miR-222-3p在乙型肝炎病毒相關(guān)肝細(xì)胞癌血清外泌體中的表達(dá)及臨床意義

朱富平，劉紅強(qiáng)，常 清，冷偉業(yè) (重慶市第九人民醫(yī)院普外一科，重慶 400700)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是嚴(yán)重威脅人類健康的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1]。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是HCC發(fā)生最主要的流行病學(xué)因素，80%以上的HCC患者存在HBV感染史[2]。因此，臨床亟需尋找評(píng)估HBV-HCC發(fā)生發(fā)展和預(yù)后的可靠預(yù)測(cè)因子和潛在治療靶點(diǎn)。外泌體是一類小的、包含大量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等的細(xì)胞外囊泡，是細(xì)胞間重要的信號(hào)通訊工具[3-4]。有研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞分泌的miR-222-3p可在循環(huán)外泌體中富集，促進(jìn)上皮性卵巢癌[5]、非小細(xì)胞肺癌[6]等腫瘤的惡性發(fā)展。Li等[7]研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染衍生的外泌體可通過(guò)抑制Akt/mTOR通路促進(jìn)病毒復(fù)制，這與miR-222-3p的高表達(dá)有關(guān)。Sun等[8]也證實(shí)HBV感染進(jìn)一步促進(jìn)了miR-222-3p的表達(dá)，并通過(guò)miR-222-3p介導(dǎo)的THBS1下調(diào)促進(jìn)HCC的進(jìn)展。因此，我們推測(cè)血清外泌體miR-222-3p有望成為HBV-HCC診斷中的非侵入性生物標(biāo)志物，然而目前尚缺乏相關(guān)的臨床證據(jù)。基于此，本研究通過(guò)分析HBV-HCC患者血清外泌體miR-222-3p表達(dá)水平及與患者臨床特征和預(yù)后的相關(guān)性，以期為尋找可靠的生物標(biāo)志物和改進(jìn)臨床治療策略提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2012年1月至2017年11月我院普外科收治的604例HCC患者的臨床病理資料，包括391例HBV-HCC患者(男242例，女149例，年齡38～89歲)和213例非HBV-HCC患者(男135例，女78例，年齡40～88歲)。納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)病理檢查證實(shí)為HCC，符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》[9]診斷標(biāo)準(zhǔn)；首次確診，既往未行任何相關(guān)抗癌治療；HBV-HCC患者HBV表面抗原(HBV surface antigen，HBsAg)檢測(cè)呈陽(yáng)性，非HBV-HCC患者無(wú)慢性HBV感染史；具有完整臨床、實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)相關(guān)資料。另選取288例慢性乙肝患者作為HBV組，患者有HBV感染史，HBsAg檢測(cè)呈陽(yáng)性。排除標(biāo)準(zhǔn):丙型肝炎病毒或其他病毒性肝炎感染史；合并其他惡性腫瘤；有肝切除術(shù)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)、腫瘤消融或抗病毒治療史；心、肺、腎等器官嚴(yán)重功能障礙；自身免疫性疾?。缓喜⑵渌腥拘约膊。淮x、精神疾?。蝗焉锘虿溉槠谟g患者；非原發(fā)病灶。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2012003)，所有患者及家屬均對(duì)本研究知情，并簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 觀察指標(biāo)

收集所有患者的一般資料，包括年齡、性別、Child-Pugh分級(jí)、巴塞羅那臨床肝癌(Barcelona clinic liver cancer，BCLC)分期、治療方法等，以及生化資料。采集所有患者清晨空腹靜脈血5 mL置于抗凝管中，于4 ℃下4 000 r/min離心15 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)患者α-甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、異常凝血酶原(des-gamma-carboxy prothrombin，DCP)水平，試劑盒均購(gòu)自上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司。采用日立7600-20全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)患者血小板計(jì)數(shù)(platelet count，PLT)、總膽紅素(total bilirubin，TBil)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotranseferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、白蛋白(albumin，ALB)水平。采用SysmexCA-1500全自動(dòng)血凝儀檢測(cè)凝血酶原活動(dòng)度(prothrombin activity，PTA)。所有檢測(cè)均由對(duì)研究終點(diǎn)不知情的技術(shù)人員進(jìn)行。

