Pam3CSK4與黃連素聯(lián)合用藥對小鼠抗MRSA感染的作用

彭珊珊， 劉思思， 巫謝生， 孫 靜， 張 詠*

(1.江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)院， 南昌 330000； 2.南昌大學(xué)藥學(xué)院， 南昌 330036)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是目前世界上最常見的社區(qū)和院內(nèi)感染因素之一，常見于燒傷、創(chuàng)傷科等，它幾乎可以感染身體的全部器官和組織，引起各種炎癥和并發(fā)癥甚至毒血癥等[1].金葡菌感染死亡率高，到目前為止所已知的人類致病菌中，沒有一種菌的具有如金葡菌一樣廣泛的致病機(jī)制和毒性機(jī)制.金黃色葡萄球菌自身擁有多種免疫逃避機(jī)制可以抵抗機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用[2].加之金葡菌的耐藥性問題日漸嚴(yán)重，耐甲氧西林甚至耐萬古霉素的金葡菌的出現(xiàn)，使得其感染的防治問題越發(fā)棘手.

Pam3CSK4(Pam3Cys-Ser-(Lys)4)是Toll樣受體2(toll like receptor 2， TLR2)的模式識(shí)別分子，是細(xì)菌脂蛋白的人工模擬物.在此前的研究中使用了TLR2的激動(dòng)劑Pam3CSK4去處理小鼠肺炎、腎膿腫模型，結(jié)果顯示Pam3CSK4預(yù)處理對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus， MRSA)攻擊的小鼠病理模型具有保護(hù)作用，能顯著延長小鼠的生存時(shí)間和生存率，小鼠各臟器對MRSA清除能力顯著增加，同時(shí)顯著降低MRSA攻擊后小鼠促炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IL-6和IFN-γ的產(chǎn)生[3].Pam3CSK4預(yù)處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞能增強(qiáng)其對MRSA殺菌能力，并降低相應(yīng)炎癥反應(yīng)[4].對中性粒細(xì)胞的預(yù)處理可以增強(qiáng)對MRSA的吞噬功能和抗菌能力[5-6].表明利用Pam3CSK4干預(yù)TLR2，可能可以對抗金葡菌感染攻擊，又能同時(shí)抑制續(xù)發(fā)的炎性病理反應(yīng)，避免對機(jī)體造成過度免疫反應(yīng)的二次打擊.

黃連素又名小檗堿，是黃連、黃柏等中的主要有效抗菌成分，在臨床上常以氯化物形式使用，廣泛應(yīng)用于消化道細(xì)菌性疾病.黃連素不僅具有顯著的廣譜抗菌能力，還具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力[7-8].它可以抑制MRSA的生物膜形成，對被膜態(tài)的金葡菌抑制效果較浮游態(tài)更好，而MRSA的耐藥性獲得與其生物膜的形成密切相關(guān)[9].黃連素還可以通過抑制P65信號通路產(chǎn)生炎癥抑制作用，對小鼠構(gòu)建的金黃色葡萄球菌引起的急性肺損傷模型起到保護(hù)作用[10].

為了應(yīng)對金葡菌的耐藥性難題，本文將黃連素與Pam3CSK4聯(lián)合使用以對抗MRSA的感染，黃連素在此作為抗菌藥物，可以對抗金葡菌的耐藥性，還具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力，Pam3CSK4作為免疫激動(dòng)劑可以調(diào)動(dòng)機(jī)體的先天性免疫，兩者相輔，可能在抗MRSA攻擊上具有良好效果，可以做為一種無抗生素的預(yù)防和治療金葡菌感染的手段.文中實(shí)驗(yàn)觀察了小鼠用藥后對MRSA的抵抗能力，并體外初步研究了感染過后的小鼠淋巴細(xì)胞對樹突狀細(xì)胞(dendritic cell， DC)的MRSA抗原提呈的反應(yīng)情況，驗(yàn)證黃連素與Pam3CSK4的聯(lián)用可以提高小鼠對抗MRSA感染效果，調(diào)動(dòng)機(jī)體特異性免疫反應(yīng)，為金黃色葡萄球菌的預(yù)防和治療提供新思路.

