基于p53通路探索芳基喹啉的抗結(jié)腸癌活性

魯玉凡，韓晨晨，武興康，秦雪梅

（山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006）

0 引言

P53是一種序列特異性的DNA結(jié)合蛋白，屬于轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄，參與基因組穩(wěn)定性、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、衰老、細(xì)胞自噬、炎癥和代謝等過程[1]。目前發(fā)現(xiàn)超過10種壓力信號(hào)誘導(dǎo)p53激活，包括代謝異常、蛋白質(zhì)合成障礙、DNA損傷、表觀遺傳改變、端粒侵蝕、衰老、線粒體自噬、癌基因成癮、缺氧和氧化還原失衡等。一些外源或內(nèi)源的壓力信號(hào)能夠降低p53的水平[2]，如人乳頭瘤病毒編碼的E6蛋白[3]，腺病毒編碼的SV40大T抗原[4]，幽門螺桿菌編碼的CagA蛋白[5]，腎上腺糖皮質(zhì)激素[6]和細(xì)胞因子[7]介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路，均能降低p53的水平。

腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命健康的重大疾病，其發(fā)病率呈逐年上升態(tài)勢。藥物治療是腫瘤治療的三大支柱療法之一，在過去70年來已經(jīng)為抗擊腫瘤做出突出貢獻(xiàn)。但抗腫瘤藥物通常毒性較大，個(gè)體之間療效差異大，特別是幾乎不可避免地會(huì)產(chǎn)生耐藥性[8]，使得抗腫瘤治療失敗。P53是腫瘤發(fā)生和治療過程中的關(guān)鍵基因，p53的突變促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和賦予腫瘤耐藥性的產(chǎn)生，腫瘤組織p53水平的升高是一些藥物抗腫瘤所必需的，而正常組織p53水平的升高引起放療及部分腫瘤治療藥物的毒副作用[9-10]。因此，探索p53對(duì)藥物刺激的響應(yīng)，為抗腫瘤藥物研究提供了一種思路。

本研究首先構(gòu)建p53熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，為評(píng)價(jià)細(xì)胞中p53介導(dǎo)的壓力刺激和壓力應(yīng)激提供一種途徑。為了探索該系統(tǒng)的應(yīng)用模式，以結(jié)腸癌細(xì)胞為模式細(xì)胞，建立p53熒光素酶報(bào)告基因穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞，利用該細(xì)胞發(fā)現(xiàn)抗結(jié)腸癌活性化合物。采用19個(gè)芳基喹啉衍生物3a-3s（圖1）為刺激藥物，該類化合物為6-取代芳基-2-甲氧基喹啉衍生物，具有一定的體外抗乳腺癌活性，然而其對(duì)其他腫瘤的抗癌活性研究尚未展開[11]。本研究通過采用p53熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，評(píng)價(jià)結(jié)腸癌細(xì)胞中p53對(duì)3a-3s刺激的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)抗結(jié)腸癌的最優(yōu)化合物及其作用機(jī)制，旨在建立基于p53信號(hào)通路的藥物篩選模型。

圖1 6-取代芳基-2-甲氧基喹啉衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of 6-substituted-aryl-2-methoxyquinoline derivatives

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

質(zhì)粒：慢病毒表達(dá)載體pCDH-CMV-MCSEF1-CopGFP-T2A-Puro購于美國Systembiop公司，慢病毒包裝載體psPAX2和PMD2.G獲贈(zèng)于山東大學(xué)藥學(xué)院，pp53-TA-luc載體購于碧云天。

抗體貨號(hào)及廠商：PARP抗體（66520-1-Ig，Proteintech），p53抗體（10442-1-AP，Proteintech），γH2AX（9718T，CST），GAPDH（EPR16891，Abcam）。

DMEM（1640）完全培養(yǎng)基：DMEM（1640）培養(yǎng)基購于Biological Industries，使用時(shí)加入硫酸鏈霉素和氨芐西林至50 μg/mL，加入FBS（Biological Industries）至10%，配制為完全培養(yǎng)基。

化合物：6-取代芳基-2-甲氧基喹啉衍生物3a?3s由山東大學(xué)藥學(xué)院沈月毛教授提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