1.3 血清外泌體miR-222-3p檢測(cè)

取0.5 mL血清樣本于4 ℃下3 000 r/min離心10 min，使血細(xì)胞下降，然后12 000 r/min離心10 min，去除殘留的細(xì)胞碎片。用全血清外泌體分離試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)從血清中分離純化血清外泌體，并將外泌體顆粒重懸于磷酸鹽緩沖液中，-80 ℃保存。取血清外泌體置于formvar涂層的銅—鈀網(wǎng)格上，固定后用3%磷鎢酸染色，通過(guò)100XCII透射電鏡(日本JEOL公司)觀察外泌體的大小和形態(tài)特征，并用NanoSight納米粒徑追蹤分析儀確定外泌體顆粒粒徑分布和相對(duì)濃度。采用Western blot法檢測(cè)血清外泌體樣本中CD63、TSG101、Alix表達(dá)，抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。用ExoQuick?外泌體提取和TRIzol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)提取外泌體總RNA，通過(guò)PrimeScript RT試劑盒(日本Takara公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄后使用SYBR Green Real Time PCR試劑盒(日本Takara公司)在Applied Biosystems 7300型PCR系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng):95 ℃ 2 min，40個(gè)擴(kuò)增周期(95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 30 s)，每個(gè)周期后測(cè)量熒光曲線，平行進(jìn)行3次。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-222-3p的相對(duì)表達(dá)量。引物序列:miRNA-222-3p的正向引物序列為5’-CTCAGTAGCCAGTGTAG-3’、反向引物序列為5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’；U6的正向引物序列為5’-ACAGATCTGTCGGTGTGGTGGCAC-3’、反向引物序列為5’-GGCCCCGGATTATCCGACATTC-3’。

1.4 隨訪

隨訪時(shí)間為第1年每3個(gè)月1次，第2年每4個(gè)月1次，第3年每6個(gè)月1次，之后每1年1次，隨訪的截止時(shí)間是2022年1月或者患者死亡時(shí)，記錄患者死亡情況。定期檢測(cè)患者腫瘤和HBV的血清標(biāo)志物，并根據(jù)需要進(jìn)行腹部造影、超聲、肝動(dòng)脈造影或侵襲性檢查?？偵嫫诙x為手術(shù)日期至隨訪截止時(shí)間或患者死亡時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 26.0軟件處理數(shù)據(jù)，二分類變量以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)；連續(xù)變量先進(jìn)行K-S正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性分析，文中所有連續(xù)變量均不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)和四分位數(shù)表示，采用Mann-WhitneyU或Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征(receiveroperatingcharacteristic，ROC)曲線，并計(jì)算曲線下面積(areaunderthecurve，AUC)以評(píng)估血清外泌體miR-222-3p對(duì)HBV-HCC的診斷價(jià)值。采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗(yàn)分析miR-222-3p表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響HBV-HCC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料比較

3組患者年齡、性別、ALB比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而非HBV-HCC組和HBV-HCC組患者血清AST、ALT、TBil、AFP、DCP水平均高于HBV組，同時(shí)血清PTA、PLT顯著低于HBV組(P<0.05)；HBV-HCC組和非HBV-HCC組患者Child-Pugh分級(jí)、BCLC分期、治療方法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 患者一般資料比較

2.2 血清外泌體獲取及鑒定

用超速離心法從患者的血清中提取并純化得到雙層膜結(jié)構(gòu)的球形或橢球型的外泌體，用透射電鏡觀察，顆粒分布均勻，粒徑大小為40～100 nm。納米粒徑追蹤技術(shù)顯示，外泌體粒徑主要為0～300 nm。經(jīng)Western blot法檢測(cè)，這些顆粒高表達(dá)CD63、TSG101、Alix，見(jiàn)圖1。

a:納米粒徑追蹤分析法分析血清外泌體的大小分布；b:血清外泌體的透射電鏡圖；c:Western blot法檢測(cè)血清外泌體特征蛋白CD63、TSG101和Alix表達(dá)圖1 血清外泌體特征鑒定