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：18～20 g的SPF級雌性昆明鼠(江西省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心).動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號為JXAMS=EWC-2019011).

菌種：耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株(MRSA，ATCC43300，江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存).

培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(Solarbio)，金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基(科瑪嘉)，RPMI 1640培養(yǎng)基(Solarbio)，胎牛血清(Gibco).

藥品：氯化小檗堿水合物(東京化成工業(yè)株式會(huì)社，TGI)，Pam3CSK4(invivogen).

細(xì)胞因子：GM-CSF(Pepro Tech)，IL-4(Pepro Tech).

染料、抗體和試劑盒：羊抗小鼠IgG-HRP(Solarbio)，小鼠免疫球蛋白M(IgM)檢測試劑盒(Biolegend)，CFSE(Abcam)，APC anti-mouse CD11c(Biolegend Inc)，PE anti-mouse MHCII(Biolegend Inc)，F(xiàn)ITC anti-mouse CD282(TLR2)(Biolegend Inc)，PE anti-mouse CD3(Biolegend Inc)，APC anti-mouse CD19(Biolegend Inc)，PE-Cy5 anti-mouse CD4(Biolegend Inc)，PE-Cy7 anti-mouse CD8(Biolegend Inc)．

1.2 MRSA菌液的配制

取MRSA用TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期，3 000 r·min-1離心取沉淀，用1 mL PBS稀釋，充分混勻后用紫外分光光度計(jì)檢測其600 nm波長處的吸光度，用PBS調(diào)整菌液濃度至6×109cfu·mL-1，2 h沸水水浴或40 min UV照射可以置備滅活的MRSA菌液[11].

1.3 細(xì)菌非致死劑量和致死劑量的確定

小鼠分組腹腔注射MRSA菌液，每組10只，每只分別注射1×108、5×108、1×109、1.5×109、2×109、2.5×109、3×109cfu，連續(xù)7 d觀察小鼠死亡情況，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用的腹腔注射MRSA的非致死劑量和致死劑量.

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

小鼠分組：聯(lián)合治療組、黃連素組、Pam3CSK4組、生理鹽水組、空白組，每組6只.聯(lián)合治療組先給予Pam3CSK4尾靜脈注射給藥，每只100 μg，給藥1次，1 d后進(jìn)行MRSA攻擊，同時(shí)每日黃連素灌胃給藥，每只2 mg；黃連素組先給予生理鹽水尾靜脈注射，給藥1次，1 d后進(jìn)行MRSA攻擊，同時(shí)黃連素每日灌胃給藥，每只2 mg；Pam3CSK4組先給予Pam3CSK4尾靜脈注射給藥，每只100 μg，給藥1次，1 d后進(jìn)行MRSA攻擊，同時(shí)生理鹽水灌胃給藥；生理鹽水組進(jìn)行一次生理鹽水尾靜脈注射，1 d后進(jìn)行MRSA攻擊，同時(shí)生理鹽水灌胃給藥；空白組不給藥.

1.5 小鼠致死攻擊保護(hù)實(shí)驗(yàn)

MRSA攻擊采取小鼠腹腔注射最大致死劑量MRSA，24 h內(nèi)每6 h觀察一次小鼠死亡情況，24～48 h內(nèi)每12 h觀察1次，36 h后每24 h觀察一次，累計(jì)1周，記錄死亡數(shù)、生存時(shí)間，計(jì)算存活率.

1.6 器臟細(xì)菌清除實(shí)驗(yàn)

非致死劑量MRSA的腹腔注射小鼠，3 d后頸椎脫臼處死小鼠，無菌條件下取小鼠肝、腎臟器，向組織中加入1 mL PBS溶液后勻漿，勻漿后10倍稀釋，取200 μL勻漿稀釋液涂布于金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后選擇平板上紫紅色、紅色、粉紅色的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)錄肝、腎上MRSA的細(xì)菌載量.