PCR擴(kuò)增儀（TC-XP-D PCR儀，杭州博日科技有限公司）、瓊脂糖水平電泳儀（DYY-10C，北京六一儀器廠）、低溫冷凍離心機(jī)（Neofuge 13R，上海力申科技儀器有限公司）、多功能酶標(biāo)儀（Infinite 200Pro，TECAN）、垂直電泳儀（Mini-PROTEANTetra，Bio-rad）、凝膠成像儀（ChemiDoc XRS+，Bio-rad）、超微量分光光度計(jì)（Spectra?Max? QuickDrop?，Molecular Devices）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

液氮中取出凍存細(xì)胞，37℃快速解凍，1 000 g離心10 s，輕輕去除上清凍存液，用溫育培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一遍。培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于含有新鮮培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)盤，置于37℃，5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。293T/17、HCT116、SW480和HT29細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，HCT116（p53?/?）m 由廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院惠贈(zèng)。293T/17、HCT116和HCT116（p53?/?）細(xì)胞使用DMEM完全培養(yǎng)基，SW480細(xì)胞使用1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，HT29細(xì)胞用 DMEM/1640（1∶1）完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4 載體構(gòu)建

使用限制性內(nèi)切酶SnaB I和Not I（Thermo?fisher）處理慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro，雙酶切去除該載體的CMV啟動(dòng)子，獲得線性載體。以pp53-TA-luc載體為模板，PCR擴(kuò)增獲得插入片段，該片段由p53特異性結(jié)合序列的啟動(dòng)子（p53 DBD和minP）和熒光素酶報(bào)告基因組成。采用exonuclease III（Thermofisher）介導(dǎo)的基因克隆技術(shù)，連接插入片段和線性慢病毒載體，轉(zhuǎn)化Trans5α感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物），挑取單克隆，PCR驗(yàn)證獲得陽性克隆。選取陽性克隆，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證，獲得p53熒光素酶報(bào)告基因慢病毒載體pCDH-p53-Luc-EF1-CopGFP-T2A-Puro。

1.5 慢病毒包裝、感染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建

采用質(zhì)粒提取試劑盒（CW2104M，康為世紀(jì)）制備pCDH-p53-Luc-EF1-CopGFP-T2APuro、psPAX2和PMD2.G質(zhì)粒，測定濃度和純度，?20℃儲(chǔ)存。按照LipoFiter（漢恒生物）產(chǎn)品說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，包裝慢病毒。轉(zhuǎn)染前一天，293T/17細(xì)胞接種于6孔板，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～90%。轉(zhuǎn)染前，將LipoFiter和無血清DMEM培養(yǎng)基混合，質(zhì)粒DNA（pCDH-p53-luc-EF1-CopGFP-T2A-Puro：psPAX2：PMD2.G=2∶2∶1）和無血清 DMEM 培養(yǎng)基混合，室溫平衡5 min，二者輕輕混勻，室溫孵育20 min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。吸棄293T/17細(xì)胞的舊培養(yǎng)基，加入2 mL新鮮培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入培養(yǎng)基中，輕輕晃勻。轉(zhuǎn)染72 h后，收集培養(yǎng)基，0.44 μm濾膜過濾除去細(xì)胞碎片，獲得慢病毒。

感染前一天，對(duì)數(shù)生長期的目的細(xì)胞接種于六孔板，使感染時(shí)細(xì)胞匯合率約為30%。含有慢病毒的培養(yǎng)基和新鮮培養(yǎng)基按1∶1的體積混合，加入待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，加入protamine sulfate（Sigma）至 10 μg/mL，輕晃培養(yǎng)基混勻。培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后，熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)情況，觀察到綠色熒光后，用含嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基培進(jìn)行篩選，其濃度為 1 μg/mL～5 μg/mL，具體濃度根據(jù)細(xì)胞類型確定。經(jīng)過1～2周的持續(xù)篩選，感染細(xì)胞無死亡時(shí)，獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

1.6 熒光素酶的檢測

采用熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（RG005，碧云天）檢測熒光素酶的表達(dá)水平。待檢測細(xì)胞，PBS洗滌一遍，用報(bào)告基因細(xì)胞裂解液充分裂解后，12 000g離心5 min，取50 μL上清細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至96孔白板中，加入50 μL平衡至室溫的熒光素酶檢測試劑，快速混勻后，用多功能酶標(biāo)儀的化學(xué)發(fā)光模式檢測光強(qiáng)度Aluc。測定蛋白裂解液中蛋白濃度A280，用蛋白濃度對(duì)光強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理。

