基于電子鼻和HS-GC-MS分析溫郁金源3種中藥氣味差異

拱健婷，李 莉，叢 悅，張金霞，王大仟，關(guān)佳莉，趙藝萌

（北京市臨床藥學(xué)研究所/北京市中藥研究所，北京 100035）

姜科植物溫郁金Curcuma wenyujinY. H. Chen et C.Ling 主產(chǎn)于浙江瑞安，為著名的“浙八味”之一。溫郁金源中藥的藥用歷史悠久，因其藥用部位、加工方式的不同，分為3種不同的中藥——溫郁金、溫莪術(shù)、片姜黃，稱為一株三藥[1]。以上3種中藥均廣泛應(yīng)用于臨床湯劑、中成藥制劑中，塊根蒸至透心干燥稱為溫郁金，長(zhǎng)于破血化瘀；側(cè)根莖鮮縱切厚片干燥稱為片姜黃，長(zhǎng)于破血行氣；主根莖蒸熟干燥稱為溫莪術(shù)，長(zhǎng)于行氣止痛[2-3]，因此溫郁金源中藥的準(zhǔn)確鑒別對(duì)臨床精準(zhǔn)用藥至關(guān)重要。

氣味鑒別在中藥的品質(zhì)分析中一直占有非常重要的地位。電子鼻和氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是目前氣味分析的重要研究手段。電子鼻通過(guò)對(duì)樣品氣味輪廓信息進(jìn)行綜合分析，能快速、無(wú)損地反映樣品的整體氣味特征，目前已被廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境監(jiān)測(cè)、藥品等領(lǐng)域[4-7]。氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)則能夠?qū)崿F(xiàn)待測(cè)樣品具體揮發(fā)性成分的定性和定量分析，氣-質(zhì)聯(lián)用與電子鼻技術(shù)的結(jié)合能夠全面地分析、評(píng)價(jià)中藥的氣味特征。目前已有文獻(xiàn)對(duì)溫郁金源3種中藥溫郁金、溫莪術(shù)、片姜黃的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析[8-10]，但是溫郁金源中藥氣味電子鼻響應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究以溫郁金源3種中藥為研究對(duì)象，利用電子鼻對(duì)樣品氣味輪廓進(jìn)行分析，以期為溫郁金源3種中藥的快速鑒別提供參考依據(jù)；為實(shí)現(xiàn)電子鼻分析結(jié)果的最大可能關(guān)聯(lián)，采用HS-GC-MS對(duì)中藥原粉氣味進(jìn)行測(cè)定，為溫郁金源3種中藥氣味傳感器反應(yīng)機(jī)制分析提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

α-FOX3000型電子鼻（法國(guó)阿默思公司）；Agilent 7890B-5977A型氣相色譜質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；TriPlus 300型頂空自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；MSD Chemstation D.03.00.611色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)安捷倫科技公司）；質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫(kù)：NIST MS search 2.0；BSA-124S型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）；BJ-150型粉碎機(jī)（德清拜杰電器有限公司）。

溫郁金源3種中藥樣品均購(gòu)自浙江磐安浙八味市場(chǎng)，經(jīng)北京市臨床藥學(xué)研究所李莉研究員依據(jù)性狀特征鑒定為源于溫郁金Curcuma wenyujinY. H. Chen et C.Ling植物塊根及根莖的溫郁金、溫莪術(shù)、片姜黃。

1.2 方法

1.2.1 電子鼻檢測(cè) 精密稱取樣品粉末（65目）0.3 g裝入頂空進(jìn)樣瓶，壓蓋密封。設(shè)定電子鼻檢測(cè)參數(shù)為孵化時(shí)間：600 s；孵化溫度：45 ℃；進(jìn)樣量：1 500 μL；信號(hào)采集時(shí)間：90 s；采集周期：1 s；吹掃時(shí)間：600 s。各樣品平行測(cè)定5次，記錄樣品的氣味響應(yīng)值曲線。

