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    基因編碼技術應用研究進展

    2022-11-22 00:42:18司迎邢登祥付笛語
    關鍵詞:小鼠

    韓 雪,司迎,邢登祥,付笛語

    1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 醫(yī)學信息數(shù)據(jù)室,遼寧 沈陽 110003 ;2.武警遼寧省總隊醫(yī)院 醫(yī)學影像科,遼寧 沈陽110000 ;3.大連醫(yī)科大學,遼寧 大連 116044

    基因編碼是將基因插入、刪除和替換基因序列的基因工程技術,是研究基因功能、了解疾病遺傳機理、探索疾病基因治療的新技術革命,該項技術于2020 年獲得諾貝爾獎。基因編碼技術包括四種不同類型,分別是巨型核酸酶、鋅指核酸酶、轉錄激活樣效應因子核酸酶和成簇規(guī)律間隔短回文重復(clustered regularly interspaced short palinmic repeats,CRISPR)系統(tǒng)。由于CRISPR 技術操作簡單,便于開發(fā)利用,本文著重對該項技術在醫(yī)療領域的應用進展作一綜述。

    1 CRISPR 簡介

    1987 年,日本科學家Ishino 發(fā)現(xiàn)了一段聚集規(guī)律性間隔短回文結構,此后又發(fā)現(xiàn)除CRISPR 回文結構外的其他結構[1-2]。CRISPR 是一種古細菌獲得性的免疫系統(tǒng),作為細菌防御機制,防護噬菌體或質粒對細菌的入侵,防止外來基因插入宿主基因[3]。其基本原理是當細菌首次遭到入侵時,細菌將入侵生物的遺傳物質標記,形成規(guī)律性間隔序列的識別區(qū);再次遭到入侵時,入侵微生物的遺傳物質能夠被識別,并被降解[4]。即通過CRISPR 相關RNA 識別微生物的基因片段,并引導Cas 蛋白酶切割、水解入侵微生物的外源基因[5]。根據(jù)兩側的Case 基因和外源DNA 的位置,CRISPR 分為兩類。根據(jù)CAS 蛋白不同分為Cas3(I 型)、Cas9(Ⅱ型)和Csm/Cmr(Ⅲ型)。近幾年,利用這一重大發(fā)現(xiàn)開發(fā)了多種基于基因編碼技術的新的臨床治療手段和治療方法,開辟臨床疾病治療新途徑。

    2 CRISPR 應用原理

    CRISPR 通過非同源端聯(lián)接(non-homologous end joining,NHEJ)和同源性定向修復(homology-directed repair,HDR)兩種方式進行基因敲除和基因敲入,以糾正特定基因的錯誤編碼。NHEJ 是在不使用同源DNA 的情況下形成雙鏈DNA 的切口,在沒有內源DNA 模板時啟動DNA 刪除、插入和修復[6]。由于NHEJ 的修復特征,其被認為是一個容易出錯的修復方式,可能導致在序列中引入隨機插入和移位,導致基因敲除、插入或缺失的基因不完全截斷,并最終編碼蛋白錯誤,NHEJ 的基因編碼技術不限于特定的細胞周期相位。另一種基因編碼技術HDR 基因修復發(fā)生在S 或G 相位,且使用姊妹染色單體作為同源修復的模板[7]。HDR 是一種更精確的DNA 修復機制,其實際應用成為研究的焦點[8]。目前,基于上述兩項原理,已經(jīng)開發(fā)出多種基因編碼技術,用以研究靶向基因的敲入和敲除,進而研究基因功能,并利用這些技術治療多種疾病。