1.7 血清中免疫球蛋白IgG和IgM檢測

非致死劑量MRSA攻擊小鼠后第7 d對小鼠進(jìn)行眼球取血，離心分離血清，采用ELISA法分別檢測血清中MRSA特異性抗體IgG和總IgM的水平.

間接ELISA法檢測特異性IgG：將滅活的MRSA以1×108cfu·mL-1或溶血素-α以2 μg·mL-1用0.05 mol·L-1PH 9.4的碳酸鹽緩沖液重懸，加入ELISA板，每孔包被100 μL，4 ℃包被過夜.PBST洗板4次，加入200 μL 1% BSA，37 ℃封閉1 h.PBST洗板4次，加入100 μL待測血清，37 ℃孵育2 h.PBST洗板4次，加入100 μL羊抗小鼠IgG-HRP， 37 ℃孵育1 h.PBST洗板4次，加入100 μL TMB，避光孵育20 min，加入100 μL 1 M H2SO4終止反應(yīng).用酶標(biāo)儀在波長450 nm光下讀取吸光度[12].

ELISA法檢測總IgM：按照試劑盒說明書，在酶標(biāo)ELISA板上加待測血清100 μL，37 ℃孵育1 h.PBST洗板4次，加入100 μL酶標(biāo)二抗， 37 ℃孵育1 h.PBST洗板4次，加入100 μL TMB，避光孵育20 min，加入100 μL 終止液終止反應(yīng).用酶標(biāo)儀在波長450 nm光下讀取吸光度.

1.8 骨髓來源的樹突狀細(xì)胞DC制備

斷頸處死6周齡小鼠， 游離小鼠后腿兩側(cè)股骨，無菌取股骨骨髓細(xì)胞懸液，過200目篩，并調(diào)整密度為106cell· ml-1， 加入含GM-CSF(10 ng·mL-1)，IL-4(10 ng·mL-1)，10% 胎牛血清的RPMI1640，置于六孔板中于37 ℃、5% CO2培養(yǎng).48 h后吸去懸浮細(xì)胞換液，兩天半后半量換液， 7 d后利用APC anti-mouse CD11c和PE anti-mouse MHCII進(jìn)行標(biāo)記， 流式細(xì)胞儀檢測DC純度.

1.9 小鼠淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞制備

第10 d處死非致死劑量MRSA的小鼠， 無菌取腸系膜小鼠淋巴結(jié)，輕輕碾磨取淋巴結(jié)細(xì)胞懸液，過200目篩濾網(wǎng)，懸液離心重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù).

1.10 淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)到第7 d的DC加入滅活的MRSA刺激3 h，DC用FITC anti-mouse CD282染色，流式檢測其細(xì)胞表面TLR2表達(dá)情況.淋巴細(xì)胞懸液中加入CFSE染色，10 min后用50%的血清終止染色，離心洗去染液.將MRSA刺激后的DC與CFSE染色的淋巴細(xì)胞按1∶10的比例混合共培養(yǎng)3 d，收集細(xì)胞，用PE anti-mouse CD3，APC anti-mouse CD19，PE-Cy5 anti-mouse CD4，PE-Cy7 anti-mouse CD8進(jìn)行染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4、CD8和CD19陽性細(xì)胞的增殖情況.

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)與分析

2.1 腹腔注射MRSA非致死劑量和致死劑量的確定

為確定實(shí)驗(yàn)中MRSA的注射致死劑量和非致死劑量，對小鼠腹腔注射一系列不同劑量的MRSA懸液，連續(xù)觀察5 d小鼠的生存情況，結(jié)果如表1，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采取每只2×109cfu MRSA為腹腔注射的致死劑量，每只5×108cfu MRSA為非致死劑量.

