磷酸酯鍵基智能響應體系在生物醫(yī)學領域的研究進展

虞銘璐，夏鵬飛，尹靜波

(上海大學材料科學與工程學院，上海 200444)

磷酸酯鍵在體內參與核酸、三磷酸腺苷(ATP)、還原型輔酶I (NADH)和細胞膜磷脂雙分子層合成，是人體內的一種重要化學鍵，合成機理包括磷酸或磷酰氯與醇的酯化反應[1,2]。其中，磷酸與醇的酯化反應活性較低，加入濃硫酸、2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）[3]等催化劑可提高其反應效率。磷酰氯與醇的酯化反應活性高，是磷酸酯鍵的有效合成途徑。

Fig.1 列舉了磷酸酯鍵的結構穩(wěn)定性、生物可降解性和酶響應性等性質。磷酸酯鍵在體內鍵合核苷酸合成核酸大分子時表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性，保證了作為遺傳物質的核酸的結構穩(wěn)定性[4]。磷酸酯鍵具有水解放熱的能力，在體內參與ATP 形成，通過磷酸酯鍵斷裂釋能可實現(xiàn)ATP 為生命活動供能的目的[5]。磷酸酯鍵具有一定的親水性，參與細胞膜磷脂雙分子層形成，發(fā)揮控制細胞內外物質交換的作用[6]。將磷酸酯鍵引入疏水性藥物可改善藥物的水溶性，提高疏水性藥物的細胞攝入效率。此外，磷酸酯鍵可提高疏水材料的親水性，有利于細胞黏附[7]。

Fig. 1 Properties of phosphate ester bond

Fig. 2 Esterification reaction of phosphoric acid and alcohols

值得一提的是，磷酸酯鍵具有酶響應性，在堿性磷酸酶(ALP)催化作用下高效斷裂，成為一種新型的智能響應“開關”[8]。研究者們將含磷酸酯鍵的聚合物制備成納米粒子[9]等材料，裝載藥物后用于細菌感染治療，磷酸酯鍵在細菌分泌的ALP 作用下斷裂，實現(xiàn)細菌觸發(fā)的藥物控制釋放，達到良好的抗菌效果并提高藥物利用率。針對腫瘤微環(huán)境中過表達的ALP[10]，可利用含磷酸酯鍵的聚合物膠束[11]等材料作為藥物載體，實現(xiàn)化療藥物的靶向遞送，為腫瘤治療提供一種有效策略。

磷酸酯鍵還可用于調控材料的降解速率[12]，實現(xiàn)材料降解周期與組織生長周期相匹配。水凝膠功能化的磷酸酯鍵被證實可以響應成骨細胞分泌的ALP 而斷裂，實現(xiàn)水凝膠降解速率的調控，為新骨生長提供充足的空間。此外，磷酸酯鍵斷裂產(chǎn)生的磷酸根能促進生物礦化[13]、促進骨再生和骨整合[14]。

1 磷酸酯鍵合成機理

磷酸酯鍵的合成機理為磷酸或磷酰氯與醇的酯化反應。

1）磷酸與醇的酯化反應

Fig.2 是磷酸與醇的酯化反應式，通過磷酸脫羥基及醇脫氫的反應機理合成磷酸酯鍵[15]。該反應活性較低，需要使用濃硫酸和BHT 等為催化劑。Brendan 等[3]以側鏈含有磷酸基團的丙烯酸酯類聚合物為基礎，在BHT 催化作用下通過磷酸酯鍵成功鍵合了甲基丙烯酸縮水甘油酯。

2）磷酰氯與醇的酯化反應

磷酰氯反應活性高，是合成磷酸酯鍵的重要反應物之一。1936 年，Arvin 首次發(fā)表了由雙酚A 與磷酸二酰氯?；s合得到聚磷酸酯的專利，證實了磷酰氯與醇發(fā)生酯化反應合成磷酸酯鍵的可行性。Fig.3 是磷酰氯基團與醇羥基的酯化反應式，通過酰氯的醇解形成磷酸酯鍵。副產(chǎn)物鹽酸會降低反應活性，加入堿作為縛酸劑可提高反應效率。此外，通過三氯氧磷或磷酸二酰氯與多元醇酯化反應，可以實現(xiàn)鏈增長獲得支化結構[16]（Fig.4）。Yao等[11]通過磷酰氯與醇羥基的縮聚反應獲得了含磷酸酯鍵的超支化聚磷酸酯。Du 等[17]以2-羥基乙基丙烯酸酯和二氯磷酸乙酯為原料，吡啶作為縛酸劑獲得了含有磷酸酯鍵的丙烯酸酯類化合物。