    3 基因編碼技術的實際應用

    隨著CRISPR 技術的日益完善及對疾病遺傳學認識的不斷深入,在利用基因編碼技術改正錯誤基因、治愈疾病方面取得了很大進展。

    3.1 血友病 血友病是X 染色體相關遺傳學疾病。利用腺病毒載體和CRISPR/Cas9 開發(fā)新的治療方法,恢復第九因子功能取得一定效果[9]。為恢復血友病患者第九因子基因的功能,腺病毒AAV8 載體系統(tǒng)攜帶Cas9 cDNA 和引導sgRNA 轉染血友病肝細胞,并移植到免疫缺陷小鼠體內建立動物模型,轉染的載體在第九因子基因附近的外顯子中創(chuàng)建雙鏈切口,并將cDNA 插入基因的內含子,通過基因編碼修正血友病細胞基因,恢復第九因子凝血功能[10]。由于腺病毒載體基因組免疫源行性,腺病毒載體導致不良免疫反應是該試驗的主要問題。因此,使用干細胞載體可能更適合血友病治療。有研究報道,將來自血友病患者外周血單核細胞的干細胞系通過CRISPR/Cas9 插入完整的第九因子基因,隨后將這些細胞注射到免疫缺陷小鼠體內,移植小鼠的干細胞可產生人類九因子分泌[11]。該結果意義重大,可作為未來臨床治療的基礎,基因編碼技術的研究為血友病治療帶來新希望。

    3.2 杜氏肌營養(yǎng)不良癥 杜氏肌營養(yǎng)不良癥是X 染色體相關基因突變引起的隱性肌肉萎縮疾病,基因突變導致抗肌萎縮蛋白水平降低[12]。男性攜帶一條X 染色體,患病率較高[13]。在杜氏肌營養(yǎng)不良癥基因突變中,大部分是外顯子中基因缺失[14]。使用造血干細胞或成肌細胞的離體擴增,嘗試修補或替代受損組織,未能取得有效的治療效果,是因這些細胞不能在肌肉組織內移植[15-16]。而如果利用CRISPR 將多能干細胞進行基因敲入后,則能生成具生抗肌萎縮蛋白的祖細胞,并在肌肉組織中大量再生。因此,基因敲入干細胞是治療杜氏肌營養(yǎng)不良癥的最佳治療方案之一[17]。近幾年,全球醫(yī)學領域開展了多種針對肌萎縮疾病的治療研究,包括尋找抗肌萎縮蛋白的替代蛋白以維持肌肉功能、嘗試恢復杜氏肌營養(yǎng)不良基因表達、干細胞療法[18],以及基因編碼治療等。這些治療手段中,基因編輯技術是較有效的治療技術。即從杜氏肌營養(yǎng)不良癥患者成纖維細胞中收集可誘導干細胞,經(jīng)CRISPR 轉染44 外顯子基因插入,恢復抗肌萎縮蛋白合成。使用CRISPR/Cas9技術敲除杜氏肌營養(yǎng)不良癥患者心肌和橫紋肌來源的多能干細胞45~55 外顯子后發(fā)現(xiàn),抗營養(yǎng)不良蛋白合成恢復,進而肌酸激酶活性恢復,這兩個基因的聯(lián)合敲除也可導致肌纖維不穩(wěn)定和降解[19]。在杜氏肌營養(yǎng)不良癥基因缺失的小鼠體內,利用CRISPR 技術比較NHEJ 和HDR 對杜氏肌營養(yǎng)不良癥基因的突變修復效果,基于NHEJ 修復的小鼠抗肌萎縮蛋白表達恢復更好,但易導致基因誘變形成[20]。

    3.3 神經(jīng)退行性疾病 阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病是由于基因突變導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙引起,臨床難以治愈[21]。研究表明,家族性阿爾茨海默病是由于編碼淀粉樣蛋白的前體蛋白基因點突變或缺失前體蛋白所致,為CRISPR/Cas9治療神經(jīng)退行性疾病提供廣闊的前景[22-23]。對家族性阿爾茨海默病中染色體1q31-42 進行分析,發(fā)現(xiàn)早衰蛋白2 中有一個點突變,與β 淀粉樣肽的比值顯著增加相關聯(lián),該突變導致阿爾海默氏患者認知能力下降、短期記憶喪失,主要是由于基底前腦膽堿能神經(jīng)元損傷導致神經(jīng)元細胞內質網(wǎng)的電壓門控鉀的變化通道表達改變,神經(jīng)元內質網(wǎng)中鈣濃度增加[24-25]。將健康的基底前腦膽堿能神經(jīng)元(basal forebrain cholinergic neurons,BFCN)移植到阿爾茨海默病小鼠模型中,學習能力顯著提高[26]。