1.7 體外抗腫瘤活性分析

采用磺酰羅丹明B（SRB）分析法測定體外抗腫瘤活性。對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化，根據(jù)細(xì)胞類型用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為3～7×104個(gè)/mL，接種于 96孔板中，每孔 100 μL，培養(yǎng)過夜貼壁。將藥物加入細(xì)胞中至待測濃度，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。去除培養(yǎng)基，輕輕加入100 μL預(yù)冷的10%（M/V）三氯乙酸，4℃固?μL的0.4%SRB染色液（SRB溶于1%冰醋酸），染色15 min。去除染色液，1%的冰醋酸洗滌五遍去除未結(jié)合染料。室溫干燥，加入100 μL～200 μL 的 10 mmol/L Tris（pH 10.0）溶液，待染料完全溶解后，酶標(biāo)儀檢測OD570nm。細(xì)胞生長抑制率（%）=（OD對(duì)照─OD樣品）/（OD對(duì)照─OD空白）×100%，其中OD對(duì)照是未用藥物處理組吸光度，OD樣品是藥物處理組吸光度，OD空白是未有細(xì)胞組吸光度。

1.8 細(xì)胞死亡率分析

使用乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性試劑盒（碧云天，C0016）檢測培養(yǎng)基中的LDH釋放量測定細(xì)胞死亡率。藥物處理細(xì)胞的方法與上述體外抗腫瘤活性分析的方法一致，但設(shè)置了兩個(gè)對(duì)照組。其中1個(gè)對(duì)照組加入培養(yǎng)基體積的10%的LDH釋放液，吹打混勻，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h，記為最大酶活組。到達(dá)預(yù)定時(shí)間后，400 g離心，取120 μL培養(yǎng)基上清，轉(zhuǎn)移至新的96孔板，加入60 μL的LDH檢測液，輕晃混勻，室溫避光孵育30 min，酶標(biāo)儀檢測OD490nm。同時(shí)，應(yīng)用SRB分析法測定細(xì)胞的OD570nm，檢測各孔的相對(duì)細(xì)胞量，用作對(duì)每孔LDH釋放量進(jìn)行歸一化處理（相對(duì)于細(xì)胞量的LDH釋放量：RLDH=OD490nm/OD570nm），消除孔間由于細(xì)胞數(shù)量不同引起的差異。細(xì)胞死亡率（%）=（RLDH樣品─RLDH對(duì)照）/（RLDH最大酶活─RLDH空白），其中RLDH樣品是藥物處理組的相對(duì)LDH釋放量，RLDH對(duì)照是未用藥物處理組的相對(duì)LDH釋放量，RLDH最大酶活是加入LDH釋放劑組的相對(duì)LDH釋放量。

1.9 Western Blot

細(xì)胞刮收集細(xì)胞，用1×上樣緩沖液（50 mM Tris-HCl，pH 6.8，2%SDS，12.5%（V/V）甘油，50 mmol/L DTT，0.01%溴酚藍(lán)）溶解后，超聲處理打碎DNA，95℃煮沸5 min，制備成蛋白樣品，測定A280分析蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白樣品，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)印有蛋白的PVDF膜，用5%的BSA（BSA溶解于TBST中）室溫封閉60 min。配制一抗溶液，將膜浸入其中，4℃孵育過夜。一抗完畢后，用TBST 緩沖 液（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6，130 mmol/L NaCl，0.1%Tween-20）洗 滌 膜 3次，每次5 min，二抗室溫孵育60 min。二抗完畢后，用TBST洗滌膜3次，每次5 min，準(zhǔn)備顯影。配制ECL顯影液，將膜浸泡于顯影液中，1 min后，用凝膠成像儀觀察拍照，使用Image lab軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.10 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析和圖表制作采用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行，顯著性差異采用Two-way ANOVA進(jìn)行分析，*P<0.5，**P<0.1，ns表示沒有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 P53熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的構(gòu)建

