基因編碼技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展

韓 雪，司迎，邢登祥，付笛語

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 醫(yī)學(xué)信息數(shù)據(jù)室，遼寧 沈陽 110003 ；2.武警遼寧省總隊(duì)醫(yī)院 醫(yī)學(xué)影像科，遼寧 沈陽110000 ；3.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連 116044

基因編碼是將基因插入、刪除和替換基因序列的基因工程技術(shù)，是研究基因功能、了解疾病遺傳機(jī)理、探索疾病基因治療的新技術(shù)革命，該項(xiàng)技術(shù)于2020 年獲得諾貝爾獎(jiǎng)?；蚓幋a技術(shù)包括四種不同類型，分別是巨型核酸酶、鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)（clustered regularly interspaced short palinmic repeats，CRISPR）系統(tǒng)。由于CRISPR 技術(shù)操作簡單，便于開發(fā)利用，本文著重對該項(xiàng)技術(shù)在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1 CRISPR 簡介

1987 年，日本科學(xué)家Ishino 發(fā)現(xiàn)了一段聚集規(guī)律性間隔短回文結(jié)構(gòu)，此后又發(fā)現(xiàn)除CRISPR 回文結(jié)構(gòu)外的其他結(jié)構(gòu)［1-2］。CRISPR 是一種古細(xì)菌獲得性的免疫系統(tǒng)，作為細(xì)菌防御機(jī)制，防護(hù)噬菌體或質(zhì)粒對細(xì)菌的入侵，防止外來基因插入宿主基因［3］。其基本原理是當(dāng)細(xì)菌首次遭到入侵時(shí)，細(xì)菌將入侵生物的遺傳物質(zhì)標(biāo)記，形成規(guī)律性間隔序列的識別區(qū)；再次遭到入侵時(shí)，入侵微生物的遺傳物質(zhì)能夠被識別，并被降解［4］。即通過CRISPR 相關(guān)RNA 識別微生物的基因片段，并引導(dǎo)Cas 蛋白酶切割、水解入侵微生物的外源基因［5］。根據(jù)兩側(cè)的Case 基因和外源DNA 的位置，CRISPR 分為兩類。根據(jù)CAS 蛋白不同分為Cas3（I 型）、Cas9（Ⅱ型）和Csm/Cmr（Ⅲ型）。近幾年，利用這一重大發(fā)現(xiàn)開發(fā)了多種基于基因編碼技術(shù)的新的臨床治療手段和治療方法，開辟臨床疾病治療新途徑。

2 CRISPR 應(yīng)用原理

CRISPR 通過非同源端聯(lián)接（non-homologous end joining，NHEJ）和同源性定向修復(fù)（homology-directed repair，HDR）兩種方式進(jìn)行基因敲除和基因敲入，以糾正特定基因的錯(cuò)誤編碼。NHEJ 是在不使用同源DNA 的情況下形成雙鏈DNA 的切口，在沒有內(nèi)源DNA 模板時(shí)啟動(dòng)DNA 刪除、插入和修復(fù)［6］。由于NHEJ 的修復(fù)特征，其被認(rèn)為是一個(gè)容易出錯(cuò)的修復(fù)方式，可能導(dǎo)致在序列中引入隨機(jī)插入和移位，導(dǎo)致基因敲除、插入或缺失的基因不完全截?cái)啵⒆罱K編碼蛋白錯(cuò)誤，NHEJ 的基因編碼技術(shù)不限于特定的細(xì)胞周期相位。另一種基因編碼技術(shù)HDR 基因修復(fù)發(fā)生在S 或G 相位，且使用姊妹染色單體作為同源修復(fù)的模板［7］。HDR 是一種更精確的DNA 修復(fù)機(jī)制，其實(shí)際應(yīng)用成為研究的焦點(diǎn)［8］。目前，基于上述兩項(xiàng)原理，已經(jīng)開發(fā)出多種基因編碼技術(shù)，用以研究靶向基因的敲入和敲除，進(jìn)而研究基因功能，并利用這些技術(shù)治療多種疾病。

3 基因編碼技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用

隨著CRISPR 技術(shù)的日益完善及對疾病遺傳學(xué)認(rèn)識的不斷深入，在利用基因編碼技術(shù)改正錯(cuò)誤基因、治愈疾病方面取得了很大進(jìn)展。