2.3 血清外泌體miR-222-3p水平比較

HBV組、非HBV-HCC組和HBV-HCC組患者血清外泌體miR-222-3p水平分別為1.0(0.8,1.2)、1.4(1.0,1.7)、1.6(1.3,2.1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=217.064，P<0.001)。HBV-HCC組患者血清外泌體miR-222-3p水平顯著高于非HBV-HCC組和HBV組(P<0.001)。經(jīng)ROC曲線分析，血清外泌體miR-222-3p用于HBV-HCC診斷(HBV-HCC組vs.HBV組、HBV-HCC組vs.非HBV-HCC組)的AUC分別為 0.817(95%CI:0.786～0.847)、0.672(95%CI:0.632～0.712),見(jiàn)圖2。根據(jù)ROC曲線得到最佳截?cái)嘀担?dāng)血清外泌體miR-222-3p≥1.4時(shí)，用于區(qū)分HBV-HCC和HBV的準(zhǔn)確性為88.7%，陽(yáng)性似然比為8；當(dāng)血清外泌體miR-222-3p≥1.7時(shí)，用于區(qū)分HBV-HCC和非HBV-HCC的準(zhǔn)確性為79.0%，陽(yáng)性似然比為3.5。

a:HBV-HCC組 vs.HBV組；b:HBV-HCC組 vs.非HBV-HCC組圖2 血清外泌體miR-222-3p診斷HBV-HCC的ROC曲線

2.4 miR-222-3p表達(dá)與HBV-HCC患者不同臨床特征的關(guān)系

根據(jù)血清外泌體miR-222-3p中位值1.6將HBV-HCC患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，血清外泌體miR-222-3p的表達(dá)與患者HBV-DNA拷貝、AST、DCP、BCLC分期有關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、性別、HBsAg、ALT、TBil、ALB、PTA、PLT、AFP、治療方法、Child-Pugh分級(jí)無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 血清外泌體miR-222-3p表達(dá)與HBV-HCC患者不同臨床特征的關(guān)系[例(%)]

2.5 miR-222-3p水平與HCC患者預(yù)后的關(guān)系

對(duì)于HBV-HCC患者，血清外泌體miR-222-3p高表達(dá)組和低表達(dá)組中位生存時(shí)間分別為2.66年、4.14年，總生存率分別為32.8%(64/195)、35.7%(70/196)，經(jīng)Log-rankχ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.078，P<0.001)，見(jiàn)圖3a。對(duì)于非HBV-HCC患者，血清外泌體miR-222-3p高表達(dá)組和低表達(dá)組中位生存時(shí)間分別為4.05年、3.37年，總生存率分別為34.8%(24/69)、41.0%(59/144)，經(jīng)Log-rankχ2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，圖3b。

a:HBV-HCC患者；b:非HBV-HCC患者圖3 Kaplan-Meier曲線

2.6 Cox回歸分析影響HBV-HCC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

經(jīng)單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析，年齡較大、BCLC分期較晚及AST、TBil、ALB、AFP、血清外泌體miR-222-3p水平較高是影響HBV-HCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 Cox回歸分析影響HBV-HCC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

3 討論

HBV感染是HCC發(fā)生的原因之一，也是最嚴(yán)重和最普遍的慢性病毒感染，患者的預(yù)后通常較差[2]。因此，迫切需要尋找新的診斷或預(yù)后生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，HBV-HCC組的血清外泌體miR-222-3p水平較非HBV-HCC組和HBV組顯著升高，其高表達(dá)與患者不良預(yù)后密切相關(guān)，提示miR-222-3p可作為HBV-HCC早期診斷或潛在治療靶點(diǎn)的分子生物學(xué)指標(biāo)。