表1 小鼠腹腔注射MRSA致死實(shí)驗(yàn)

2.2 黃連素與Pam3CSK4對小鼠在MRSA致死劑量攻擊下具有保護(hù)作用

為了探討黃連素、Pam3CSK4以及兩種藥物聯(lián)用對小鼠在MRSA攻擊下的保護(hù)作用，將小鼠分組成聯(lián)合治療組、黃連素組、Pam3CSK4組、生理鹽水組、空白組進(jìn)行給藥，每只小鼠腹腔注射2×109cfu 劑量的MRSA進(jìn)行攻擊，連續(xù)觀察小鼠的生存情況，計(jì)算小鼠的生存率如圖1所示.結(jié)果顯示聯(lián)合給藥組存活率最高，為66.7%；黃連素組存活率25%；Pam3CSK4組存存活率41.7%；生理鹽水組存活率16.7%.生存分析結(jié)果顯示，聯(lián)合給藥組與生理鹽水組對照相比，對小鼠的感染預(yù)保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果存活率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05).單獨(dú)給藥黃連素或Pam3CSK4對小鼠存活率無顯著差異.數(shù)據(jù)表明Pam3CSK4和黃連素聯(lián)合給藥可以有效提高小鼠感染后的存活率，黃連素或Pam3CSK4單獨(dú)給藥對小鼠感染后的存活情況有提高但并不明顯.說明黃連素的抗菌作用與Pam3CSK4的免疫激動(dòng)作用相結(jié)合，相對單獨(dú)給藥來對抗MRSA感染是有意義的.

注：*、**分別表示p<0.05、p<0.01.下同.

2.3 黃連素與Pam3CSK4降低小鼠器臟對MRSA的載量

為進(jìn)一步分析黃連素和Pam3CSK4抗MRSA的作用，每只小鼠給予非致死劑量5×108cfuMRSA腹腔注射攻擊并分組給藥，取其肝、腎臟勻漿后用金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基檢測其中的細(xì)菌載量.結(jié)果如圖2所示，聯(lián)合給藥和單獨(dú)Pam3CSK4給藥，統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低肝臟(p<0.05)和腎臟(p<0.01)的細(xì)菌量，而黃連素用藥對MRSA的清除率提高也有一定作用.在肝、腎臟清除MRSA的過程中，顯然Pam3CSK4通過其免疫激動(dòng)作用發(fā)揮了比黃連素的抗菌作用更大的效果，兩者的聯(lián)合使用似乎更加強(qiáng)了這種效果，從圖上看聯(lián)合給藥組在載菌量的整體水平相較于Pam3CSK4組還是雖然并不顯著，但是仍然更低一些.

圖2 分組給藥的小鼠肝、腎上MRSA的載菌量

2.4 Pam3CSK4影響小鼠血清中免疫球蛋白IgG和IgM的水平

在機(jī)體抗感染的過程中，體液免疫發(fā)揮了重要的作用，為了進(jìn)一步研究黃連素和Pam3CSK4抗MRSA的作用，采用ELISA法分析了各組小鼠感染后第七天血清中的免疫球蛋白IgG和IgM的水平.其中抗體特異性的IgG的檢測采用了間接ELISA法，將抗原即滅活的MRSA或溶血素-α包被到ELISA板上，再加入待測血清與抗原特異性結(jié)合，以酶標(biāo)二抗羊抗小鼠IgG-HRP顯色檢測[12].溶血素-α是金黃色葡萄球菌分泌的最重要的細(xì)胞毒素，以滅活的MRSA或溶血素-α分別為抗原檢測特異性IgG可以相互印證結(jié)果.總IgM的檢測采用雙抗夾心ELISA法.結(jié)果如圖3顯示，黃連素組和生理鹽水組的MRSA和溶血素-α特異性IgG水平都沒有明顯差別，Pam3CSK4組和聯(lián)合給藥組特異性IgG水平也沒有明顯差別，黃連素組和生理鹽水組顯著性高于Pam3CSK4組和聯(lián)合給藥組的特異性IgG水平；與之相反，Pam3CSK4組和聯(lián)合給藥組的總IgM的量要高于黃連素組和生理鹽水組，黃連素組和生理鹽水組的總IgM水平無明顯差異，Pam3CSK4組和聯(lián)合給藥組也無明顯差異.表明Pam3CSK4會(huì)降低小鼠對MRSA的IgG分泌水平但是會(huì)增加IgM的分泌，黃連素對IgG和IgM的分泌無明顯影響.

