(qū)邪能力。新冠肺炎流行初期，曹洪欣教授結(jié)合疾病特點(diǎn)及證候特征等，以透邪解毒法組方金柴飲防治新冠肺炎，對(duì)新冠肺炎易感人群、無(wú)癥狀感染者、確診患者輕型、普通型、重型等具有一定的防治效果[5-7]。金柴飲以小柴胡湯為基礎(chǔ)方，加金銀花、連翹清解熱毒、宣散邪氣，荊芥透邪外出，茯苓健脾祛濕，浙貝母清肺化痰，共奏透邪解毒、宣肺益氣、扶正祛邪之功。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的基本方法分析金柴飲對(duì)COVID-19的治療作用，預(yù)測(cè)其潛在分子機(jī)制，為深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 金柴飲目標(biāo)化合物篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)（TCMSP）檢索金柴飲中各藥物的化合物成分，依據(jù)口服利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30%且類藥性（druglikeness，DL）≥0.18的2個(gè)ADME 限定條件對(duì)獲得的化合物成分進(jìn)行初篩，從而得到金柴飲的活性成分。

1.2 目標(biāo)化合物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將金柴飲中的活性成分分別輸入到PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），得到相應(yīng)化合物的“Canonical SMILES”結(jié)構(gòu)，再將其導(dǎo)入到Swiss Target Prediction平 臺(tái)（http://www.swisstargetprediction.ch/），限 定 研 究 物 種 為 人 類（“Homo Sapiens”），預(yù)測(cè)金柴飲活性成分中的潛在蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。

1.3 新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）靶點(diǎn)收集

以“ novel coronavirus pneumonia”為關(guān)鍵詞，檢索OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/）與Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/），收集疾病相關(guān)基因，合并2個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值，獲得新型冠狀病毒肺炎的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 金柴飲成分-新型冠狀病毒肺炎靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運(yùn)用韋恩圖在線制作工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），將金柴飲活性成分靶點(diǎn)與疾病基因靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到交集靶點(diǎn)，即金柴飲治療COVID-19的潛在作用靶點(diǎn)。將這些作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)模型，將生物種類限定為“Homo Sapiens”，獲得蛋白互作關(guān)系，將數(shù)據(jù)保存為TSV格式文件。導(dǎo)入到Cytoscape 3.8.0軟件中，利用軟件中的“Network analyzer”功能分析靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，根據(jù)Degree值的大小排序，篩選出起關(guān)鍵作用的功能靶點(diǎn)。

1.5 金柴飲成分-新型冠狀病毒肺炎靶點(diǎn)功能與通路的富集分析

將金柴飲治療COVID-19的靶點(diǎn)輸入到Metascape平 臺(tái)（https://metascape.org/gp/index.html），P值設(shè)為小于0.01，對(duì)其進(jìn)行GO分析及KEGG通路富集分析，保存結(jié)果,繪制氣泡圖對(duì)各類數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。

1.6 金柴飲成分-新型冠狀病毒肺炎靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

根據(jù)通路預(yù)測(cè)結(jié)果，在Excel表格中建立“化合物-靶點(diǎn)”“靶點(diǎn)-通路”的對(duì)應(yīng)關(guān)系，將其導(dǎo)入CytoScape3.8.0，構(gòu)建化合物-新型冠狀病毒肺炎靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，以該圖來表示金柴飲治療COVID-19“成分-靶點(diǎn)-通路”之間的相互關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 金柴飲中藥活性成分獲取

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，初步獲得金柴飲中藥的化合物成分，經(jīng)ADME值篩選后得到各藥物活性成分共263個(gè)，運(yùn)用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)，得到活性成分靶點(diǎn)共4 476個(gè)，合并后刪除重復(fù)值共得到靶點(diǎn)979個(gè)。藥物活性成分及靶點(diǎn)情況見表1，方中部分化合物基本信息見表2。

表1 金柴飲“化合物-活性成分-靶點(diǎn)”基本信息Tab. 1 Basic information of“ Compound-Active ingredient-Target” in Jinchai Decoction

表2 金柴飲中交集化合物信息表Tab. 2 Information of intersection compounds in Jinchai Decoction

2.2 COVID-19相關(guān)靶點(diǎn)獲取

由Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)收集到COVID-19潛在靶點(diǎn)260個(gè)，結(jié)合OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充相應(yīng)靶點(diǎn)，合并后去除重復(fù)值，共得到261個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)。將篩選的金柴飲活性成分靶點(diǎn)與COVID-19疾病靶點(diǎn)取交集，繪制韋恩圖，得到共同靶點(diǎn)75個(gè)，見圖1。

圖1 金柴飲與COVID-19靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn of intersection target of Jinchai Decoction and COVID-19

2.3 金柴飲成分-新型冠狀病毒肺炎靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將共同靶點(diǎn)提交至STRING11.0平臺(tái)，得到75個(gè)靶蛋白的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)，采用Cytoscape 3.8.0軟件繪制靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。其中一個(gè)靶點(diǎn)TMPRSS11D沒有網(wǎng)絡(luò)相互聯(lián)系，故剔除。最終包含74個(gè)節(jié)點(diǎn)，749條邊（若兩個(gè)靶蛋白之間存在相互作用關(guān)系，則用邊連接兩個(gè)靶蛋白），由“Network analyzer”工具篩選出該網(wǎng)絡(luò)中degree值（度值）排名前10的靶蛋白，見表3。這些靶點(diǎn)基因可能在疾病治療中發(fā)揮重要作用。