    3.4 癌癥 ID8 是可種植轉移的鼠卵巢高惡行漿細胞癌,利用CRISPR/Cas9 敲除TP53 和BRCA2 基因,TP53 和BRCA 基因表達降低,但癌細胞ID8 依然具有惡行漿液性癌的特征[27-28]。將基因敲除的癌細胞種植小鼠腹腔后其腫瘤微環(huán)境免疫抑制細胞明顯增加,內皮淋巴細胞聚集,癌細胞喪失形成與雙鏈切口修復相關病灶的能力,對二磷酸腺苷-核糖聚合酶抑制敏感[29]。表觀基因組編輯是治療癌癥的另一種治療方法,其中,dCas9 與組蛋白修飾劑相連參與DNA 甲基化,干擾相關癌癥進展,如大多數(shù)癌癥存在DNA 過度甲基化[30]。為確定CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對惡性腫瘤甲基化的作用,利用人髓性白血病K562 細胞,在異檸檬酸脫氫酶雙鏈切口點突變,結果表明突變后K562 細胞體外形成克隆能力提高,這是由于組氨酸在突變細胞中的高度甲基化[31]。CRISPR 技術可用于腫瘤細胞的生長特性、抗藥性和瘤體轉移等研究,并開發(fā)雙細胞CRISPR(2CT-CRISPR)測試技術[32]。該測試由兩種類型組成,其中,免疫T 細胞為效應細胞、腫瘤細胞為靶細胞,該測定目的是識別因子介導免疫后瘤細胞的生長特點,并制定有效的治療方法、提高癌細胞的特異性免疫療法。

    3.5 艾滋病 人類免疫缺陷病毒-1 通過CD4 受體與CC趨化因子受體5(anti-CCR5/RANTES,CCR5)和CXC 趨化因子受體4 相互作用入侵宿主免疫細胞。雖然人類免疫缺陷病毒-1 聯(lián)合逆轉錄病毒的治療改善了患者生活質量,但未能從體內根除人類免疫缺陷病毒-1[33]。研究發(fā)現(xiàn),CCR5 中32 個bp的等位基因缺失導致CCR5 基因失活,從而抵抗人類免疫缺陷病毒-1 感染[34]。2000 年,1 例人類免疫缺陷病毒-1 陽性的急性髓系白血病患者接受攜帶CCR5 △32/△32 細胞的供體骨髓移植,結果人類免疫缺陷病毒體內復制終結,體內未檢測到人類免疫缺陷病毒-1[35]。用基因編碼技術將人CD34+造血干細胞/祖細胞敲出3 號染色體上的CCR5 位點,建立CCR5-/-克隆細胞株[36]。將這些細胞克隆移植免疫缺陷小鼠體內,觀察小鼠人類免疫缺陷病毒-1 感染情況發(fā)現(xiàn),其在免疫缺陷小鼠體內的復制被控制[37]。另一研究報道,具有未突變CCR5 等位基因(純合子)細胞中的病毒復制速率較具有突變的CCR5 等位基因(雜合子)的細胞更快,這表明具有同質性的細胞需要敲除兩個等位基因才能參與人類免疫缺陷病毒的感染抵抗[38]。

    3.6 鐮狀細胞貧血病 鐮狀細胞貧血病是一種隱性遺傳性疾病,帶有引導RNA 序列的CRISPR/Cas9,其會特異性作用于人腎細胞中的鐮刀形貧血病的血紅蛋白基因和CCR5 基因;且被發(fā)現(xiàn)其脫靶效應與前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif,PAM)相關聯(lián),即會進而減少或消除CRISPR/Cas9(120.40)靶基因的切割[39-40]。CRISPR/Cas9與靶位點識別的特異性與sgRNA 和前間區(qū)序列鄰近基序PAM 之間距離直接相關[41]。此外,為了糾正鐮狀細胞貧血病的突變,含有Cas9 蛋白的核糖核蛋白和sgRNA 組成sgRNA G10,靶向HBB 基因的第一個外顯子,用ssODN 被引入人類鐮狀細胞貧血病患者的血液樣本造血干/祖細胞,結果證明使用CRISP/CAS9 可有效進行基因校正,減少脫靶效應,且與以往研究相比,HDR 能夠最佳激活[41]。

    4 結語

    近年來,CRISPR 技術在研究基因功能、揭示遺傳疾病病因、開發(fā)新的治療手段方面取得可喜成績,其轉染效率高、脫靶效應少、易于操作等特點,日益得到廣泛應用。2020 年,利用CRISPR 技術進行心臟處理,改變移植心臟的免疫源性,心臟移植取得了巨大成功,為基因編碼技術的臨床應用開辟廣闊前景[42]。

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