Fig. 3 Esterification reaction of phosphoryl chloride with alcohols

Fig. 4 Esterification reaction of phosphoryl chloride and polyhydric alcohols

Fig. 5 Application of phosphate ester bond-based intelligent response system in antibacterials

對比分析2 種合成機理，磷酰氯與醇的酯化反應活性比磷酸與醇的反應更高，且可以通過調節(jié)活性基團比例設計不同的分子結構，如支化結構等，因而是合成磷酸酯鍵的有效策略。

2 磷酸酯鍵基智能響應體系應用

磷酸酯鍵由于具有智能響應ALP 并快速斷裂的優(yōu)勢，在細胞培養(yǎng)、組織修復、藥物控釋及生物探針等領域已獲得廣泛應用，具有巨大研究價值。Tab.1 對磷酸酯鍵基智能響應體系在生物醫(yī)藥領域的研究進展進行了匯總。

Tab. 1 Research progress of phosphate ester bond-based intelligent response system in biomedical field

2.1 用于細胞培養(yǎng)

細胞增殖和分化是細胞培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)。含磷酸酯鍵的水凝膠可在細胞分泌的ALP 催化作用下降解，一方面為細胞擴增提供空間，促進細胞增殖；另一方面降低水凝膠模量，促進細胞黏附和分化[31]。

Gaihre 等[18]提出了一種通過水凝膠生物礦化促進細胞分化的策略。由三氯氧磷和醇羥基的酯化反應獲得含磷酸酯鍵的PEG 水凝膠，磷酸酯鍵在ALP 處理后斷裂并產(chǎn)生磷酸根，進而結合鈣離子并生成羥基磷灰石，使水凝膠均勻礦化。此外，該PEG 基生物礦化水凝膠能促進MC3T3-E1 細胞黏附和增殖。

Wachiralarpphaithoon 等[19]通過開環(huán)聚合獲得了含磷酸酯鍵的丙烯酰氧基共聚物，并制備水凝膠。該水凝膠含有大量磷酸酯鍵，隨著水凝膠接種的細胞密度上升，水凝膠中的磷酸酯鍵在細胞分泌的ALP 的作用下斷裂并加速水凝膠降解，為細胞生長提供必要空間，達到了加速細胞增殖的效果。

Toda 等[20]通過自由基聚合法制備了含磷酸酯鍵的丙烯酰胺基水凝膠，磷酸酯鍵在ALP 作用下斷裂，導致水凝膠的彈性模量下降，水凝膠上黏附的MSCs 骨架變?yōu)榧氶L狀，并有效上調了Runx2 等成骨基因的表達水平。

2.2 用于骨修復

含有磷酸酯鍵的生物材料一方面可調控材料的降解速率，為骨組織的生長發(fā)育提供充足空間，一方面可釋放利于基質礦化的磷酸，因而在骨組織再生領域具有重要應用價值。

Wang 等[12]合成了一種磷酸酯鍵基聚乙二醇(PhosPEG)水凝膠，用于包埋MSCs。該水凝膠中含有大量磷酸酯鍵，可在ALP 催化下加速裂解。在成骨培養(yǎng)基中，PhosPEG 水凝膠礦化程度顯著大于PEG 水凝膠。Watson 等[21]合成了側鏈含磷酸酯鍵的甲基丙烯酸酯類共聚物，在生理溫度下可熱引發(fā)交聯(lián)形成水凝膠。磷酸酯鍵在骨細胞產(chǎn)生的ALP 作用下斷裂，從而加速水凝膠局部降解，并提高了酶促降解區(qū)的細胞增殖和遷移。

將磷酸酯鍵整合到聚合物中，可模仿磷酸基團在天然組織中的作用[22]，有利于鈣沉積，并促進骨組織再生。Huang 等[22]制備了一種含有磷酸酯鍵的聚甘油葵二酸酯(PSeD-P)多孔支架，PSeD-P 中的磷酸酯鍵能夠模仿天然含磷分子結構，并具有生物活性。另外，PSeD-P 支架上修飾的磷酸酯鍵還鍵合了骨誘導組分——β-甘油磷酸(β-GP)，其在降解過程中緩慢釋放，有利于干細胞的分化和礦化。