P53熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)通過構(gòu)建p53熒光素酶報(bào)告基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株建立（圖2（a））。為了高效獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，首先構(gòu)建基于慢病毒轉(zhuǎn)染的p53熒光素酶報(bào)告基因載體，其次通過慢病毒轉(zhuǎn)染的手段實(shí)現(xiàn)對(duì)p53熒光素酶報(bào)告基因的高效轉(zhuǎn)染，最后通過抗性篩選獲得p53熒光素酶報(bào)告基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。以pCDHCMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro慢病毒表達(dá)載體為骨架載體，將該載體啟動(dòng)外源基因表達(dá)的CMV啟動(dòng)子（CMV promoter），替換為含有p53特異性結(jié)合序列的啟動(dòng)子（p53 DBD和minP），然后在該啟動(dòng)子序列后插入報(bào)告基因熒光素酶，構(gòu)建成p53報(bào)告基因慢病毒載體pCDH-p53-Luc-EF1-CopGFP-T2A-Puro。重組慢病毒和包裝載體共同轉(zhuǎn)染293T/17細(xì)胞，包裝病毒。包裝好的病毒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，用嘌呤霉素篩選，獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

圖2 基于p53信號(hào)通路的抗結(jié)腸癌藥物篩選模型的建立。（a）P53熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的構(gòu)建流程。（b）5FU誘導(dǎo)HCT116中p53的表達(dá)。HCT116p53-Luc和HCT116（p53-/-）p53-Luc細(xì)胞用5FU處理細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，western blot檢測p53的表達(dá)水平。然后，用Image lab軟件對(duì)（b）中條帶進(jìn)行灰度分析。以GAPDH為參照，計(jì)算p53條帶的相對(duì)密度，數(shù)據(jù)在（c）中展示，數(shù)據(jù)重復(fù)次數(shù)n=3，表示為mean± SD。（d）5FU對(duì)HCT116p53-Luc和HCT116（p53-/-）p53-Luc細(xì)胞中熒光素酶的影響。用5FU處理HCT116p53-Luc和HCT116（p53-/-）p53-Luc細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，分析熒光素酶的活性。數(shù)據(jù)重復(fù)次數(shù)n=3，表示為平均數(shù)±SDFig.2 Establishment of p53 signaling pathway-based anti-CRC drug screening models.(a)Schematic diagram of constructing p53 luciferase report gene system.(b)5FU induced the expression of p53 in HCT116 cells.HCT116p53-Lucand HCT116(p53-/-)p53-Luc cells were treated with 5FU for 24 h and collected for the detection of p53 levels through western bloting.Then,the band density was analyzed by Image lab software.The relative band density of p53 was calculated through defining GAPDH as control.The data were displayed in(c)and presented as mean±SD(n=3).(d)The effect of 5FU on luciferase activity in HCT116p53-Lucand HCT116(p53-/-)p53-Luccells.HCT116p53-Lucand HCT116(p53-/-)p53-Luc cells were treated with 5FU for 24 h and collected for the analysis of luciferase activity.The data were presented as mean±SD(n=3)

為了評(píng)價(jià)p53熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的功能，以結(jié)腸癌細(xì)胞為模式細(xì)胞，構(gòu)建pCDH-p53-Luc-EF1-CopGFP-T2A-Puro載體的HCT116和HCT116（p53?/?）穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，分別命名為HCT116p53?Luc和 HCT116（p53?/?）p53?Luc，檢測該系統(tǒng)是否能夠評(píng)價(jià)結(jié)腸癌細(xì)胞中p53對(duì)5氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5FU）的響應(yīng)。5FU是抗結(jié)腸癌常用化療藥物，能夠激活細(xì)胞中p53的表達(dá)[12]。首先，采用 western blot檢測 5FU 處理后，兩株細(xì)胞內(nèi)p53表達(dá)水平的變化。5FU能夠誘導(dǎo)HCT116p53?Luc細(xì)胞內(nèi)p53表達(dá)水平的升高，而對(duì) p53 敲除細(xì)胞株 HCT116（p53?/?）p53?Luc中的 p53水平?jīng)]有影響（圖2（b）和 2（c））。進(jìn)一步，采用熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒，評(píng)價(jià) 5FU處理后，HCT116p53?Luc和 HCT116（p53?/?）p53?Luc細(xì)胞中，熒光素酶的活性變化。結(jié)果表明，5FU能夠誘導(dǎo)HCT116p53?Luc細(xì)胞中，熒光素酶活性的顯著增加（圖2（d）），與p53表達(dá)水平的變化一致（圖2（c））。而在HCT116（p53?/?）p53?Luc細(xì)胞中，熒光素酶活性水平不受5FU的影響（圖2（d）），與 western blot檢測所得結(jié)果一致（圖2（c））。綜上結(jié)果，構(gòu)建的p53熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，能特異性檢測結(jié)腸癌細(xì)胞中p53對(duì)抗腫瘤藥物的響應(yīng)。

