新型殼聚糖止血材料體外性能研究

孫久惠，王夢(mèng)軍，程鳳，王卓君，趙巖，劉穎，馬瑞珩，金紅旭

1.錦州醫(yī)科大學(xué)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧 沈陽(yáng) 110016 ；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈陽(yáng)110016 ；3.大連醫(yī)科大學(xué)研究生院，遼寧 大連 116027 ；4.中國(guó)科學(xué)院金屬研究所，遼寧 沈陽(yáng)110016

全世界每年約460 萬(wàn)人死于創(chuàng)傷事件，其中，近一半是因創(chuàng)傷后大出血導(dǎo)致［1］。在危重出血患者中，約50% 會(huì)因失血過(guò)多、多器官功能障礙或創(chuàng)傷性凝血功能障礙而死亡［2-3］。目前，創(chuàng)傷救治的方法集中在早期控制出血和治療創(chuàng)傷性凝血病方面，及時(shí)有效給予止血治療至關(guān)重要［2，4］。目前，有效的止血方式包括敷料或止血材料加壓止血、電凝止血、縫合止血、止血帶止血等。止血材料因其便攜性、突出的止血效果在急性創(chuàng)傷中被廣泛應(yīng)用。殼聚糖是一種具有高生物相容性、降解性、低致敏性和生物活性的高分子化合物，被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）宣布為“公認(rèn)為安全（generally recognized as safe，GRAS）”［5］。殼聚糖在創(chuàng)面止血、傷口愈合、藥物輸送、抗菌等方面有廣泛應(yīng)用。本研究旨在探討新型殼聚糖止血材料體外止血性能，為其更好的在創(chuàng)傷出血止血中應(yīng)用提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 健康SD 大鼠購(gòu)自北京唯尚立拓科技有限公司。新型殼聚糖止血材料由沈陽(yáng)金屬研究所提供；商品殼聚糖止血材料購(gòu)自北京健康廣濟(jì)有限公司；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；CCK-8購(gòu)自北京蘭杰柯技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 吸液實(shí)驗(yàn) 取質(zhì)量相同的新型殼聚糖止血材料和商品殼聚糖止血材料，并記錄質(zhì)量為M0。血液實(shí)驗(yàn)中將1 ml 抗凝全血垂直滴在兩種材料上方，在1、5、30 min 后稱材料質(zhì)量（M）。生理鹽水實(shí)驗(yàn)中將1 ml 生理鹽水垂直滴在兩種材料上方，其余實(shí)驗(yàn)步驟同上。每組進(jìn)行6 次平行實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算吸液率和吸液速率。

1.2.2 體外凝血實(shí)驗(yàn) 體外凝血實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［6］中研究方法。準(zhǔn)備相同體積的新型殼聚糖止血材料、商品殼聚糖止血材料置于離心管中，取1 ml 抗凝全血滴加在材料上，加入0.2 mol/L 氯化鈣溶液100 μl 啟動(dòng)凝血，5 min 后加入25 ml 去離子水，使用恒溫?fù)u床37℃搖5 min，取上清液，在450 nm 下測(cè)吸光度值。另將1 ml 抗凝全血和0.2 mol/L 氯化鈣溶液100 μl 混合啟動(dòng)凝血，5 min 后加入25 ml 去離子水，其余方法同上，將所測(cè)吸光度值假定為100 作為參考對(duì)照。每種材料進(jìn)行6 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算材料體外凝血指數(shù)。

1.2.3 生物相容性-溶血實(shí)驗(yàn) 將新型殼聚糖止血材料置于離心管中，并使用生理鹽水和去離子水反復(fù)吹打浸濕材料，移除液體，加入200 μl 抗凝全血和10 ml 生理鹽水；陽(yáng)性對(duì)照為離心管中加入200 μl 抗凝全血和10 ml 生理鹽水混合溶液；陰性對(duì)照為離心管中加入200 μl 抗凝血和10 ml去離子水混合溶液。將3 組離心管置于37℃水浴箱中1 h 后，以2 000 r/min 離心5 min，取上清液，測(cè)540 nm 處吸光度值（A），并計(jì)算材料溶血率。每組進(jìn)行6 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 生物相容性實(shí)驗(yàn)-細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將小鼠纖維細(xì)胞接種在孔板中，分別采用新型殼聚糖止血材料萃取液培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組）、正常DMEM 培養(yǎng)基（對(duì)照組）培養(yǎng)24、48、72 h 后每個(gè)孔中加入CCK-8，再培養(yǎng)1 h 后在450 nm 處測(cè)吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞增殖度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 吸液性 新型殼聚糖止血材料30 min 吸水率、吸血率明顯優(yōu)于商品殼聚糖止血材料，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。0～5 min，兩種材料吸血速率均明顯下降；5～30 min，與商品殼聚糖止血材料比較，新型殼聚糖止血材料吸血速率下降相對(duì)緩慢，并具有持續(xù)吸血性能。見(jiàn)圖1。