1.2.2 HS-GC-MS檢測(cè) 精密稱取樣品粉末0.6 g裝入20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，加蓋密封，放入自動(dòng)進(jìn)樣器樣品盤中。樣品瓶加熱溫度：90 ℃；樣品環(huán)溫度：110 ℃；傳輸線溫度：120 ℃；樣品瓶加熱時(shí)間：5 min；樣品環(huán)平衡時(shí)間：0.2 min；進(jìn)樣時(shí)間：0.2 min。

色譜條件： Thermo TG-624色譜柱（60 m × 250 μm ×1.4 μm）；進(jìn)樣口溫度為220 ℃；載氣為氦氣；柱流量為1 mL/min；分流比為5∶1；程序升溫條件：初始溫度為80℃，以8 ℃/min升至90 ℃，保持4 min，以6 ℃/min升到200 ℃，保持12 min。

質(zhì)譜條件： 電離方式為EI，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z為 40 ～ 450。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

利用Alpha Soft V11提取12根傳感器的最大響應(yīng)值為特征值，采用SPSS 21.0進(jìn)行方差分析，SIMCA-P 13.0進(jìn)行PCA、PLS-DA分析，PLS相關(guān)性分析由Unscrambler X 10.4完成。根據(jù)NIST 14L譜庫(kù)檢索結(jié)果、匹配度及參考文獻(xiàn)對(duì)HS-GC-MS 檢測(cè)所得揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析，采用峰面積歸一化法確定各組分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫郁金、溫莪術(shù)、片姜黃的氣味分析

2.1.1 雷達(dá)圖分析 溫郁金、溫莪術(shù)、片姜黃樣品電子鼻平均響應(yīng)值的雷達(dá)圖，見圖1。經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果顯示溫郁金、溫莪術(shù)、片姜黃在12根傳感器上的響應(yīng)值不同（P＜0.01）。 傳感器陣列特征響應(yīng)雷達(dá)圖的差異在一定程度上反映了樣品香氣的差別。

圖1 溫郁金、溫莪術(shù)、片姜黃電子鼻傳感器響應(yīng)值雷達(dá)圖Fig.1 Radar map of Curcuma Radix, Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum

2.1.2 主成分分析（PCA） 樣品氣味與電子鼻傳感器的聯(lián)系用電子鼻數(shù)據(jù)的PCA 雙標(biāo)圖表示，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示PCA 主成分的累積貢獻(xiàn)量為99.88%，說(shuō)明其保留了原始數(shù)據(jù)中大部分的信息量。在PCA 模型中，各個(gè)樣品分布在不同區(qū)域，表明溫郁金、溫莪術(shù)、片姜黃中揮發(fā)性成分氣味信息具有明顯差異，電子鼻能將其快速區(qū)分。同時(shí)可以看出傳感器LY2/Gh、LY2/gCT1及T型、P型傳感器（第二象限中傳感器從左至右依次為T70/2、T30/1、PA/2、P10/1、P40/1、P10/2）傾向于溫郁金，而傳感器LY2/G、LY2/AA傾向于溫莪術(shù)，LY2/LG和LY2/AA傾向于片姜黃。另外，Loading分析結(jié)果顯示，LY2/G、LY2/AA對(duì)第一主成分的貢獻(xiàn)率較大，LY2/Gh、LY2/gCT1對(duì)第二主成分的貢獻(xiàn)度較大。

圖2 溫郁金、溫莪術(shù)、片姜黃電子鼻數(shù)據(jù)主成分分析雙標(biāo)圖Fig.2 Bioplot of PCA based on E-nose data of Curcuma Radix,Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum

2.1.3 偏最小二乘判別分析（PLS-DA） 進(jìn)一步將溫郁金、溫莪術(shù)、片姜黃的氣味信息分組，建立了PLS-DA模型。PLS-DA 是一種用于判別分析的多變量統(tǒng)計(jì)分析方法，能凸顯組間差異，利于分組[11]。采用前2個(gè)主成分t［1］和t［2］進(jìn)行PLS-DA分析，獲得樣品分布散點(diǎn)圖和變量VIP 圖，見圖3、4。PLS-DA 結(jié)果中，主成分t［1］對(duì)總方差的貢獻(xiàn)率為71.9%，主成分t［2］對(duì)總方差的貢獻(xiàn)率為28.1%，R2X、R2Y和Q2分別為0.999、0.998、0.998，模型有意義，且片姜黃、溫莪術(shù)、溫郁金能夠得到有效區(qū)分。12根傳感器中LY2/gCT、LY2/Gh、LY2/gCTl、LY2/LG對(duì)片姜黃、溫莪術(shù)、溫郁金氣味差異貢獻(xiàn)較大，為主要變量（VIP＞1），見圖4。上述結(jié)果表明，片姜黃、溫莪術(shù)、溫郁金氣味存在差異，電子鼻結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法能夠較好地區(qū)分溫郁金源3種中藥。