2.2 6-取代芳基-2-甲氧基喹啉類p53表達(dá)激活劑的發(fā)現(xiàn)

為了利用p53熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)篩選抗結(jié)腸癌藥物，探索19個(gè)6-取代芳基-2-甲氧基喹啉衍生物對(duì)HCT116p53?Luc細(xì)胞中熒光素酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞p53表達(dá)激活劑。結(jié)果表明，19個(gè)化合物中，化合物3i和3s一定程度上提高HCT116p53?Luc細(xì)胞中熒光素酶的活性，且3i對(duì)熒光素酶活性的誘導(dǎo)能力大于3s（圖3（a）），表明化合物3i和3s具有激活p53表達(dá)的潛力。為了進(jìn)一步確證該結(jié)果，利用west?ern blot檢測3i和3s對(duì)HCT116細(xì)胞內(nèi)p53表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，在HCT116細(xì)胞中，3i和3s能夠誘導(dǎo)p53的表達(dá)，且3i對(duì)p53表達(dá)的誘導(dǎo)能力要強(qiáng)于 3s（圖3（b）和 3（c）），與 HCT116p53?Luc中報(bào)告基因檢測所得結(jié)果一致；而在HCT116（p53?/?）中，由于該細(xì)胞株缺失 p53，沒有檢測到3i和3s對(duì)其中的p53表達(dá)的誘導(dǎo)（圖3（b））。這說明6-取代芳基-2-甲氧基喹啉衍生物3i和3s激活結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中p53的表達(dá)。

圖3 利用p53熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)從6-取代芳基-2-甲氧基喹啉衍生物中鑒定p53表達(dá)激活劑。（a）化合物3a-3s對(duì)HCT116p53-Luc細(xì)胞中熒光素酶活性的影響。用圖中所示化合物（40 μmol/L）處理HCT116p53-Luc細(xì)胞24 h，5FU為陽性化合物，測定細(xì)胞中熒光素酶活性。數(shù)據(jù)重復(fù)次數(shù)n=3，表示為mean±SD。（b）化合物3i和3s誘導(dǎo)HCT116中p53的表達(dá)。所示濃度的3i和3s處理HCT116和HCT116（p53-/-）細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，western blot檢測p53的表達(dá)水平。用Image lab軟件對(duì)圖中條帶進(jìn)行灰度分析，以GAPDH為參照，計(jì)算p53條帶的相對(duì)密度，其結(jié)果在（c）圖顯示。數(shù)據(jù)重復(fù)次數(shù)n=3，表示為平均數(shù)±SD。ns表示沒有顯著性差異，**P<0.0021Fig.3 Identifying p53 expression activators from 6-substituted-aryl-2-methoxyquinoline derivatives through using p53 luciferase report gene system.(a)The effect of compound 3a-3s on the luciferase activity of HCT116p53-Luc.HCT116p53-Luccells were treated with indicated compounds at a dose of 40 μmol/L for 24 h,and subjected to luciferase activity analysis.5FU was used as a positive control.The data were presented as mean±SD(n=3).(b)Compound 3i and 3s induced the expression of p53 in HCT116 cells.HCT116 and HCT116(p53-/-)cells were treated with 3i and 3s at indicated concentrations for 24 h and collected for the detection of p53 levels through western blot.Then,the band density was analyzed by Image lab software.The relative band density of p53 was calculated through defining GAPDH as control.The data were displayed in(c)and presented as mean±SD(n=3),ns was indicated as not significant,**P<0.0021

