人胎球蛋白A在原發(fā)性肝癌血清中的表達(dá)及臨床相關(guān)性研究

王 朋,付劍惠,劉琦琦,張新毅,王 慧,郭 莉,孫健淇,崔凌志 (.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 包頭 04030;.包頭市腫瘤醫(yī)院藥劑科，內(nèi)蒙古 包頭 04030)

目前原發(fā)性肝癌已成為全世界最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1]。肝癌的發(fā)病率及病死率均居所有惡性腫瘤的前三位[2-5]。原發(fā)性肝癌作為一種高發(fā)病率、高病死率且病情隱匿的疾病，對(duì)其檢測(cè)、診斷、治療及患病機(jī)制進(jìn)行研究具有非常重要的意義[6-7]。

目前，甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)是臨床上診斷原發(fā)性肝癌血清標(biāo)志物的“金標(biāo)準(zhǔn)”。Collier等[8]的研究表明，AFP水平在20 ng·mL-1為篩查原發(fā)性肝癌的臨界值，但AFP診斷肝癌的敏感度僅為40%～80%，特異性為49%～91%。這主要是因?yàn)锳FP的合成需要在特定的細(xì)胞周期內(nèi)，當(dāng)AFP的基因表達(dá)低甲基化時(shí)，肝癌表現(xiàn)為AFP陽(yáng)性；而在轉(zhuǎn)錄后翻譯前AFP表達(dá)調(diào)控停止時(shí)，則肝癌表現(xiàn)為AFP陰性，這在一定程度上影響了AFP的臨床應(yīng)用。對(duì)腫瘤直徑小于2 cm的原發(fā)性肝癌患者，AFP的敏感度則更低。目前原發(fā)性肝癌診斷標(biāo)志物的研究大多停留在實(shí)驗(yàn)室階段，α-L-巖藻糖苷酶(α-L-fucosidase,AFU)與AFP及B超聯(lián)合檢測(cè)，可將肝癌診斷的特異性提高至95%[9-10]。

人胎球蛋白A(α2-Heremans-Schmid glycoprotein,AHSG)全長(zhǎng)約為1.5 kb，由A鏈和B鏈組成，具有高度的遺傳多態(tài)性，基因型的不同可導(dǎo)致AHSG轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和分泌水平的不同[11]。有研究表明AHSG具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，可與腫瘤中的特異性細(xì)胞因子結(jié)合，抑制結(jié)合于細(xì)胞表面的受體表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[12-13]。

本研究采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)原發(fā)性肝癌、肝硬化和其他肝病患者的AHSG水平，探討AHSG的活性與肝病嚴(yán)重程度的相關(guān)性，同時(shí)探討AHSG和AFP聯(lián)合檢測(cè)在原發(fā)性肝癌中的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

TBA120FR全自動(dòng)生化分析儀，MK3酶標(biāo)儀，E601化學(xué)發(fā)光分析儀，ECLIA-IIS化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，湘儀L550離心機(jī)，全自動(dòng)洗板機(jī)，振蕩器。

1.2 試劑

AFU檢測(cè)試劑盒、質(zhì)控品及其校準(zhǔn)品均由寧波美康生物科技股份有限公司提供；AHSG及其校準(zhǔn)品由廈門研科生物技術(shù)有限公司提供；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(gamma-glutamyl transpeptidase，GGT)檢測(cè)試劑盒、質(zhì)控品及其校準(zhǔn)品均由貝克曼庫(kù)爾特公司提供；乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)檢測(cè)試劑盒及其校準(zhǔn)品由美國(guó)羅氏診斷公司提供；癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、糖類抗原125(carcinoembryonic antiten，CA125)、糖類抗原199(carcinoembryonic antiten，CA199)、AFP檢測(cè)試劑盒及其校準(zhǔn)品由北京華科泰生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 標(biāo)本收集