圖3 溫郁金、溫莪術(shù)、片姜黃3種中藥PLS-DA 分析的樣品分布散點(diǎn)圖Fig.3 Score scatter plot by PLS-DA of Curcuma Radix, Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum

圖4 溫郁金、溫莪術(shù)、片姜黃3種中藥變量的重要性差異Fig.4 VIP plot by PLS-DA of Curcuma Radix, Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum

2.2 HS-GC-MS測(cè)定結(jié)果分析

溫郁金、溫莪術(shù)、片姜黃樣品的總離子流圖，見圖5。通過(guò)化學(xué)工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并利用峰面積歸一化法對(duì)溫郁金、溫莪術(shù)、片姜黃的總離子流圖中各組分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行計(jì)算，使用NIST 14 L質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)各峰的質(zhì)譜圖進(jìn)行檢索，確定各個(gè)組分。結(jié)果檢測(cè)到的揮發(fā)性成分共計(jì)48 種，分別從溫郁金、溫莪術(shù)、片姜黃中鑒定出了23、19、36種成分，三者共有成分12種，分別為α-側(cè)柏烯、α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、d-檸檬烯、對(duì)傘花烴、桉葉油醇、2-蒈烯、樟腦、δ-欖香烯、β-欖香烯與β-石竹烯，見表1。

表1 溫郁金、溫莪術(shù)、片姜黃中揮發(fā)性成分的HS-GC-MS分析結(jié)果Tab. 1 Identification of the main volatile components of Curcuma Radix,Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum by HS-GC-MS

圖5 溫郁金、溫莪術(shù)、片姜黃的HS-GC-MS總離子流圖Fig.5 HS-GC-MS total ion chromatogram of Curcuma Radix, Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum

依據(jù)化合物結(jié)構(gòu)分類并計(jì)算出各類物質(zhì)相對(duì)含量，如圖6所示，主要揮發(fā)性物質(zhì)分為烯烴類、酮類、酯類等。其中，溫郁金、溫莪術(shù)樣品中烯烴類物質(zhì)含量分別為61.96%、81.15%，在揮發(fā)性物質(zhì)中含量最高，片姜黃中也含有32.77%，某些烯烴類成分對(duì)樣品的氣味有重要作用[12]，這些物質(zhì)可能是構(gòu)成溫郁金源3種中藥氣味的基礎(chǔ)。醇類物質(zhì)僅在片姜黃中檢測(cè)出，但一般認(rèn)為醇類物質(zhì)的閾值較高[13]，對(duì)樣品的氣味貢獻(xiàn)不大。溫郁金中未檢測(cè)出酯類物質(zhì)，而酯類物質(zhì)是一類十分重要的呈香物質(zhì)，閾值低[14-15]，片姜黃、溫郁金、溫莪術(shù)酯類物質(zhì)含量差別較大，可能它們之間香氣有區(qū)別的重要原因。對(duì)于酮類化合物，片姜黃、溫莪術(shù)、溫郁金中分別檢測(cè)出6、3、1種，且在片姜黃中的含量最高。可以推測(cè)出片姜黃、溫郁金、溫莪術(shù)在氣味上存在較大差異。

圖6 片姜黃、溫莪術(shù)、溫郁金各類型揮發(fā)性物質(zhì)分析比較結(jié)果Fig.6 The comparison results of various types of volatile components analysis of Curcuma Radix, Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum

2.3 電子鼻氣味與揮發(fā)性成分的相關(guān)性分析

為研究溫郁金源3種中藥產(chǎn)生氣味的具體化學(xué)成分與電子鼻傳感器的反應(yīng)機(jī)制，將48種揮發(fā)性成分相對(duì)含量與電子鼻響應(yīng)值作為研究對(duì)象，采用PLS法以化合物的相對(duì)含量為自變量，12個(gè)傳感器的響應(yīng)值為因變量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見圖7。大小橢圓分別表示50% 和100% 的方差解釋，因變量均在此范圍，說(shuō)明可用PLS 模型很好地解釋其它變量。傳感器LY2/LG與LY2/AA分布在坐標(biāo)圖的左側(cè)外圍，剩余10根傳感器均分布在坐標(biāo)圖的右側(cè)外圍。傳感器與各化合物在圖上的距離越短，代表其相關(guān)性越高。傳感器LY2/G與C16（對(duì)傘花烴）緊密關(guān)聯(lián)，LY2/AA與C35（2-十一烷酮）、C41（莪術(shù)呋喃二烯酮）、C44（雙環(huán)大牻牛兒烯）相關(guān)性良好。在圖2中可知LY2/G、LY2/AA是區(qū)分片姜黃、溫莪術(shù)、溫郁金的重要傳感器，而C41（莪術(shù)呋喃二烯酮）、C44（雙環(huán)大牻牛兒烯）為溫莪術(shù)的特有成分，也是區(qū)別于片姜黃、溫郁金的重要揮發(fā)性成分。同樣，LY2/LG 與C2（α-側(cè)柏烯）C6（葑烯）等多種烯烴類成分及C28（側(cè)柏酮）、C34（左旋香芹酮）等酮類成分具有一定相關(guān)性；LY2/gCT與C47（γ-衣蘭油烯），P40/1與C8（L-檸檬烯）的相關(guān)性良好。由此推測(cè)部分烯烴類、酮類成分可引起傳感器LY2/G、LY2/AA、LY2/LG、LY2/gCT、P40/1的變化，從而達(dá)到區(qū)分片姜黃、溫莪術(shù)、溫郁金的目的。

圖7 揮發(fā)性成分與電子鼻傳感器相關(guān)性PLS分析圖Fig.7 PLS plot showing the correlation between volatile components and sensory evaluation

3 討論

本研究運(yùn)用電子鼻和HS-GC-MS技術(shù)分別從整體香氣輪廓和具體香氣組分兩方面檢測(cè)溫郁金源3種中藥的氣味。電子鼻的PCA和PLS-DA模型能將片姜黃、溫莪術(shù)、溫郁金準(zhǔn)確區(qū)分，表明其樣品間的氣味特征存在明顯差異，2020年版《中國(guó)藥典》對(duì)片姜黃、溫莪術(shù)、溫郁金的氣味描述分別為“氣香特異”“氣香或微香”“氣微香”，表明建立的氣味判別模型符合2020年版《中國(guó)藥典》中對(duì)溫郁金源3種中藥的氣味描述。根據(jù)傳感器的特性，提示片姜黃、溫莪術(shù)、溫郁金中刺激傳感器LY2/gCT、LY2/Gh、LY2/gCTl、LY2/LG的揮發(fā)性成分對(duì)片姜黃、溫莪術(shù)、溫郁金氣味差異貢獻(xiàn)較大，可能為主要香氣物質(zhì)。利用HS-GC-MS對(duì)香氣成分作進(jìn)一步研究，鑒別得到48種揮發(fā)性成分，并對(duì)其種類和相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析得出烯烴類、酮類成分是區(qū)分片姜黃、溫莪術(shù)、溫郁金的主要成分。HS-GC-MS 與電子鼻的PCA 結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

電子鼻技術(shù)可實(shí)現(xiàn)溫郁金源3種中藥的氣味信息客觀化，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法從整體氣味角度對(duì)片姜黃、溫莪術(shù)、溫郁金進(jìn)行良好的識(shí)別，采用HSGC-MS 技術(shù)得到溫郁金源3種中藥的氣味電子鼻響應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)為烯烴類、酮類成分，為中藥產(chǎn)生氣味的物質(zhì)基礎(chǔ)與傳感器反應(yīng)機(jī)制提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。