外泌體是由包括癌細(xì)胞在內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞分泌的小膜泡，其通過(guò)傳遞活性生物分子在調(diào)節(jié)細(xì)胞間通訊中發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成、轉(zhuǎn)移和其他生物過(guò)程[3]。miRNA是一類長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，主要通過(guò)與mRNA 3’非翻譯區(qū)結(jié)合并觸發(fā)mRNA降解或翻譯抑制來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[5]。外泌體中的miRNA相對(duì)穩(wěn)定，可防止細(xì)胞外核糖核酸酶降解。因此，外泌體miRNA可作為各種惡性腫瘤診斷和預(yù)后的非侵入性生物標(biāo)志物。血清外泌體高度富集miRNA，外泌體可以在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移miRNA，從而影響HCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。越來(lái)越多的證據(jù)表明，外泌體中miRNA的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致HBV-HCC的發(fā)生和進(jìn)展，如HBV-HCC患者血清miR-125b、miR122水平下調(diào)[10-11]，而miR-210-3p水平上調(diào)[12]，這些都可能成為HBV-HCC的候選生物標(biāo)志物。本研究中，血清外泌體miR-222-3p在區(qū)分HBV-HCC和非HBV-HCC或HBV-HCC和HBV時(shí)具有較高的準(zhǔn)確性，而且其高表達(dá)與HBV-HCC患者HBV-DNA拷貝、BCLC分期有關(guān)，說(shuō)明HBV感染可能增強(qiáng)了miR-222-3p的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)疾病進(jìn)展。

有研究發(fā)現(xiàn)，miR-222-3p在各種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，如miR-222-3p可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡，并與腎細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后相關(guān)[13]。吳俊藝等[14]發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miR-222-3p在HCC中異常高表達(dá)，并與HCC患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，但并未分析miR-222-3p與肝炎病毒感染的關(guān)系。一些基礎(chǔ)研究顯示，miR-222-3p過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[15-19]。本研究結(jié)果顯示，血清外泌體miR-222-3p的表達(dá)與非HBV-HCC組患者的預(yù)后無(wú)關(guān)，但是血清外泌體miR-223-3p表達(dá)與HBV-HCC患者BCLC分期有關(guān)，特別是在BCLC C分期(晚期)和D分期(終末期)患者中，miR-223-3p水平升高更為常見(jiàn)；Kaplan-meier生存分析也顯示，HBV-HCC患者miR-222-3p高表達(dá)患者總生存率明顯低于miR-222-3p低表達(dá)患者，且血清外泌體miR-222-3p水平升高是影響HBV-HCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以上結(jié)論說(shuō)明miR-222-3p可能在HBV-HCC中起到促癌作用。以前的體外研究已經(jīng)報(bào)道了miR-223-3p在HBV-HCC細(xì)胞中的作用，如Sun等[8]發(fā)現(xiàn)HBV可誘導(dǎo)miR-222-3p表達(dá)上調(diào)，而miR-222-3p又進(jìn)一步通過(guò)直接結(jié)合THBS1 mRNA的3’非翻譯區(qū)并充當(dāng)其競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA，上調(diào)THBS1促進(jìn)HCC增殖并抑制細(xì)胞凋亡。Bandopadhyay等[16]鑒定了HBV感染中miRNAs差異性表達(dá)譜，證實(shí)外泌體miR-222表達(dá)增加。HBV X蛋白與HCC的發(fā)生有關(guān)，HBV X蛋白通過(guò)與p53的直接相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程，如減少DNA修復(fù)和抑制p53介導(dǎo)的凋亡[17]。此外，據(jù)報(bào)道，HBV X蛋白可上調(diào)miR-222，而miR-222過(guò)表達(dá)直接導(dǎo)致腫瘤抑制基因和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子p27的下調(diào)[18]，這也解釋了本研究中血清外泌體miR-222-3p水平與HBV DNA拷貝呈正相關(guān)。因此，miR-222-3p可能是HBV-HCC良好的預(yù)后生物標(biāo)志物。

綜上，血清外泌體miR-222-3p與HBV-HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是影響HBV-HCC患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，血清外泌體miR-222-3p表達(dá)水平升高預(yù)示著HBV-HCC患者預(yù)后不良，因此，血清外泌體miR-222-3p可作為HBV-HCC早期診斷或治療靶點(diǎn)的候選生物標(biāo)志物。但本研究仍處于初步探索階段，樣本量較小且血清外泌體miR-222-3p在HBV-HCC中的潛在機(jī)制尚未闡明，具有一定局限性，仍需要更多的臨床研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。