表1 不同止血材料30 min 吸液率比較（，%）

表1 不同止血材料30 min 吸液率比較（，%）

圖1 不同材料吸血速率

2.2 凝血性 商品殼聚糖止血材料、新型殼聚糖止血材料體外凝血指數(shù)分別為（96.62±5.17）、（89.80±2.79），體外凝血指數(shù)越小，凝血效果越好。其中，新型殼聚糖止血材料體外凝血指數(shù)顯著低于參考對(duì)照，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.3 生物相容性-血液相容性 新型殼聚糖止血材料溶血率為1.23%，符合國(guó)家要求（國(guó)家生物材料評(píng)價(jià)規(guī)定安全范圍為小于5.00%），說(shuō)明新型殼聚糖止血材料具有良好的血液相容性。

2.4 生物相容性-細(xì)胞毒性 通過(guò)公式計(jì)算得出，新型殼聚糖止血材料萃取液培養(yǎng)基24、48、72 h 細(xì)胞增殖率分別為93%、104%、105%。國(guó)家生物材料評(píng)價(jià)規(guī)定安全范圍大于75% 為合格［7］，說(shuō)明新型殼聚糖材料對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷，并具備一定的促進(jìn)細(xì)胞增殖能力。

3 討論

創(chuàng)傷、手術(shù)等情況引起的失控出血會(huì)導(dǎo)致休克、凝血功能障礙甚至死亡［8］。當(dāng)發(fā)生創(chuàng)傷性出血時(shí)，大量血液流出體外，機(jī)體通過(guò)機(jī)械性收縮血管減少血液流出，同時(shí)，激活血小板和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，形成血小板團(tuán)塊與纖維蛋白栓，一同堵塞出血傷口［9］。但對(duì)于大面積創(chuàng)傷出血，代償性止血機(jī)制無(wú)法完全止血，需要通過(guò)止血材料、止血帶等措施進(jìn)行控制。理想的止血材料應(yīng)該具備快速吸液性、止血性、生物相容性、無(wú)毒性、易于使用與攜帶便攜性等特征［10］。

殼聚糖作為一種多糖陽(yáng)離子聚合物，是除纖維素以外較常見(jiàn)的天然聚合物，主要源于蝦蟹甲殼類動(dòng)物外骨骼和真菌細(xì)胞壁中，甲殼素通過(guò)脫乙酰反應(yīng)后，其中的N-乙酰化重復(fù)單元被消除，成為β-1.4-D-葡聚糖，這個(gè)多聚體被稱為殼聚糖［11］。殼聚糖止血機(jī)制在于其陽(yáng)離子性質(zhì)，其表面氨基陽(yáng)離子可與紅細(xì)胞和血小板表面的陰離子結(jié)合，促進(jìn)紅細(xì)胞與血小板聚集，發(fā)揮止血作用［12-13］。除此之外，殼聚糖還具有粘附性、抗菌性、生物相容性等特點(diǎn)，其表面陽(yáng)離子可與細(xì)菌表面陰離子結(jié)合，使細(xì)菌細(xì)胞膜收縮，加速細(xì)菌死亡。但有研究顯示，殼聚糖本身吸液性和溶解性差［14］。

本研究主要從吸液性、凝血性、生物相容性等方面驗(yàn)證新型殼聚糖止血材料的體外性能，為后續(xù)研究做出準(zhǔn)備。吸液性方面，新型殼聚糖止血材料吸水率、吸血率明顯優(yōu)于商品殼聚糖止血材料，不同時(shí)間吸血速率與商品殼聚糖止血材料大致一致，并表現(xiàn)出持續(xù)的吸血性能。凝血性方面，新型殼聚糖止血材料較商品殼聚糖止血材料具有更強(qiáng)的凝血性能。生物相容性方面主要從溶血性和細(xì)胞毒性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，新型殼聚糖止血材料均達(dá)到國(guó)家止血材料要求標(biāo)準(zhǔn)，并表現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力。

綜上所述，新型殼聚糖止血材料具有良好的體外吸液性、凝血性、生物相容性，這種材料在出血?jiǎng)?chuàng)面中存在應(yīng)用潛能。