3.1 血友病 血友病是X 染色體相關(guān)遺傳學(xué)疾病。利用腺病毒載體和CRISPR/Cas9 開發(fā)新的治療方法，恢復(fù)第九因子功能取得一定效果［9］。為恢復(fù)血友病患者第九因子基因的功能，腺病毒AAV8 載體系統(tǒng)攜帶Cas9 cDNA 和引導(dǎo)sgRNA 轉(zhuǎn)染血友病肝細(xì)胞，并移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)建立動(dòng)物模型，轉(zhuǎn)染的載體在第九因子基因附近的外顯子中創(chuàng)建雙鏈切口，并將cDNA 插入基因的內(nèi)含子，通過基因編碼修正血友病細(xì)胞基因，恢復(fù)第九因子凝血功能［10］。由于腺病毒載體基因組免疫源行性，腺病毒載體導(dǎo)致不良免疫反應(yīng)是該試驗(yàn)的主要問題。因此，使用干細(xì)胞載體可能更適合血友病治療。有研究報(bào)道，將來自血友病患者外周血單核細(xì)胞的干細(xì)胞系通過CRISPR/Cas9 插入完整的第九因子基因，隨后將這些細(xì)胞注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，移植小鼠的干細(xì)胞可產(chǎn)生人類九因子分泌［11］。該結(jié)果意義重大，可作為未來臨床治療的基礎(chǔ)，基因編碼技術(shù)的研究為血友病治療帶來新希望。

3.2 杜氏肌營養(yǎng)不良癥 杜氏肌營養(yǎng)不良癥是X 染色體相關(guān)基因突變引起的隱性肌肉萎縮疾病，基因突變導(dǎo)致抗肌萎縮蛋白水平降低［12］。男性攜帶一條X 染色體，患病率較高［13］。在杜氏肌營養(yǎng)不良癥基因突變中，大部分是外顯子中基因缺失［14］。使用造血干細(xì)胞或成肌細(xì)胞的離體擴(kuò)增，嘗試修補(bǔ)或替代受損組織，未能取得有效的治療效果，是因這些細(xì)胞不能在肌肉組織內(nèi)移植［15-16］。而如果利用CRISPR 將多能干細(xì)胞進(jìn)行基因敲入后，則能生成具生抗肌萎縮蛋白的祖細(xì)胞，并在肌肉組織中大量再生。因此，基因敲入干細(xì)胞是治療杜氏肌營養(yǎng)不良癥的最佳治療方案之一［17］。近幾年，全球醫(yī)學(xué)領(lǐng)域開展了多種針對肌萎縮疾病的治療研究，包括尋找抗肌萎縮蛋白的替代蛋白以維持肌肉功能、嘗試恢復(fù)杜氏肌營養(yǎng)不良基因表達(dá)、干細(xì)胞療法［18］，以及基因編碼治療等。這些治療手段中，基因編輯技術(shù)是較有效的治療技術(shù)。即從杜氏肌營養(yǎng)不良癥患者成纖維細(xì)胞中收集可誘導(dǎo)干細(xì)胞，經(jīng)CRISPR 轉(zhuǎn)染44 外顯子基因插入，恢復(fù)抗肌萎縮蛋白合成。使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除杜氏肌營養(yǎng)不良癥患者心肌和橫紋肌來源的多能干細(xì)胞45～55 外顯子后發(fā)現(xiàn)，抗?fàn)I養(yǎng)不良蛋白合成恢復(fù)，進(jìn)而肌酸激酶活性恢復(fù)，這兩個(gè)基因的聯(lián)合敲除也可導(dǎo)致肌纖維不穩(wěn)定和降解［19］。在杜氏肌營養(yǎng)不良癥基因缺失的小鼠體內(nèi)，利用CRISPR 技術(shù)比較NHEJ 和HDR 對杜氏肌營養(yǎng)不良癥基因的突變修復(fù)效果，基于NHEJ 修復(fù)的小鼠抗肌萎縮蛋白表達(dá)恢復(fù)更好，但易導(dǎo)致基因誘變形成［20］。

3.3 神經(jīng)退行性疾病 阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病是由于基因突變導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙引起，臨床難以治愈［21］。研究表明，家族性阿爾茨海默病是由于編碼淀粉樣蛋白的前體蛋白基因點(diǎn)突變或缺失前體蛋白所致，為CRISPR/Cas9治療神經(jīng)退行性疾病提供廣闊的前景［22-23］。對家族性阿爾茨海默病中染色體1q31-42 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)早衰蛋白2 中有一個(gè)點(diǎn)突變，與β 淀粉樣肽的比值顯著增加相關(guān)聯(lián)，該突變導(dǎo)致阿爾海默氏患者認(rèn)知能力下降、短期記憶喪失，主要是由于基底前腦膽堿能神經(jīng)元損傷導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的電壓門控鉀的變化通道表達(dá)改變，神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣濃度增加［24-25］。將健康的基底前腦膽堿能神經(jīng)元（basal forebrain cholinergic neurons，BFCN）移植到阿爾茨海默病小鼠模型中，學(xué)習(xí)能力顯著提高［26］。