收集內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院(簡(jiǎn)稱包醫(yī)二附院)2016年6月至2019年12月169例肝病住院患者的血清，其中原發(fā)性肝癌患者61例，年齡47～67歲，平均(56.9±9.6)歲，男35例，女26例；肝硬化患者63例，年齡18～75歲，平均(58.7±11.0)歲，男39例，女24例；其他肝病(包括肝損傷、肝腫物、肝占位和肝功能異常)患者45例，年齡18～75歲，平均(58.8±13.5)歲，男30例，女15例。原發(fā)性肝癌的診斷參照2011年版《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》，肝硬化的診斷結(jié)合肝活檢、影像學(xué)檢查及實(shí)驗(yàn)室檢查等。采集包醫(yī)二附院同期30例體檢中心健康人員的血清作為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重的心、肺、腎疾病；②合并免疫性疾病、嚴(yán)重感染性疾病、血液病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病及其他惡性腫瘤；③妊娠；④酒精性肝病和丙型肝炎病毒引起的肝病。

1.4 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)AHSG活性

將AHSG檢測(cè)試劑盒從冰箱取出，室溫放置30 min，設(shè)置校準(zhǔn)品孔和待測(cè)樣本孔，分別加入AHSG校準(zhǔn)品和待測(cè)樣本100 μL，混勻后蓋上板貼，37 ℃溫育 2 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，不必洗板。每孔加入生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，蓋上新板貼，37 ℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，使用自動(dòng)洗板機(jī)洗板3次，扣干。每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μL，蓋上新板貼，37 ℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，再使用自動(dòng)洗板機(jī)洗板5次，扣干。每孔依次加入底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色5 min；每孔依次加入終止溶液50 μL，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處依次測(cè)量各孔的光密度(OD)值。

1.5 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)AFP活性

AFP檢測(cè)試劑盒內(nèi)取出包被板，分別加入25 μL的AFP校準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，再分別向孔內(nèi)加入150 μL標(biāo)記物，充分震蕩后，37 ℃溫育30 min，用稀釋后的洗滌液洗板5次，最后將包被板在干凈的濾紙上扣干。再分別加入發(fā)光底物100 μL，瞬時(shí)震蕩后立即檢測(cè)。

1.6 其他項(xiàng)目的檢測(cè)

采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)AFU、ALT、GGT、AST、ALP水平。采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)CEA、CA125、CA199、HBsAg水平。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

校準(zhǔn)品以6 000 r/min離心30 s，用1 mL樣本稀釋液溶解，放置備用。取7個(gè)1.5 mL離心管依次排列，各加入250 μL樣本稀釋液。吸取250 μL校準(zhǔn)品到第1個(gè)離心管，再?gòu)牡?個(gè)離心管吸取250 μL到第2個(gè)離心管，以此類推進(jìn)行校準(zhǔn)品的倍比稀釋。將校準(zhǔn)品減去空白孔數(shù)值后繪制曲線，以校準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，OD值為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 Child-Pugh評(píng)分評(píng)估肝功能分級(jí)

根據(jù)患者的基線信息，結(jié)合肝性腦病、腹水、凝血酶原時(shí)間、血清白蛋白及血清總膽紅素5個(gè)指標(biāo)計(jì)算Child-Pugh評(píng)分，其中每項(xiàng)1～3分，將5個(gè)指標(biāo)得分相加。根據(jù)Child-Pugh評(píng)分進(jìn)行分級(jí)，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：A級(jí)為5～6分；B級(jí)為7～9分；C級(jí)為10～15分。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用IBM SPSS Statistics 20 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。AHSG水平與患者Child-Pugh分級(jí)的相關(guān)性采用Pearson分析；各組檢測(cè)數(shù)據(jù)偏態(tài)分布用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(P25～P75)]表示，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)算每個(gè)指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合診斷的ROC曲線下面積(areaunderthecurve,AUC)用于診斷效能的評(píng)價(jià)；以Youden指數(shù)最大時(shí)為最佳Cut-off值，計(jì)算敏感度和特異性。

2 結(jié)果

2.1 不同Child-Pugh分級(jí)患者AHSG水平比較

Child-Pugh分級(jí)結(jié)果顯示，61例肝癌患者中，A級(jí)有40例(65.6%)，B級(jí)有20例(32.8%)，C級(jí)有1例(1.6%)；63例肝硬化患者中，A級(jí)有41例(65.1%)，B級(jí)有22例(34.9%)；45例其他肝病患者中，A級(jí)有36例(80.0%)，B級(jí)有9例(20.0%)。其中肝癌組Child-Pugh分級(jí)B級(jí)患者的AHSG水平高于A級(jí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 不同Child-Pugh分級(jí)患者AHSG水平比較(ng·mL-1)

