siRNA下調(diào)SCN9A表達對慢性炎性痛模型大鼠疼痛的影響

姜曉陽，張 園，劉亞華，侯彥深 (.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)中心，新疆 烏魯木齊 8300；.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，新疆 烏魯木齊 8300)

慢性炎性痛廣泛存在于各種急、慢性疾病中，是一種極其復(fù)雜的病理生理現(xiàn)象，嚴重影響患者生活質(zhì)量。目前臨床上以藥物、神經(jīng)破壞、神經(jīng)阻滯等治療為主，但存在藥物耐受、副反應(yīng)較多、需反復(fù)治療等局限性，嚴重影響治療效果及患者滿意度[1-2]，因此需尋找更安全有效、作用持久、副作用小的治療方法。電壓門控性鈉通道Nav1.7特異性表達于脊髓背根神經(jīng)節(jié)，具有緩慢失活和緩慢復(fù)活的特點，能對較小的閾下刺激去極化，產(chǎn)生神經(jīng)沖動[3-4]，臨床認為這種效應(yīng)很可能使Nav1.7成為神經(jīng)元興奮的第1張“多米諾骨牌”，從而傳遞疼痛信號。隨著對疼痛機制的深入研究，已有研究發(fā)現(xiàn)，編碼Nav1.7的基因SCN9A功能缺失性突變是導(dǎo)致痛覺完全消失的關(guān)鍵因子[5]。以往有關(guān)疼痛的基因治療多針對急性疼痛及神經(jīng)壓迫疼痛進行研究，尚缺乏對慢性炎性痛的特異性研究?；诖?，本研究以SCN9A為靶點，以慢病毒為載體，利用RNA干擾技術(shù)，探討SCN9A對慢性炎性痛模型大鼠疼痛的影響，以期為疼痛基因靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

18只雄性SPF級SD大鼠(9周齡，體質(zhì)量180～200 g)，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心實驗室提供，動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(新)2018-0003，每籠4只，于溫度(22±2)℃、濕度40%～60%、晝夜交替12 h環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 主要儀器與試劑

儀器：熱刺痛儀(PL-200)購自成都泰盟軟件有限公司，機械痛測量儀(Electric Von Frey)購自上海玉研科學(xué)儀器有限公司，微量注射器(25 μL)購自上海安亭微量進樣器廠，GYQ型便攜式氧氣筒購自冀州市佳光醫(yī)療器械有限公司，-80 ℃冰箱購自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司，全波長酶標(biāo)儀(1510)購自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司，RT-PCR檢測儀(7500FAST)購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

試劑：SCN9A siRNA慢病毒載體(LV-SCN9A-RNAi)購自上海吉凱基因技術(shù)有限公司，七氟烷購自上海恒瑞醫(yī)藥有限公司，完全弗氏佐劑購自廣州賽國生物科技有限責(zé)任公司，TRIzol購自美國Thermo Scientific，SYBRGreen PCR試劑盒、cDNA試劑盒購自美國Biosystems，增強型RIPA裂解液購自天津博士德生物工程有限公司，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 分組與建模

將18只大鼠隨機分成3組，每組6只。其中空白組大鼠不作任何處理，模型組、干預(yù)組大鼠于右后足皮下給予0.1 mL完全弗氏佐劑建立慢性炎性痛模型，模型組建模后于蛛網(wǎng)膜下腔注射空白慢病毒載體，干預(yù)組建模后于蛛網(wǎng)膜下腔注射LV-SCN9A-RNAi。

慢性炎性痛模型的建立：8%七氟烷誘導(dǎo)約1 min，麻醉起效后改用4%七氟烷維持麻醉。大鼠平放于桌面上，拉直后腿，75%酒精消毒右后掌，于大鼠足底注射0.1 mL完全弗氏佐劑，拔出注射器后用無菌棉球按壓注射位點。大鼠右后足腫脹，不能觸及地面，表明慢性炎性痛模型建立成功。