圖3 分組給藥對血清中特異性IgG和總IgM水平的影響

2.5 黃連素與Pam3CSK4影響小鼠淋巴細(xì)胞的增殖

為了觀察黃連素和Pam3CSK4對淋巴細(xì)胞的增殖的影響，首先培養(yǎng)健康小鼠的樹突狀細(xì)胞(DC)，培養(yǎng)到第6 d的DC用滅活的MRSA進(jìn)行刺激，流式檢測其TLR2的表達(dá)情況.結(jié)果如圖4所示，培養(yǎng)到第6 d的細(xì)胞，CD11c陽性細(xì)胞比例61%以上，MHCII、CD11c雙陽性細(xì)胞52.6%(圖4a).DC細(xì)胞經(jīng)過MRSA刺激后，TLR2表達(dá)量由未經(jīng)細(xì)菌刺激前的20.5%提高到25.1%，提示DC細(xì)胞接受了抗原刺激，其TLR2表達(dá)量提高(圖4b).然后在各給藥組進(jìn)行了非致死劑量MRSA攻擊的10 d，取小鼠腸系膜淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞，與DC細(xì)胞共培養(yǎng)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測圈出CD3+細(xì)胞為T淋巴細(xì)胞，CD19+細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞，在CD3+細(xì)胞群中圈出CD4+和CD8+細(xì)胞，CD4+亞群是輔助性T細(xì)胞，CD8+亞群是毒性T細(xì)胞，利用染色的CFSE檢測各類細(xì)胞的增殖情況.

a.CD11c和MHCll雙陽性的DC細(xì)胞;b.無MRSA刺激的DC細(xì)胞TLR2表達(dá);c.MRSA刺激的DC細(xì)胞TLR2表達(dá)

CD4+的T淋巴細(xì)胞的增殖情況如圖5所示，結(jié)果顯示，未經(jīng)過共培養(yǎng)的CD4+T淋巴細(xì)胞幾乎沒有增殖，與DC細(xì)胞共培養(yǎng)的空白組CD4+T淋巴細(xì)胞增值率均數(shù)為20.1%，共培養(yǎng)后生理鹽水組CD4+T細(xì)胞增殖量均數(shù)為24.5%，黃連素組CD4+T細(xì)胞增殖量約26.7%，Pam3CSK4組CD4+T細(xì)胞增殖量約31.7%，聯(lián)合給藥組CD4+T細(xì)胞增殖量約37.5%.生理鹽水組較空白組而言，相當(dāng)于DC細(xì)胞給予了CD4+T淋巴細(xì)胞第二次的激活，其增殖量有所增長，符合淋巴細(xì)胞的增殖規(guī)律.聯(lián)合給藥組的CD4+T細(xì)胞增殖量最大，顯著性高于生理鹽水組和黃連素組(p<0.05).而單獨(dú)給藥的兩組，雖然在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯提高CD4+T細(xì)胞的增殖，但整體水平依然高于生理鹽水組，特別是Pam3CSK4組，由于藥物聯(lián)合使用對CD4+T細(xì)胞增殖的確實(shí)有明顯的促進(jìn)效果，可以推論兩種藥物都有可能可以對輔助性T細(xì)胞的有促進(jìn)作用，且Pam3CSK4的促進(jìn)效果更加明顯.

圖5 CD4+ T淋巴細(xì)胞的增殖

CD8+的T淋巴細(xì)胞的增殖情況如圖6所示，結(jié)果顯示，未共培養(yǎng)的CD8+T淋巴細(xì)胞幾乎沒有增殖，與DC細(xì)胞共培養(yǎng)的空白組CD8+T淋巴細(xì)胞增值率均數(shù)為5.67%，共培養(yǎng)后生理鹽水組CD8+T細(xì)胞增殖量約16.6%，黃連素組CD8+T細(xì)胞增殖量約16.1%，Pam3CSK4組CD8+T細(xì)胞增殖量約23.9%，聯(lián)合給藥組CD8+T細(xì)胞增殖量約20.2%.黃連素的單獨(dú)給藥對CD8+T細(xì)胞的增殖無明顯影響，Pam3CSK4單獨(dú)給藥可以明顯促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖(p<0.05)，藥物聯(lián)合使用對CD8+T細(xì)胞增殖的促進(jìn)水平稍大于黃連素單獨(dú)使用4.1%，相較于Pam3CSK4組對其的影響反而有所下降，這是否與黃連素的免疫調(diào)節(jié)能力相關(guān)，其中原因尚需進(jìn)一步探索.