2.2 各組實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果比較

肝癌組的AHSG、AFP、CEA水平高于肝硬化組、其他肝病組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝癌組的AST、GGT和ALP水平均高于肝硬化組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝硬化組的AFP、ALT、AST、GGT、ALP水平低于其他肝病組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝硬化組的AHSG、AFU、CA199、CA125、AST、ALP水平高于對(duì)照組，AFP水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝癌組與肝硬化組的AFU、CA199、CA125、ALT水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；肝硬化組和其他肝病組的AHSG、AFU、CEA、CA199、CA125水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果比較[M(P25～P75)]

2.3 AHSG診斷原發(fā)性肝癌的分析

肝癌組AHSG的平均水平(中位數(shù))明顯高于肝硬化組、其他肝病組和對(duì)照組，肝癌組AHSG的波動(dòng)程度也比其他3組要大(圖1)。ROC曲線結(jié)果顯示，AHSG、AFP、AFU和CEA單獨(dú)檢測(cè)的AUC(95%CI)分別是0.707(0.618～0.797)、0.885(0.824～0.946)、0.649(0.618～0.797)、0.675(0.588～0.763)，P值分別是0.000、0.000、0.001、0.000，AHSG和AFP聯(lián)合檢測(cè)的AUC(95%CI)是0.900(0.845～0.955)，P=0.000，AHSG、AFP、AFU三者聯(lián)合檢測(cè)的AUC(95%CI)是0.900(0.845～0.955)，P=0.000，而AHSG、AFP、AFU、CEA聯(lián)合檢測(cè)的AUC(95%CI)是0.906(0.853～0.960)，P=0.000，見圖2。

*:提示極端值，在AHSG試劑盒檢測(cè)線性范圍內(nèi)圖1 各組AHSG水平比較

圖2 AHSG診斷原發(fā)性肝癌的ROC曲線分析

2.4 AHSG、AFP、AFU和CEA單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷原發(fā)性肝癌

以原發(fā)性肝癌診斷作為因變量，將AHSG、AFP、AFU和CEA作為連續(xù)型變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，以Youden指數(shù)最大時(shí)為最佳Cut-off值，每個(gè)單獨(dú)檢測(cè)項(xiàng)目取3個(gè)濃度進(jìn)行敏感度和特異性的比較。結(jié)果顯示單獨(dú)使用AHSG作為診斷原發(fā)性肝癌標(biāo)志物的最佳Cut-off值為100 ng·mL-1，敏感度達(dá)60.7%，特異性達(dá)81.5%；單獨(dú)使用AFP作為診斷原發(fā)性肝癌標(biāo)志物的最佳Cut-off值為10 ng·mL-1，敏感度達(dá)80.3%，特異性達(dá)89.9%；AHSG和AFP聯(lián)合檢測(cè)診斷原發(fā)性肝癌的敏感度達(dá)80.3%，特異性達(dá)90.8%；AHSG、AFP、AFU三者聯(lián)合檢測(cè)及AHSG、AFP、AFU、CEA四者聯(lián)合檢測(cè)診斷原發(fā)性肝癌的敏感度均為80.3%，特異性均為90.8%，見表3。因此，AHSG和AFP聯(lián)合檢測(cè)用于診斷原發(fā)性肝癌明顯優(yōu)于4個(gè)項(xiàng)目的單獨(dú)檢測(cè)[0.900(95%CI:0.845～0.955)]。

表3 診斷原發(fā)性肝癌的4個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目Cut-off值、敏感度和特異性比較