牙本質磷蛋白(DPP)是牙本質基質的重要組成部分，對骨礦化過程的羥基磷灰石沉積起至關重要的作用[32]，是骨和牙齒再生的主要候選材料。Gulseren 等[33]介紹了一種含有類似DPP 結構的酶響應性肽納米纖維體系，其中磷酸酯鍵在ALP 作用下斷裂，使其自組裝形成凝膠。此外，磷酸酯鍵斷裂產(chǎn)生的磷酸基團能促進磷灰石樣礦物沉積，促進骨再生。該體系在設計新型復雜的骨科和牙科支撐材料中具有重要意義。

2.3 用于藥物控釋

酶響應性藥物控釋體系能夠實現(xiàn)藥物在病灶區(qū)的按需釋放，并避免藥物突釋引起的副作用，在臨床具有極高的應用價值。磷酸酯鍵可以響應細菌感染或癌癥環(huán)境下高表達的ALP 并發(fā)生斷裂，從而可作為一種智能響應體系“開關”，在藥物控釋領域受到廣泛關注。

Xiong 等[23]報道了一種含磷酸酯鍵的具有核殼結構的納米凝膠(Fig.5(A))，該納米凝膠在甘露糖靶向指引下可進入巨噬細胞，磷酸酯鍵在細菌分泌的ALP 作用下斷裂，觸發(fā)納米凝膠內核裂解，實現(xiàn)萬古霉素控制釋放(Fig.5(B))，有效抑制了耐甲氧西林葡萄球菌的生長。進一步地，Chen 等[24]在含磷酸酯鍵和抗生素—環(huán)丙沙星(CIP)的納米粒子上功能化了具有細菌識別能力的去鐵胺(DFO)，磷酸酯鍵在響應巨噬細胞內ALP 后斷裂并觸發(fā)去鐵胺-環(huán)丙沙星復合物釋放，達到了高效殺菌的目的(Fig.5(C,D))。

Fig. 6 Schematic illustration of preparation and application of chitosan-based membranes[25]

Fig. 7 Illustration of structure of DOX- and IR-780 coloaded hyperbranched polyphosphoester nanomedicines[11]

牙周炎是一種細菌誘導的慢性、破壞性的炎癥性疾病，會損傷牙周組織，最終導致牙齒脫落[34,35]。牙周炎發(fā)作時，牙周組織中ALP 含量異常升高[36,37]。針對這一特性，Li 等[25]制備了一種含磷酸酯鍵且負載有抗生素—鹽酸米諾環(huán)素的殼聚糖膜(Fig.6)。該載藥薄膜具有ALP 響應性，一方面可控釋鹽酸米諾環(huán)素，達到牙周炎治療目的；另一方面可加快殼聚糖膜降解，為牙周炎下的牙槽骨組織缺損修復提供了一種有效策略。

此外，腫瘤環(huán)境下也存在ALP 的過度表達，因此，含磷酸酯鍵的藥物控釋材料在腫瘤治療領域也具有應用價值。Yao 等[11]合成了可降解超支化聚磷酸酯(hPPE)，并用相分離法制備成膠束，用于抗癌藥——阿霉素的遞送[Fig.7]。hPPE 中的磷酸酯鍵受ALP 作用斷裂，進而引發(fā)了納米膠束的裂解和阿霉素的釋放。Wu 等[26]設計了一種含磷酸化酪氨酸的酶響應自組裝分子(LND-p-ES)。通過ALP 催化斷裂磷酸酯鍵實現(xiàn)LND-p-ES 自組裝形成納米纖維，提高了癌細胞攝取納米纖維的效率，從而達到將化療藥—洛尼達明（LND）靶向送達癌細胞的目的。為了延長藥物在腫瘤細胞內的停留時間，Hong 等[38]設計了一種含磷酸酯鍵的自組裝兩親性肽藥物遞送系統(tǒng)。兩親性肽在負載疏水性化療藥——DOX 后組裝成球形載藥納米顆粒，磷酸酯鍵在ALP 的作用下斷裂，使多肽的一級結構發(fā)生轉變并形成納米纖維，從而有效釋放包裹DOX。該方法提高了腫瘤部位的局部藥物積累，在抗腫瘤治療中的具有潛在應用價值。