2.3 6-取代芳基-2-甲氧基喹啉衍生物的抗結(jié)腸癌作用

藥物誘導(dǎo)的p53水平的提高，起著促進(jìn)修復(fù)藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞壓力損傷的作用，當(dāng)細(xì)胞損傷修復(fù)失敗，p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因而p53表達(dá)激活劑通常具有抗腫瘤活性。為了評(píng)價(jià)6-取代芳基-2-甲氧基喹啉衍生物的抗結(jié)腸癌活性，測定了40 μmol/L的3a-3s對(duì)HCT116細(xì)胞的體外抗腫瘤活性。結(jié)果顯示，3i對(duì)HCT116細(xì)胞的體外抗腫瘤活性最強(qiáng)，3l和3s的活性次之（圖4（a））。測定了不同濃度的3i和3s對(duì)四株結(jié)腸癌細(xì)胞 HCT116、HCT116（p53?/?）、HT29和SW480細(xì)胞的體外抗腫瘤活性。HCT116是p53 野生型細(xì)胞，而 HCT116（p53?/?）、HT29 和SW480是p53功能缺陷型細(xì)胞。結(jié)果顯示，隨著作用濃度的增加，3i和3s對(duì)四株細(xì)胞的生長抑制作用增強(qiáng)，表明3i和3s呈現(xiàn)濃度依賴性的抗腫瘤活性（圖4（b））。隨著作用時(shí)間延長而增強(qiáng)，3i和3s對(duì)HCT116細(xì)胞的生長抑制作用增強(qiáng)，表明3i和3s呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的抗腫瘤活性（圖4（b））。在 HCT116（p53?/?）、HT29 和SW480細(xì)胞中，3i和3s作用24 h的抗腫瘤活性強(qiáng)于作用48 h和72 h的，表明這三株細(xì)胞隨著藥物處理時(shí)間的延長而產(chǎn)生耐藥性（圖4（b））。這說明6-取代芳基-2-甲氧基喹啉衍生物3i和3s具有潛在的抗結(jié)腸癌活性，其藥物敏感性與p53的活性水平相關(guān)。

圖4 6-取代芳基-2-甲氧基喹啉衍生物的體外抗結(jié)腸癌活性評(píng)價(jià)。（a）化合物3a-3s對(duì)HCT116的細(xì)胞生長抑制作用。用圖中所示濃度的化合物處理HCT116細(xì)胞24 h，5FU為陽性化合物，然后進(jìn)行體外抗腫瘤活性分析。數(shù)據(jù)：n=3，mean±SD。（b）3i和3s的體外抗結(jié)腸癌細(xì)胞活性。四株結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、HCT116（p53-/-）、HT29和SW480用圖中所示濃度的3i和3s處理24、48、72 h，然后進(jìn)行體外抗腫瘤活性分析。數(shù)據(jù)：n=3，平均數(shù)±SDFig.4 Evaluating the in vitro antitumor activities of 6-substituted-aryl-2-methoxyquinoline derivatives against CRC.(a)The effect of compound 3a-3s on the cell growth inhibition against HCT116 cells.HCT116 cells were treated with indicated compounds at a dose of 40 μmol/L?1for 24 h,and subjected to in vitro antitumor analysis.5FU was used as a positive control.The data were presented as mean±SD(n=3).(b)The antitumor activities of compound 3i and 3s against colorectal cancer.Four CRC cell lines HCT116,HCT116(p53-/-),HT29 and SW480 cells were respectively treated with 3i and 3s at indicated concentrations for 24 h,48 h and 72 h,and subjected to in vitro antitumor analysis.The data were presented as mean±SD(n=3)

2.4 化合物3i和3s的抗結(jié)腸癌作用機(jī)制

為了進(jìn)一步發(fā)掘6-取代芳基-2-甲氧基喹啉衍生物3i和3s的抗結(jié)腸癌機(jī)制，采用western blot評(píng)價(jià)了代表化合物3i和3s對(duì)DNA損傷標(biāo)志蛋白γH2AX和凋亡標(biāo)志蛋白PARP裂解的影響。結(jié)果顯示，3i和 3s在 HCT116 和 HCT116（p53?/?）細(xì)胞中能夠誘導(dǎo)γH2AX水平的升高，且呈現(xiàn)濃度依賴性（圖5（a）），表明3i和3s引起 DNA損傷。3i和3s在HCT116細(xì)胞中濃度依賴性地誘導(dǎo)PARP的裂解，而在 HCT116（p53?/?）中，只有高濃度的3i和3s才能誘導(dǎo)PARP的裂解（圖5（a）），表明p53介導(dǎo)3i和3s誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，p53缺失引起凋亡抵抗。此外，p53缺失不影響3i和3s誘導(dǎo)DNA損傷的能力，但減弱3i和3s誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力（圖5（b）），表明3i和3s通過激活p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。3s對(duì)DNA損傷和p53表達(dá)激活的誘導(dǎo)能力均弱于3i，3i和3s對(duì)DNA損傷和p53表達(dá)激活的誘導(dǎo)能力呈正相關(guān)，而p53缺失不影響3i和3s誘導(dǎo)的DNA損傷（圖3（b）和5（b）），表明3i和3s通過誘導(dǎo)DNA損傷激活p53。

