蘭州地區(qū)腹瀉患兒沙門菌耐藥性與分子分型分析

申艷琴，董 錕，張 璟，蘭 光，張 陽，李欣穎，閆 靜，劉小菊，權(quán)玉玲

沙門菌廣泛分布于自然環(huán)境中，是一種重要的食源性致病菌，也是常見的人獸共患病原菌，可感染人和多種哺乳動物。人類主要是通過攝入被沙門菌污染的水和食品，導(dǎo)致食物中毒及腸道疾病的發(fā)生，可能引起食源性疾病的暴發(fā)。沙門菌是全球食源性腹瀉疾病的主要致病菌[1-2]，我國每年腹瀉病中70%以上是由沙門菌感染引起的[3]，尤其是嬰幼兒細(xì)菌性腹瀉中沙門菌感染居首位[4]。

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的沙門菌血清型有2 600多種[5]，其中非傷寒沙門菌是引起兒童感染性腹瀉疾病中最常見的病原菌[6]。近年來隨著抗生素的廣泛使用，全球范圍內(nèi)沙門菌耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，已成為世界性的公共衛(wèi)生問題[7-8]，耐藥菌株的流行增加了對抵抗力較弱的嬰幼兒臨床治療難度。本研究對蘭州市2018-2020年哨點(diǎn)醫(yī)院收集的腹瀉患兒糞便標(biāo)本進(jìn)行血清學(xué)分型及藥敏試驗(yàn)，并結(jié)合PFGE分型技術(shù)對菌株進(jìn)行同源性分析，為沙門菌引起的腹瀉病臨床診療和溯源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 2018-2020年蘭州市哨點(diǎn)醫(yī)院腹瀉患兒糞便標(biāo)本中分離的149株沙門菌菌株。

1.2 儀器與試劑 Vitek 2 Compact 全自動微生物鑒定儀(法國生物梅里埃公司)或PhoenixTM全自動細(xì)菌鑒定儀(美國BD公司)，脈沖場電泳儀、Gel Dol XR 凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

沙門菌顯色培養(yǎng)基(法國科瑪嘉公司)、XLD(美國BD公司)，Swarm Agar(北京路橋公司)，沙門菌診斷血清(丹麥SSI公司，泰國S&A公司)，革蘭氏陰性菌藥敏檢測板(上海星佰生物技術(shù)有限公司)，限制性內(nèi)切酶XbaI(美國New England Biolabs公司)，蛋白酶K(Amresco)，大腸埃希標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 25922)，沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC H9812)。

1.3 檢測方法 根據(jù)國家《食源性疾病監(jiān)測工作手冊》，將哨點(diǎn)醫(yī)院上送的可疑菌株經(jīng)選擇性平板分離后純化，并使用全自動微生物鑒定儀進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定。采用《沙門菌屬血清型診斷》中玻片凝集方法，確定對應(yīng)血清型。按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會推薦的微量肉湯稀釋法對菌株最低抑菌濃度進(jìn)行藥敏測定。根據(jù)美國PulseNet沙門菌PFGE生物標(biāo)準(zhǔn)方法對沙門菌分子分型，H9812作為質(zhì)控菌株。

2 結(jié) 果

2.1 沙門菌流行特征 2018-2020年從腹瀉患兒糞便中檢出149株沙門氏菌，其中2018年檢出32株，2019年檢出65株，2020年檢出52株。感染季節(jié)分布以夏秋季(5-10月)為主，占全年的90.60%(135/149)?；純耗挲g分布以1～3歲的幼兒居多，占59.73%(89/149)；其次為1歲以下的嬰兒，占20.81%(31/149)；3～6歲幼兒及6歲以上的兒童依次占12.08%(18/149)、7.38%(11/149)。

2.2 沙門菌血清型分布 149株沙門菌共鑒定出33個血清型，以D群和B群為主，分別占46.31%和37.58%。其中腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌為流行的主要血清型別，分別占30.87%和28.19%，見表1。

表1 沙門菌血清型分布Tab.1 Salmonella serotype distribution

2.3 沙門菌耐藥特征 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示95.97%(143/149)沙門菌對14種抗生素存在不同程度的耐藥，其中氨芐西林耐藥率(79.87%)最高，四環(huán)素(65.10%)、萘啶酸(59.73%)、頭孢唑啉(52.35%)、氨芐西林/舒巴坦(46.31%)的耐藥率均在45%以上；對亞胺培南和頭孢西丁較敏感，敏感率分別為95.30%和93.96%，見表2。

表2 沙門菌對各種抗生素的耐藥情況Tab.2 Drug resistance of Salmonella to various antibiotics

兩種優(yōu)勢血清型腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌除對亞胺培南敏感外，對其他抗生素均有耐藥性，耐藥率分別為97.82%(45/46)、97.62%(41/42)。腸炎沙門菌主要耐受萘啶酸、氨芐西林、頭孢唑啉，耐藥率分別為93.40%、84.70%、52.40%；鼠傷寒沙門菌主要耐受四環(huán)素、氨芐西林，耐藥率分別為92.80%、85.70%，見圖1。

圖1 沙門菌對各種抗生素的耐藥率Fig.1 Resistance rate of Salmonella to various antibiotics

149株沙門菌有117株為多重耐藥，多重耐藥率為78.52%，共產(chǎn)生78個多重耐藥譜。其中鼠傷寒沙門菌有29個多重耐藥譜，多重耐藥率為80.95%(34/42)，5種及5種以上的耐藥菌株占到50.00%(21/42)，發(fā)現(xiàn)1株鼠傷寒沙門菌對12種抗生素耐藥(CIP-CHL-NAL-GEN-TET-CTX-AMP-AMS-CAZ-CFZ-AZM-SXT)；腸炎沙門菌有19個多重耐藥譜，多重耐藥菌率為76.09%(35/46)，優(yōu)勢耐藥譜為NAL-AMP-AMS-CFZ。