圖6 CD8+ T淋巴細(xì)胞的增殖

B淋巴細(xì)胞的增殖情況如圖7所示，結(jié)果顯示，未與DC細(xì)胞共培養(yǎng)的CD19+B淋巴細(xì)胞幾乎沒有增殖，與DC細(xì)胞共培養(yǎng)的空白組B淋巴細(xì)胞增值率為2.28%，共培養(yǎng)后生理鹽水組B細(xì)胞增殖量約6.13%，黃連素組B細(xì)胞增殖量約11.3%，Pam3CSK4組B細(xì)胞增殖量約20.1%，聯(lián)合給藥組B細(xì)胞增殖量約20.6%.結(jié)果可以看出， Pam3CSK4組較聯(lián)合給藥組幾乎沒有差別，都可以很大程度促進(jìn)B細(xì)胞的增殖；盡管p>0.05，從圖7上看黃連素的單獨(dú)給藥對B細(xì)胞的增殖也有明顯程度的促進(jìn).但兩種藥物共同作用，對促進(jìn)B細(xì)胞的增殖并未產(chǎn)生聯(lián)合放大的作用.

圖7 B淋巴細(xì)胞的增殖

3 討論

Pam3CSK4已經(jīng)顯示出其通過提前干預(yù)的方式來激動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)對抗耐藥型金葡菌感染的潛力[3-4].黃連和黃連素在多種中藥的對比中也表現(xiàn)出比較顯著的對MRSA的殺菌和抑菌能力[9，13].本研究考察了Pam3CSK4和黃連素單獨(dú)和聯(lián)合使用時(shí)小鼠對抗MRSA感染的情況和效果.從提高小鼠生存率，增強(qiáng)小鼠對MRSA清除率，影響免疫球蛋白的分泌水平和T、B淋巴細(xì)胞的增殖幾個(gè)方面綜合來看，聯(lián)合給藥較兩種藥物單獨(dú)給藥對小鼠抵抗MRSA感染的保護(hù)作用確實(shí)產(chǎn)生了一定的放大效應(yīng).對于聯(lián)合給藥組而言，除對CD8+T細(xì)胞以外，在各方面對小鼠都具有的顯著性影響.單獨(dú)給藥Pam3CSK4效果遜于聯(lián)合給藥，但相較于單獨(dú)給藥黃連素對小鼠的保護(hù)作用更加明顯.對于單獨(dú)使用黃連素而言，盡管大部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算中并沒有明顯差異，但是各個(gè)部分的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相互呼應(yīng)，生存率的提升，載菌量的降低，T、B細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，表明黃連素的在抗MRSA感染中的使用依舊有意義.兩者結(jié)合使用則明顯增強(qiáng)了小鼠的抵抗MRSA的能力.因此聯(lián)合給藥，從抗菌與免疫調(diào)節(jié)兩方面同時(shí)出發(fā)來對抗MRSA感染是有意義的.在機(jī)體對抗細(xì)菌攻擊時(shí)，免疫系統(tǒng)被調(diào)動(dòng)起來發(fā)揮其作用，然而金葡菌自身擁有多種免疫逃避機(jī)制可以抵抗機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用，常常使得機(jī)體無法有效與之對抗[14].研究從體液免疫和細(xì)胞免疫兩方面分析了部分Pam3CSK4和黃連素對機(jī)體免疫的影響.有研究發(fā)現(xiàn)，在體外用Pam3CSK4處理B細(xì)胞，相較于細(xì)菌的脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)來說，更可以增加B細(xì)胞分泌的IgM和IgG2a、IgG2b的水平，但是幾乎不能促進(jìn)在IgG家族中含量最高的IgG1的分泌[15].