3 討論

原發(fā)性肝癌是一種發(fā)病隱匿、惡性程度高的惡性腫瘤，其無(wú)特異性的癥狀或體征；超過(guò)50%的原發(fā)性肝癌患者在初次就診時(shí)就己進(jìn)入中晚期，失去根治性治療的機(jī)會(huì)，只有少數(shù)的患者能夠在早期診斷。診斷原發(fā)性肝癌的腫瘤標(biāo)記物較多，但缺乏診斷敏感度和特異性都較高的標(biāo)志物，需多個(gè)項(xiàng)目聯(lián)合檢測(cè)以彌補(bǔ)單個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目敏感度或特異性低的缺陷。原發(fā)性肝癌篩查和輔助診斷最常用的血清學(xué)標(biāo)志物包括AFP、AFU和CEA，其中AFP診斷的專一性僅次于病理檢查[14-15]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)AFP臨界值為20 ng·mL-1時(shí)，AFP診斷肝癌的敏感度達(dá)65%，特異性達(dá)94%，但AFP用于原發(fā)性肝癌早期診斷的假陰性率很高，在45%左右，當(dāng)肝癌進(jìn)展到晚期時(shí)，AFP表達(dá)量超過(guò)檢測(cè)線性范圍，也會(huì)出現(xiàn)假陰性，這會(huì)對(duì)臨床醫(yī)師的診斷造成一定的影響[16]。既往研究表明，在腫瘤患者的血清中常常能夠檢測(cè)出AHSG自身抗體，在腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中都會(huì)有一個(gè)合成AHSG的子集，從而推測(cè)AHSG可能是腫瘤生長(zhǎng)的最早指標(biāo)之一[17-18]。因此，本研究將AHSG作為主要標(biāo)志物，同時(shí)選擇了3個(gè)濃度梯度并分別聯(lián)合AFP、AFU和CEA對(duì)原發(fā)性肝癌進(jìn)行診斷。

本研究評(píng)估了AHSG、AFP、AFU和CEA 4種腫瘤標(biāo)記物在原發(fā)性肝癌、肝硬化、其他肝病診斷中的有效性，同時(shí)對(duì)腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行單獨(dú)和聯(lián)合診斷疾病的敏感度和特異性了分析和比較，結(jié)果顯示，肝癌組患者的血清AHSG水平明顯高于肝硬化組和其他肝病組，表明AHSG對(duì)于診斷肝癌具有重要的臨床意義。Child-Pugh分級(jí)結(jié)果顯示，肝癌組B級(jí)患者的AHSG水平高于A級(jí)，C級(jí)由于標(biāo)本數(shù)量的限制不作比較，初步提示AHSG水平與肝病的嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究將AHSG、AFP、AFU和CEA進(jìn)行單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)，ROC曲線結(jié)果顯示，聯(lián)合檢測(cè)的AUC顯著優(yōu)于單獨(dú)檢測(cè)，因此在原發(fā)性肝癌診斷上建立合理的多指標(biāo)檢測(cè)模型有利于提高其準(zhǔn)確性。

本研究選擇了3個(gè)濃度梯度并分別聯(lián)合AFP、AFU和CEA對(duì)原發(fā)性肝癌進(jìn)行診斷，Youden指數(shù)計(jì)算結(jié)果顯示，AHSG診斷原發(fā)性肝癌的最佳Cut-off值是100 ng·mL-1，其敏感度為60.7%，特異性為81.5%；而單獨(dú)使用AFP作為診斷原發(fā)性肝癌標(biāo)志物的最佳Cut-off值為10 ng·mL-1，敏感度達(dá)80.3%，特異性達(dá)89.9%，比文獻(xiàn)[8]報(bào)道的20 ng·mL-1效果好。而腫瘤標(biāo)記物聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果顯示，聯(lián)合檢測(cè)的敏感度和特異性優(yōu)于四項(xiàng)單獨(dú)檢測(cè)。在評(píng)價(jià)AHSG和AFP聯(lián)合檢測(cè)，AHSG、AFP、AFU三者聯(lián)合檢測(cè)，AHSG、AFP、AEU、CEA四者聯(lián)合檢測(cè)的特異性和敏感度發(fā)現(xiàn)，腫瘤標(biāo)記物數(shù)量增加過(guò)多時(shí)特異性和敏感度并無(wú)變化，因此在診斷原發(fā)性肝癌時(shí)并不是聯(lián)合檢測(cè)的項(xiàng)目越多，敏感度和特異性越高。然而本研究納入的原發(fā)性肝癌病例相對(duì)較少，缺乏隨訪數(shù)據(jù)，今后將大量收集隨訪的臨床數(shù)據(jù)，以更加明確AHSG對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷意義。

綜上所述，AHSG在原發(fā)性肝癌診斷中是具有重要意義的腫瘤標(biāo)志物之一，AHSG和AFP聯(lián)合檢測(cè)可彌補(bǔ)AFP單獨(dú)檢測(cè)的特異性不足問(wèn)題，進(jìn)一步提高了對(duì)原發(fā)性肝癌診斷的特異性。