3.4 癌癥 ID8 是可種植轉(zhuǎn)移的鼠卵巢高惡行漿細(xì)胞癌，利用CRISPR/Cas9 敲除TP53 和BRCA2 基因，TP53 和BRCA 基因表達(dá)降低，但癌細(xì)胞ID8 依然具有惡行漿液性癌的特征［27-28］。將基因敲除的癌細(xì)胞種植小鼠腹腔后其腫瘤微環(huán)境免疫抑制細(xì)胞明顯增加，內(nèi)皮淋巴細(xì)胞聚集，癌細(xì)胞喪失形成與雙鏈切口修復(fù)相關(guān)病灶的能力，對二磷酸腺苷-核糖聚合酶抑制敏感［29］。表觀基因組編輯是治療癌癥的另一種治療方法，其中，dCas9 與組蛋白修飾劑相連參與DNA 甲基化，干擾相關(guān)癌癥進(jìn)展，如大多數(shù)癌癥存在DNA 過度甲基化［30］。為確定CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對惡性腫瘤甲基化的作用，利用人髓性白血病K562 細(xì)胞，在異檸檬酸脫氫酶雙鏈切口點(diǎn)突變，結(jié)果表明突變后K562 細(xì)胞體外形成克隆能力提高，這是由于組氨酸在突變細(xì)胞中的高度甲基化［31］。CRISPR 技術(shù)可用于腫瘤細(xì)胞的生長特性、抗藥性和瘤體轉(zhuǎn)移等研究，并開發(fā)雙細(xì)胞CRISPR（2CT-CRISPR）測試技術(shù)［32］。該測試由兩種類型組成，其中，免疫T 細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞為靶細(xì)胞，該測定目的是識別因子介導(dǎo)免疫后瘤細(xì)胞的生長特點(diǎn)，并制定有效的治療方法、提高癌細(xì)胞的特異性免疫療法。

3.5 艾滋病 人類免疫缺陷病毒-1 通過CD4 受體與CC趨化因子受體5（anti-CCR5/RANTES，CCR5）和CXC 趨化因子受體4 相互作用入侵宿主免疫細(xì)胞。雖然人類免疫缺陷病毒-1 聯(lián)合逆轉(zhuǎn)錄病毒的治療改善了患者生活質(zhì)量，但未能從體內(nèi)根除人類免疫缺陷病毒-1［33］。研究發(fā)現(xiàn)，CCR5 中32 個(gè)bp的等位基因缺失導(dǎo)致CCR5 基因失活，從而抵抗人類免疫缺陷病毒-1 感染［34］。2000 年，1 例人類免疫缺陷病毒-1 陽性的急性髓系白血病患者接受攜帶CCR5 △32/△32 細(xì)胞的供體骨髓移植，結(jié)果人類免疫缺陷病毒體內(nèi)復(fù)制終結(jié)，體內(nèi)未檢測到人類免疫缺陷病毒-1［35］。用基因編碼技術(shù)將人CD34+造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞敲出3 號染色體上的CCR5 位點(diǎn)，建立CCR5-/-克隆細(xì)胞株［36］。將這些細(xì)胞克隆移植免疫缺陷小鼠體內(nèi)，觀察小鼠人類免疫缺陷病毒-1 感染情況發(fā)現(xiàn)，其在免疫缺陷小鼠體內(nèi)的復(fù)制被控制［37］。另一研究報(bào)道，具有未突變CCR5 等位基因（純合子）細(xì)胞中的病毒復(fù)制速率較具有突變的CCR5 等位基因（雜合子）的細(xì)胞更快，這表明具有同質(zhì)性的細(xì)胞需要敲除兩個(gè)等位基因才能參與人類免疫缺陷病毒的感染抵抗［38］。

3.6 鐮狀細(xì)胞貧血病 鐮狀細(xì)胞貧血病是一種隱性遺傳性疾病，帶有引導(dǎo)RNA 序列的CRISPR/Cas9，其會特異性作用于人腎細(xì)胞中的鐮刀形貧血病的血紅蛋白基因和CCR5 基因；且被發(fā)現(xiàn)其脫靶效應(yīng)與前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）相關(guān)聯(lián)，即會進(jìn)而減少或消除CRISPR/Cas9（120.40）靶基因的切割［39-40］。CRISPR/Cas9與靶位點(diǎn)識別的特異性與sgRNA 和前間區(qū)序列鄰近基序PAM 之間距離直接相關(guān)［41］。此外，為了糾正鐮狀細(xì)胞貧血病的突變，含有Cas9 蛋白的核糖核蛋白和sgRNA 組成sgRNA G10，靶向HBB 基因的第一個(gè)外顯子，用ssODN 被引入人類鐮狀細(xì)胞貧血病患者的血液樣本造血干/祖細(xì)胞，結(jié)果證明使用CRISP/CAS9 可有效進(jìn)行基因校正，減少脫靶效應(yīng)，且與以往研究相比，HDR 能夠最佳激活［41］。

4 結(jié)語

近年來，CRISPR 技術(shù)在研究基因功能、揭示遺傳疾病病因、開發(fā)新的治療手段方面取得可喜成績，其轉(zhuǎn)染效率高、脫靶效應(yīng)少、易于操作等特點(diǎn)，日益得到廣泛應(yīng)用。2020 年，利用CRISPR 技術(shù)進(jìn)行心臟處理，改變移植心臟的免疫源性，心臟移植取得了巨大成功，為基因編碼技術(shù)的臨床應(yīng)用開辟廣闊前景［42］。