圖5 3i和3s的抗結(jié)腸癌作用機(jī)制研究。（a）P53介導(dǎo)3i和3s誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。圖中所示濃度的3i和3s處理HCT116和HCT116（p53-/-）細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，western blot檢測圖中蛋白的表達(dá)水平。用Image lab軟件對(duì)圖中條帶進(jìn)行灰度分析，以GAPDH（PARP）為參照，計(jì)算γH2AX（Cleaved-PARP）條帶的相對(duì)密度，其結(jié)果在（b）圖顯示。數(shù)據(jù)重復(fù)次數(shù)n=3，表示為平均數(shù)± SD。ns表示沒有顯著性差異，*P<0.05，**P<0.01。（c）P53缺陷減弱3i和3s誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。圖中所示濃度的3i和3s處理HCT116、HCT116（p53-/-）、HT29和SW480細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，分析細(xì)胞死亡率。數(shù)據(jù)重復(fù)次數(shù)n=3，表示為平均數(shù)±SD。ns表示沒有顯著性差異Fig.5 Mining the anti-CRC mechanism of 3i and 3s.(a)P53 was involved in the apoptosis induced by 3i and 3s.HCT116 and HCT116(p53-/-)cells were treated with 3i and 3s at indicated concentrations for 24 h and collected for the detection of indicated proteins through western blot.Then,the band density was analyzed by Image lab software.The relative band density of γH2AX(Cleaved-PARP)was calculated through defining GAPDH(PARP)as control.The data were displayed in(b)and presented as mean±SD(n=3),ns was indicated as not significant,*P<0.05,**P<0.01.(c)P53 deficiency abated cell death induced by 3i and 3s.HCT116,HCT116(p53-/-),HT29 and SW480 cells were treated with 3i and 3s at indicated concentrations for 24 h and subjected to cell death assay.The data were presented as mean±SD(n=3),ns was indicated as not significant

3i和3s處理四株結(jié)腸癌細(xì)胞后，HCT116細(xì)胞的細(xì)胞死亡率顯著大于 HCT116（p53?/?）、HT29和SW480細(xì)胞的細(xì)胞死亡率（圖5（c））。HCT116（p53?/?）、HT29和 SW480細(xì)胞是 3株 p53功能缺陷的細(xì)胞株，HCT116（p53?/?）中p53被敲除，HT29和SW480細(xì)胞中存在p53 R273H的突變，該突變引起p53功能缺陷。因此，p53缺陷減弱3i和3s誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，表明3i和3s通過p53引起細(xì)胞死亡。

3 討論

靶點(diǎn)藥物篩選和表型藥物篩選是藥物發(fā)現(xiàn)的主要策略。“靶點(diǎn)藥物篩選”以鑒定“藥物─靶點(diǎn)”互作為策略，是過去30 a藥物發(fā)現(xiàn)的主要手段，但其體內(nèi)脫靶引起較高臨床磨損率[13]?！氨硇退幬锖Y選”以“藥物→疾病表型”為指導(dǎo)，綜合考慮疾病的復(fù)雜性，具有較高的藥效成功率，但其不易解析藥物作用機(jī)制和靶點(diǎn)[13]。藥物以“藥物→靶點(diǎn)→信號(hào)通路→藥效”途徑發(fā)揮作用，通常藥物與靶點(diǎn)呈現(xiàn)“一對(duì)多”的互作模式調(diào)控信號(hào)通路，發(fā)揮藥效，信號(hào)通路在藥物作用中起承上啟下的作用。基于“信號(hào)通路”的藥物篩選策略既能提高藥物篩選的藥效成功率，又有利于藥物作用機(jī)制解析，是創(chuàng)新藥物研究策略、研究方法和技術(shù)發(fā)展的必然趨勢[14]。本研究以多種疾病相關(guān)基因p53為研究對(duì)象，建立p53熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，旨在建立p53通路的藥物篩選模式。利用該系統(tǒng)進(jìn)行抗結(jié)腸癌藥物篩選，化合物3a?3s中激活結(jié)腸癌細(xì)胞中p53水平的最優(yōu)化合物為3i，抗結(jié)腸癌最優(yōu)化合物為3i。前期研究表明，化合物3a-3s中，抗乳腺癌最優(yōu)化合物為 3b[11]，而應(yīng)用本研究建立的篩選系統(tǒng)獲得的抗結(jié)腸癌最優(yōu)化合物為3i。這表明本研究構(gòu)建的p53熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)是抗腫瘤藥物篩選的一種有效模型，而針對(duì)其他疾病藥物的篩選還需進(jìn)一步研究。