大鼠鞘內(nèi)置管：模型組和干預(yù)組大鼠腹腔注射水合氯醛，麻醉起效后取俯臥位，背部剪毛、消毒、鋪巾。在L3～L4作一皮膚正中切口，切開皮下筋膜，緊貼L3～L4棘突鈍性分離一側(cè)背脊肌、筋膜和韌帶，暴露L3～L4棘突間隙。用蚊式鉗輕提L3椎體棘突，以彎針輕輕挑破黃韌帶及硬脊膜。經(jīng)黃韌帶破口置入PE-10導(dǎo)管。將導(dǎo)管牢固縫于韌帶上，逐層縫合肌肉、筋膜。以硬膜外穿刺針在大鼠皮下穿一隧道，將導(dǎo)管的另一端引出于大鼠頸背部，用加熱過的止血鉗夾閉導(dǎo)管外口?？p合皮膚并消毒，單籠喂養(yǎng)。大鼠出現(xiàn)以下情況則排除：下肢出現(xiàn)跛行、癱瘓、行為異常等肢體運動障礙，局部感染，導(dǎo)管脫落等。

1.4 疼痛行為學(xué)測定

于建模前及建模后1 d、2 d、5 d、8 d、12 d測定大鼠右后肢機械刺激縮足反射閾值(paw mechanical withdrawal threshold，PMWT)和熱刺激縮足反射潛伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)。PMWT：用Electric Von Frey纖維絲對準(zhǔn)大鼠足底中部垂直施加壓力，記錄大鼠不能耐受壓力迅速撤回后足時的壓力值(g)，重復(fù)測量3次取均值。PWTL：大鼠置于熱刺痛儀，光源強度為5%，適應(yīng)環(huán)境后將輻射光源集中在右后足中心，按下啟動鍵，自動記錄大鼠舔或者抬起右后足時的潛伏期(s)，重復(fù)測量3次取均值。

1.5 RT-PCR檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織SCN9A mRNA表達

于建模后第13天處死大鼠，取L4～L5背根神經(jīng)節(jié)組織，采用TRIzol提取總RNA，Nanodrop儀檢測RNA濃度、純度。采用RT-PCR檢測SCN9A mRNA表達情況。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書反轉(zhuǎn)錄RNA，得到模板單鏈cDNA，調(diào)整濃度為400 ng/μL，按照PCR試劑盒說明書進行PCR擴增，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性1 min，92 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，連續(xù)循環(huán)40次。2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠處理PCR產(chǎn)物后檢測擴增結(jié)果。以β-actin作為內(nèi)參，根據(jù)目的RNA與β-actin的Ct值計算相對表達量，以2-ΔΔCt表示，其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ctβ-actin)-(Ct對照目的基因-Ct對照β-actin)。

1.6 Western blot檢測脊髓GFAP、OX42和背根神經(jīng)節(jié)組織SCN9A蛋白表達

采用Western blot檢測L4～L5脊髓GFAP、OX42和L4～L5背根神經(jīng)節(jié)組織SCN9A蛋白表達水平。用眼科剪將組織剪成0.1～0.2 g，置于EP管中，加入1 mL RIPA裂解液(80 μL RIPA+10 μL蛋白酶抑制劑+100 μL磷酸酶抑制劑+10 μL PMSF)置于冰上，充分勻漿后4 ℃裂解30 min，4 ℃ 15 000 r/min離心10～15 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。將待測蛋白樣本進行10%SDS-PAGE凝膠電泳，80 V進行濃縮膠電泳，進入分離膠電泳后將電壓調(diào)整為100 V，待條帶全部跑開至分離層膠下緣后停止電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5% BSA封閉2 h，分別加入GFAP(1∶1 000)、OX42(1∶2 000)、SCN9A(1∶500)一抗，4 ℃孵育過夜后，加入二抗[Nav1.7的二抗為辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶5 000)；β-actin的二抗為辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)；GFAP的二抗為辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶5 000)]，溫孵1 h。底物化學(xué)發(fā)光法顯影，置于全能型成像分析儀(Bio-Rad)檢測蛋白條帶，以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件分析圖像灰度值，檢測目的蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 LV-SCN9A-RNAi對慢性炎性痛大鼠PMWT的影響

各組大鼠建模前PMWT比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，模型組、干預(yù)組建模后1 d、2 d、5 d、8 d、12 d的PMWT均明顯低于空白組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，干預(yù)組建模后2 d、5 d、8 d、12 d的PMWT明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 慢性炎性痛大鼠建模前后PMWT變化

2.2 LV-SCN9A-RNAi對慢性炎性痛大鼠PWTL的影響

各組大鼠建模前PWTL比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，模型組、干預(yù)組建模后1 d、2 d、5 d、8 d、12 d的PWTL均明顯短于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，干預(yù)組建模后2 d、5 d、8 d、12 d的PWTL明顯長于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 慢性炎性痛大鼠建模前后PWTL變化