對比本研究中Pam3CSK4對機(jī)體分泌特異性IgG和總IgM的影響，結(jié)果并無矛盾，在小鼠受到MRSA攻擊后，Pam3CSK4會(huì)降低小鼠對MRSA的特異性IgG分泌水平但是會(huì)增加總IgM的分泌.研究還發(fā)現(xiàn)Pam3CSK4的使用可以促進(jìn)對CD4+和CD8+T細(xì)胞以及B細(xì)胞的在體外的二次增殖，同時(shí)還驗(yàn)證了黃連素也具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，黃連素的使用使小鼠B細(xì)胞在體外的二次增殖有一定量的增加，CD4+T細(xì)胞在體外的二次增殖也有輕度的增長，兩者聯(lián)合使用時(shí)，對CD4+T細(xì)胞的促進(jìn)作用得到了進(jìn)一步加強(qiáng)，同時(shí)黃連素還可能在聯(lián)合給藥時(shí)對CD8+T細(xì)胞的增殖發(fā)揮了抑制作用.可以推測不論是聯(lián)合給藥還是兩種藥物單獨(dú)使用，均對小鼠具產(chǎn)生了一定的免疫調(diào)節(jié)作用影響，對小鼠的獲得性免疫也可能具有積極的意義.機(jī)體應(yīng)對金葡菌的感染時(shí)常常發(fā)生過度免疫反應(yīng)，其造成的二次打擊對自身傷害很大.因此在對抗金葡菌感染時(shí)，不僅要考慮對金葡菌的清除和免疫系統(tǒng)的激活，同樣也要考慮免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)避免二次打擊.CD8+T細(xì)胞作為毒性T細(xì)胞在機(jī)體發(fā)生二次打擊時(shí)處于高水平狀態(tài)，對機(jī)體產(chǎn)生負(fù)面的影響，聯(lián)合用藥時(shí)CD8+T細(xì)胞在增殖實(shí)驗(yàn)中水平的下降，對于降低機(jī)體在MRSA感染時(shí)的過度免疫反應(yīng)有也著積極意義.金黃色葡萄球菌的持續(xù)傳播與增長已逐漸成為一個(gè)全球性危機(jī)，耐藥性問題日趨嚴(yán)重，甚至發(fā)現(xiàn)了耐萬古霉素的金葡菌，尋找抗生素的替代應(yīng)對方法意義非凡.黃連素作為一種抗菌物質(zhì)，它可以抑制金葡菌的生物膜，進(jìn)而對抗耐藥性的產(chǎn)生，免疫激動(dòng)劑的使用也避免了細(xì)菌的耐藥性問題，對這兩種藥物聯(lián)合抗MRSA的研究，也是提出一種對抗金葡菌感染的新思路[9].

4 結(jié)論

綜上所述，為應(yīng)對金葡菌日趨嚴(yán)峻的耐藥性問題，采用免疫激動(dòng)劑Pam3CSK4和黃連素的聯(lián)用可能會(huì)是一種有潛力的對抗和預(yù)防金葡菌感染的方法.TLR2作為一種膜相關(guān)的模式識(shí)別受體，Pam3CSK4將其激活后通過抗原提呈細(xì)胞來調(diào)動(dòng)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)；黃連素殺菌抑菌，效果互為補(bǔ)充，一定程度上彌補(bǔ)在對抗金葡菌時(shí)藥效不足的尷尬，還可以對抗細(xì)菌的耐藥性，同時(shí)與Pam3CSK4各自發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用，降低機(jī)體的過度免疫反應(yīng)造成的傷害.這種免疫激動(dòng)劑與中藥成分相結(jié)合的使用，一方面可以作為預(yù)防性對抗MRSA感染風(fēng)險(xiǎn)的手段，一方面可能也有用于治療MRSA感染的潛力.