藥物作用機(jī)制的研究是創(chuàng)新藥物研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，基于信號(hào)通路藥物篩選策略有利于藥物的作用機(jī)制解析。本研究基于p53表達(dá)激活的篩選發(fā)現(xiàn)，3a?3s中抗結(jié)腸癌最優(yōu)的化合物為3i。DNA損傷通常是抗腫瘤藥物誘導(dǎo)p53表達(dá)激活的重要因素，而p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的重要機(jī)制。本研究優(yōu)先聚焦于p53表達(dá)激活的關(guān)鍵因素之一DNA損傷，以及p53表達(dá)激活的關(guān)鍵功能之一細(xì)胞凋亡，解析3i抗結(jié)腸癌的作用機(jī)制。通過在HCT116和HCT116（p53?/?）中檢測3i對(duì)DNA損傷和凋亡標(biāo)志蛋白γH2AX和PARP的影響，表明3i通過DNA損傷激活的p53依賴的細(xì)胞凋亡抗結(jié)腸癌，對(duì)p53表達(dá)激活較弱的3s，抗結(jié)腸癌、誘導(dǎo)DNA損傷和細(xì)胞凋亡的活性均較弱。這表明通過p53熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)篩選藥物提高藥物作用機(jī)制的研究效率。

腫瘤異質(zhì)性引起抗腫瘤藥物的治療失敗，不同的腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性千差萬別，抗腫瘤藥物只能殺死一部分敏感細(xì)胞，而不敏感細(xì)胞對(duì)藥物無效，引起耐藥性的產(chǎn)生[15]?；蛲蛔兪且鹉[瘤異質(zhì)性的主要原因之一，超過50%的腫瘤攜帶有p53的突變，p53的突變能夠使腫瘤細(xì)胞對(duì)放療和引起DNA損傷的化療藥物產(chǎn)生抗性，影響腫瘤的治療[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，3i對(duì) HCT116細(xì)胞的抗腫瘤活性隨著作用時(shí)間延長而增強(qiáng)，而對(duì)HT29和SW480細(xì)胞的抗腫瘤活性隨著作用時(shí)間延長而增減弱，這表明HT29和SW480細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。HT29和SW480細(xì)胞中存在p53 R273H的突變[17]，該突變引起p53功能缺失，使得p53依賴的細(xì)胞死亡減弱[18]，賦予細(xì)胞對(duì)3i產(chǎn)生耐藥性。因此，通過p53熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)篩選抗腫瘤藥物，能夠指導(dǎo)藥物敏感細(xì)胞和非敏感細(xì)胞的高效發(fā)現(xiàn)，有利于藥物的精準(zhǔn)應(yīng)用。

4 結(jié)論

本研究采用“信號(hào)通路藥物篩選”策略，聚焦于多種疾病相關(guān)基因p53，構(gòu)建p53熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，用以評(píng)價(jià)p53介導(dǎo)的壓力應(yīng)激機(jī)制研究。通過構(gòu)建結(jié)腸癌細(xì)胞的p53熒光素酶報(bào)告基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，從19個(gè)6-取代芳基-2-甲氧基喹啉類衍生物3a?3s中篩選出最優(yōu)抗結(jié)腸癌化合物3i。初步分子機(jī)制研究顯示，3i在結(jié)腸癌細(xì)胞中引起DNA損傷，誘導(dǎo)p53表達(dá)水平升高，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起細(xì)胞死亡，發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用；而p53功能缺陷的結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)3i具有耐藥性（圖6）。

圖6 3i的抗結(jié)腸癌作用機(jī)制示意圖Fig.6 Diagram showing the anti-CRC mechanism of 3i