表3 金柴飲治療COVID-19的關(guān)鍵靶點(diǎn)信息Tab. 3 Key target information of Jinchai Decoction in the treatment of COVID-19

圖2 金柴飲PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network of Jinchai Decoction

2.4 靶點(diǎn)功能與通路富集分析

通過Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)分析，共得到GO富集條目1 557條（P＜0.01），包含1 400個(gè)生物過程（Biological processes，BP）、106種 細(xì) 胞 功 能（Molecular function，MF）、51類 細(xì) 胞 組 分（Cell composition，CC）；KEGG 通路富集分析篩選得到152條（P＜0.01）,依據(jù)Count值分別選取排名在前的GO條目及KEGG通路繪制氣泡圖，見圖3。結(jié)果顯示，這些靶基因在BP方面主要參與細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、細(xì)胞對(duì)有機(jī)氮化合物、脂質(zhì)、損傷等的應(yīng)答過程，見圖3（A）；在MF方面主要涉及磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、激酶活性、蛋白激酶活性等功能，見圖3（B）。參與的通路主要有AGE-RAGE信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、甲流等，見圖3（D）。

圖3 金柴飲主要成分潛在靶點(diǎn)的富集分析Fig.3 Enrichment analysis of potential targets of main components in Jinchai Decoction

2.5 金柴飲成分-新型冠狀病毒肺炎靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

選取富集基因前20條的關(guān)鍵信號(hào)通路，建立“成分-靶點(diǎn)-通路”圖，見圖4。體現(xiàn)了金柴飲多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)。

圖4 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Network of "Component-Target-Pathway"

3 討論

本研究共篩選出金柴飲中包含261種活性成分，其中豆甾醇、β-谷甾醇、槲皮素、山柰酚、木犀草素、黃芩苷等16種化合物存在于2種以上的藥物中。藥理學(xué)研究表明，這些化合物多具有抗炎、抗病毒的生物活性，如β-谷甾醇可通過減少NO的合成及抑制IL-6、IL-1、TNF-α等炎性因子的表達(dá)等作用而發(fā)揮抗炎作用[8]；槲皮素可通過與HA2亞基相互作用阻斷病毒的融合，在A型流感病毒感染早期抑制病毒侵入[9]；山柰酚能夠通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路抑制IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α等炎性細(xì)胞因子的釋放而表現(xiàn)出明顯的抗炎功效[10]，且對(duì)急性肺損傷具有潛在的治療效果[11]。推斷這些化學(xué)成分及其協(xié)同作用可能是金柴飲發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

通過金柴飲核心成分-疾病關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)TNF、GAPDH、TP53、IL6、MAPK3、MAPK1、EGFR、CASP3、MAPK8、IL2為關(guān)鍵靶標(biāo)。TNF、IL6、IL2為常見的促炎因子，參與炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。研究表明，肺部感染、肺損傷時(shí)機(jī)體會(huì)釋放大量的TNF-α[12]。IL-6為炎癥急性期的反應(yīng)指標(biāo)，且在流感病毒性疾病中均呈現(xiàn)出過表達(dá)[13-14]。GAPDH是一種具有介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)和自噬等生理作用的多功能蛋白。對(duì)急性肺損傷具有保護(hù)作用[15]，而核心靶點(diǎn)中的MAPK1、MAPK3、MAPK8在急性肺損傷時(shí)常呈現(xiàn)異常表達(dá)，通過抑制其作用能夠降低肺損傷的炎癥參數(shù)[16]，增強(qiáng)肺泡巨噬細(xì)胞的自噬作用[17]。相關(guān)研究表明，P53突變能使肺上皮功能損傷[18]，P53基因及EGFR的突變與肺癌的發(fā)生息息相關(guān)，兩者皆是肺癌的重要生物學(xué)標(biāo)志[19]。綜上可見，這些核心靶基因多與機(jī)體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、肺部炎癥反應(yīng)、肺部損傷等有關(guān)。

KEGG富集分析顯示，金柴飲治療COVID-19的信號(hào)通路主要涉及AGE-RAGE信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等。AGE-RAGE信號(hào)通路可通過誘導(dǎo)激活MAPK、NFκB，致使IL-1a、IL-6、TNF-α等促炎因子和細(xì)胞間粘附分子等的表達(dá)、釋放，啟動(dòng)過度的炎癥反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)，影響氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起組織損傷[20-21]。此外，晚期糖基化終產(chǎn)物的受體（RAGE）是一種促炎性模式識(shí)別受體，在過敏性支氣管炎、肺炎、肺損傷、慢阻肺等疾病中其表達(dá)量增加[22]。PI3K/Akt、HIF-1信號(hào)通路關(guān)系密切，都參與了肺損傷、肺纖維化的發(fā)生過程[23-24]。而PI3K/Akt信號(hào)通路的激活能夠通過介導(dǎo)細(xì)胞自噬、抑制線粒體分裂達(dá)到保護(hù)肺組織，減輕肺損傷的目的[25-26]。由此推測(cè)金柴飲可能通過調(diào)控上述相關(guān)通路發(fā)揮治療作用。

4 結(jié)論

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的金柴飲作用機(jī)制研究表明，金柴飲能夠通過多成分、多靶點(diǎn)、多過程、多通路等多種途徑針對(duì)COVID-19的病因、病理改變而發(fā)揮抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能、抗氧化應(yīng)激等作用。本研究預(yù)測(cè)得到的金柴飲治療COVID-19的內(nèi)在機(jī)制還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證，有待深入研究。