2.4 用于生物探針

生物探針是分子生物學和生物化學實驗中用于指示特定物質的性質或物理狀態(tài)的一類標記分子，具有傳感、熒光成像等功能[39]。生物探針上修飾的磷酸酯鍵可在ALP 作用下斷裂，引起探針分子親疏水性或構象轉變，從而具備熒光標記特性[40]，因而在ALP 高表達的病灶區(qū)具有應用價值。

腫瘤環(huán)境下ALP 含量異常增高，因而含磷酸酯鍵的生物探針在腫瘤診斷領域具有應用價值。Ye等[27]在疏水性多肽上連接了含磷酸酯鍵的近紅外(NIR)熒光團P-Cy 和順磁螯合物DOTA-Gd，得到含磷酸酯鍵的多肽探針P-CyFF-Gd。磷酸酯鍵在ALP作用下斷裂并觸發(fā)多肽探針原位自組裝并觸發(fā)熒光反應(Fig.8(A))。該探針具有無創(chuàng)、高靈敏度、高分辨率成像等優(yōu)勢，NIR 引導下可實現(xiàn)肝腫瘤的實時標記。Gao 等[28]合成了由七甲氰熒光團和磷酸單酯構成的NIR 探針QcyP(Fig.8(B))。在ALP 作用下，磷酸酯鍵斷裂，導致共軛π-電子體系的重排，觸發(fā)了探針的“開關”，可以精準識別肝腫瘤細胞。Zhong 等[41]報道了一種含有發(fā)光基團——香豆素和磷酸酯鍵的多肽衍生物(pYD)(Fig.8(C))。pYD 的磷酸酯鍵在ALP 作用下斷裂，并原位自組裝形成發(fā)光納米纖維，實現(xiàn)腫瘤顯影。Li 等[42]合成了含有磷酸酯鍵的喹啉-丙二腈基納米探針(DQM-ALP)。探針的磷酸酯鍵在ALP 的作用下斷裂，疏水內核聚集誘導熒光反應，實現(xiàn)ALP 的高分辨率顯影。

Fig. 8 Application of phosphate ester bond-based intelligent response system intumor tracer

此外，由于各種磷酸酯衍生物對骨礦物質和鈣鹽具有高親和力，已被廣泛用作骨成像和骨病治療的靶向治療劑[43]。在骨組織修復初期，新骨形成情況難以通過計算機斷層掃描或磁共振成像顯示[44]，因此高分辨率實時活體成像技術成為新骨生長發(fā)育的重要探測手段。ALP 在新生骨組織中含量較高，可作為一種骨形成的早期生物標志物。Park 等[29]合成了包含酚類二羥基噻吩熒光基團和磺酸基磷酸鹽的NIR 探針。磷酸酯鍵在ALP 作用下斷裂后可發(fā)出熒光，實現(xiàn)ALP 響應性的熒光開啟(Fig.9(A))。將這種探針標記在磷酸鈣支架上，可以監(jiān)測支架植入后早期ALP 的表達，從而評估支架內骨礦物沉積情況。Yang 等[30]構建了一種聚己內酯/硅酸鈣復合支架，半胱氨酸(LET-3)在支架表面通過自組裝技術形成納米粒子, 用于ALP 水平監(jiān)測和成像(Fig.9(B))。其中LET-3 中含有磷酸酯鍵，能夠被ALP 特異性斷裂，激活其NIR 成像特性。將含有磷酸酯鍵的生物探針與骨組織工程支架結合是檢測新骨形成的一種很有前景的策略，在組織修復體內示蹤領域具有應用潛力。

Fig. 9 Application of phosphate ester bond based intelligent response system in bone detection

3 總結與展望

磷酸酯鍵具有高度穩(wěn)定性、親水性、酶響應性、促進生物礦化等性能，因而備受研究者矚目。在細胞培養(yǎng)中，通過磷酸酯鍵的智能響應性斷裂可實現(xiàn)促進細胞增殖分化的作用；在骨修復領域，磷酸酯鍵的智能響應性可使材料降解周期與骨生長周期相匹配，同時促進礦化，加速骨缺損修復；基于磷酸酯鍵的智能響應藥物控釋系統(tǒng)可作為抗生素和抗癌藥載體，實現(xiàn)靶向釋放；基于磷酸酯鍵的智能響應體系還可作為生物探針實現(xiàn)高分辨率腫瘤成像及新骨生成檢測。

未來, 如何通過分子結構及材料組成設計，提高磷酸酯鍵特異性響應ALP 的靈敏度，并拓寬磷酸酯鍵基智能響應體系的應用領域是研究者們的目標。