2.3 LV-SCN9A-RNAi對大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織SCN9A mRNA表達的影響

干預(yù)組SCN9A mRNA相對表達量為(4.57±1.02)，高于空白組的(1.02±0.15)，低于模型組的(13.46±3.51)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 LV-SCN9A-RNAi對大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織SCN9A及脊髓GFAP、OX42蛋白表達的影響

干預(yù)組SCN9A、GFAP、OX42蛋白表達水平高于空白組，低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3、圖1。

a：SCN9A蛋白表達電泳圖；b:GFAP蛋白表達電泳圖；c：OX42蛋白表達電泳圖圖1 蛋白表達電泳圖

3 討論

背根神經(jīng)節(jié)是痛覺傳入第一級神經(jīng)元，在痛覺的產(chǎn)生機制中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)系統(tǒng)受損后，初級感覺神經(jīng)元的自發(fā)性活動、高興奮性以及異常高頻放電參與疼痛的發(fā)生，該過程由感覺神經(jīng)元的電壓門控性鈉通道介導(dǎo)或者調(diào)控[6-7]。SCN9A為電壓門控性鈉通道，該基因主要表達于背根神經(jīng)節(jié)，且集中于與傷害性感受器有關(guān)的小直徑c類神經(jīng)纖維[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性紅斑肢痛癥、陣發(fā)性劇痛癥等患者中，SCN9A基因序列出現(xiàn)功能增強型突變[9-10]，而單文琪等[10]認為人類先天無痛癥電壓門控性鈉通道Nav1.7的SCN9A基因功能缺失性突變是痛覺完全消失的關(guān)鍵原因?；谝陨涎芯客茢?，敲除或下調(diào)SCN9A基因表達可抑制疼痛產(chǎn)生，獲得良好的鎮(zhèn)痛效果。因此，本研究采用慢病毒介導(dǎo)的RNA抑制大鼠SCN9A基因表達，探討疼痛基因治療的安全性和可行性，為疼痛基因治療提供一定的依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，于大鼠右后足皮下給予0.1 mL完全弗氏佐劑建立慢性炎性痛模型后，大鼠足底出現(xiàn)紅腫熱痛、自我保護和縮足行為，右后足不能觸及地面，且干預(yù)組和模型組的PMWT、PWTL明顯低/短于空白組；進一步分析發(fā)現(xiàn)，干預(yù)組建模后2 d、5 d、8 d、12 d的PMWT、PWTL明顯高/長于模型組，表明蛛網(wǎng)膜下腔注射LV-SCN9A-RNAi可有效減輕慢性炎性痛模型大鼠疼痛程度，改善疼痛行為學(xué)表現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)，Nav1.7與機械痛和炎性痛密切相關(guān)[11-12]。在炎性痛覺過敏的發(fā)展過程中，傷害性神經(jīng)元中Nav1.7的表達增加，而抑制Nav1.7可以減輕炎性痛和痛覺過敏[13]，本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果一致。本研究中干預(yù)組SCN9A mRNA及蛋白表達水平高于空白組，低于模型組，說明下調(diào)SCN9A的表達可緩解大鼠疼痛癥狀。

脊髓星形膠質(zhì)細胞激活標(biāo)記物GFAP及小膠質(zhì)細胞激活標(biāo)記物OX42表達水平與炎性痛有關(guān)，出現(xiàn)炎性痛時，脊髓星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞被激活，誘導(dǎo)GFAP、OX42蛋白表達，促進膠質(zhì)細胞釋放神經(jīng)遞質(zhì)，進而刺激神經(jīng)元，導(dǎo)致疼痛信號放大；相反，抑制膠質(zhì)細胞的激活可緩解疼痛[14-15]。脊髓膠質(zhì)細胞激活后可釋放興奮性氨基酸、P物質(zhì)、IL-1β、TNF-α、誘導(dǎo)型—氧化氮合酶等多種前疼痛物質(zhì)，同時神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞之間具有正反饋調(diào)節(jié)作用，從而導(dǎo)致疼痛反應(yīng)加重[16-17]。本研究中，干預(yù)組的GFAP、OX42蛋白表達水平高于空白組，低于模型組，表明下調(diào)SCN9A表達可抑制脊髓小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞的激活，進而抑制慢性炎性痛的中樞敏化過程。

綜上所述，蛛網(wǎng)膜下腔注射LV-SCN9A-RNAi可抑制大鼠背根神經(jīng)節(jié)的SCN9A表達，從而有效減輕慢性炎性痛模型大鼠的疼痛程度，改善疼痛行為學(xué)。