2.4 PFGE分型及聚類分析 對腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌2種優(yōu)勢血清型的分離株經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaⅠ進(jìn)行PFGE分型分析。按照圖譜經(jīng)BN軟件聚類分析，38株腸炎沙門菌分為20個帶型(SE1～SE20)，包含2株及以上帶型有6種，分別是SE12(6株，來自2018年、2019年、2020年)、SE10(5株，來自2018年、2020年)、SE1(4株，來自2020年)、SE7(2株)、SE6(2株)、SE9(2株)、SE11(2株)見圖2；31株鼠傷寒沙門菌分為30個帶型，ST1帶型包含2株菌，見圖3。

圖2 腸炎沙門菌脈沖場電泳聚類分析圖譜Fig.2 Cluster analysis of S.enteritidis by pulsed field electrophoresis

圖3 鼠傷寒沙門菌脈沖場電泳聚類分析圖譜Fig.3 Cluster analysis of S.Typhimurium by pulsed field electrophoresis

3 討 論

感染性腹瀉是兒童常見疾病之一，尤其是嬰幼兒消化系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，免疫功能不完善，抵抗力較弱，極易引起沙門菌感染。本研究發(fā)現(xiàn)在149例由沙門菌引起的腹瀉患兒中1～3歲幼兒檢出率最高(59.73%)，與深圳監(jiān)測情況一致[9]，與河南、玉林略有不同[10-11]，感染季節(jié)多發(fā)生于夏秋季。本次分離的沙門菌血清型以腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌為主，與上海、安徽地區(qū)流行優(yōu)勢血清型一致[12-13]。

隨著抗生素在臨床治療和畜牧業(yè)的廣泛應(yīng)用，沙門菌的耐藥性及耐藥種類不斷增加。本研究顯示，蘭州地區(qū)腹瀉患兒分離出的沙門菌對各類抗生素的耐藥率總體略高于全國水平，其中氨芐西林、四環(huán)素、萘啶酸耐藥較嚴(yán)重，第一代頭孢類抗生素耐藥率高于第二代、第三代，這與河南、成都報(bào)道相似[10]。 環(huán)丙沙星的耐藥率為18.12%，但它的中敏率卻高達(dá)57.72%，喹諾酮類抗菌藥物的耐藥趨勢不斷上升，為小兒慎用藥物，治療沙門菌感染患兒建議不考慮此類藥物。通過對優(yōu)勢血清型沙門菌的耐藥結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌除了對亞胺培南敏感外，對其他抗生素耐藥性各有不同。腸炎沙門菌對萘啶酸高度耐藥，而鼠傷寒沙門菌對四環(huán)素高度耐藥，建議結(jié)合血清型及藥敏結(jié)果對感染沙門菌患兒進(jìn)行臨床抗菌藥物治療。

在本次研究中，雖未出現(xiàn)ESBL菌株，但多重耐藥較為嚴(yán)重，多重耐藥率高達(dá)78.52%。尤其是鼠傷寒沙門菌，多重耐藥率為80.95%，5種及以上抗生素耐藥株占50.00%，其中1菌株耐受12種抗生素。腸炎沙門菌多重耐藥率為76.09%，優(yōu)勢耐藥譜為CHL-NAL-TET-AMP-AMS-CFZ-SXT。本次研究中還發(fā)現(xiàn)5株沙門菌同時耐受喹諾酮類藥物和頭孢類藥物，而這兩類藥物是目前臨床治療沙門菌引起腹瀉感染首選藥物。以上菌株引起的多重耐藥不僅給患兒的臨床治療帶來困難，還極易引起食源性疾病的暴發(fā)。因此，應(yīng)加強(qiáng)對沙門菌耐藥性的監(jiān)測，了解其變遷趨勢，合理使用抗菌藥物，預(yù)防多重耐藥株的出現(xiàn)和流行。

本研究采用細(xì)菌分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”[14]PFGE分子分型，對2種優(yōu)勢血清型沙門菌分型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)腸炎沙門菌同源性較高，有3個優(yōu)勢帶型。SE12帶型的6株菌來自2018年(1株)、2019年(1株)、2020年(4株)3個不同年份患兒糞便標(biāo)本，顯示此型別污染源持續(xù)存在，其中2020年4株菌分離時間非常接近，可能存在沙門菌小范圍潛在暴發(fā)。鼠傷寒沙門菌有30個帶型，型別相對分散，分布呈多樣性。因而需加強(qiáng)對嬰幼兒病例監(jiān)測，進(jìn)行溯源分析，掌握PFGE優(yōu)勢帶型，完善防控措施，防止食源性疾病暴發(fā)。

本次研究對蘭州市腹瀉患兒沙門菌進(jìn)行了血清學(xué)分型和耐藥特征分析，建立沙門菌分子分型數(shù)據(jù)庫，為感染沙門菌腹瀉患兒臨床用藥提供參考，防止多重耐藥的發(fā)生，有利于追蹤溯源。

利益沖突：無

引用本文格式：申艷琴，董錕，張璟，等. 蘭州地區(qū)腹瀉患兒沙門菌耐藥性與分子分型分析[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(7)：626-630，637. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.087