減毒狂犬病病毒CTN181-3株免疫學(xué)特性研究

石磊泰，鄒 劍，李玉華，俞永新

狂犬病是一種由狂犬病病毒感染引起的自然疫源性疾病，人和所有溫血動物都可能被感染。狂犬病的潛伏期一般為1～3個月，發(fā)病后都會出現(xiàn)致命的腦脊髓炎。到目前為止，還沒有特效治療藥物，唯一有效的方法就是接種疫苗。據(jù)80多個狂犬病流行國家的調(diào)查數(shù)據(jù)，犬是最危險的宿主。在這些地區(qū)，每年有3萬多人因瘋?cè)滤?。超過98%的人類狂犬病病例是由犬傳播的，90%以上接受暴露后疫苗接種的人口居住在犬類狂犬病流行的地區(qū)[1]。因此，在控制和消滅人類狂犬病的根本措施中，除了對人進(jìn)行有效的疫苗接種外，還需要對犬進(jìn)行大規(guī)模免疫。該方法已在多個國家和地區(qū)應(yīng)用并取得明顯效果。由于犬肌肉注射疫苗的難度和局限性，世界衛(wèi)生組織(WHO)提倡和鼓勵動物特別是犬類口服免疫的發(fā)展和應(yīng)用。

在西歐、中歐、加拿大和美國大部分地區(qū)應(yīng)用減毒活疫苗通過誘餌投放的方式口服免疫野生動物，已成功消除當(dāng)?shù)氐暮袢〔⑦_(dá)到減少和控制人狂犬病的效果[2-4]。同時，WHO極力鼓勵研究和發(fā)展安全有效的犬用誘餌口服疫苗用于家犬，并已制定了現(xiàn)場應(yīng)用口服犬用疫苗指南[5]，一些高度減毒的減毒株如SAG2和VRG株已被WHO建議用于流浪犬的口服免疫[6-7]，并已在很多國家廣泛應(yīng)用[8-10]。

我們實驗室對犬用口服狂犬病減毒活疫苗的研究早在20世紀(jì)80年代就開始了，并且已經(jīng)培育出一種毒力較小的減毒株CTN-181[11]。但CTN-181對4周以下的小鼠有致病性[12]，而且該病毒具有異質(zhì)性和遺傳穩(wěn)定性差等缺點。為了進(jìn)一步篩選出同質(zhì)性更高、減毒特性更穩(wěn)定、免疫原性更好的減毒株，我們將狂犬病毒減毒株CTN-181通過豚鼠頜下腺傳3代，用BHK21細(xì)胞空斑純化，共篩選出20 個病毒空斑。不同病毒對3周齡小鼠的毒力差異很大，較高者的病毒滴度達(dá)到3.16 lgLD50/mL，較低者則無致病性[13]。無致病性的空斑病毒共有3株，我們將其中一株CTN181-3用于暴露前和暴露后免疫學(xué)研究，以揭示CTN181-3的生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 毒種和細(xì)胞 狂犬病毒CTN181-3株，病毒顆粒濃度為6.60lgPFU/mL，由本室篩選并-80 ℃保存[11,14]；狂犬病毒CVS攻擊毒株，1976年10月從世界衛(wèi)生組織引進(jìn)[15]，病毒滴度為6.5 lgLD50/mL, -80 ℃保存；BSR細(xì)胞(81代)由巴斯德研究所提供，由我室傳代保存。

1.2 實驗動物 BALB/c小鼠，SPF級，10～12 g，由中國食品藥品檢定研究院動物繁育場提供；8周齡雌性金黃地鼠，SPF 級，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。所有動物實驗操作均遵循我國《實驗動物管理條例》有關(guān)動物福利的要求。

1.3 暴露前免疫

1.3.1 小鼠口腔/肌肉接種 用CTN181-3對10～12 g BALB/c小鼠進(jìn)行口腔免疫/肌肉1次，0.1 mL/只，每種途徑各免疫40只；免后4 d、7 d、14 d、21 d和28 d分別取6只小鼠眼球采血/取脾，用快速免疫熒光灶抑制試驗[18](RFFIT)法分別測每只小鼠的血清中和抗體水平；用固相酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(ELISPOT)法分別測每只小鼠的細(xì)胞免疫水平，計算均值。28 d時對剩余的10只小鼠， CVS融化后稀釋 10 倍取 140 μL 加到 60 mL 稀釋液中混勻，即為腦內(nèi)攻擊毒，每只腦內(nèi)注射0.03 mL，病毒攻擊量為1.5 lgLD50/只小鼠；以CVS固定毒作腦內(nèi)攻擊，觀察保護(hù)效果。

1.3.2 金黃地鼠口腔/肌肉接種 用CTN181-3對8周齡金黃地鼠進(jìn)行口腔免疫/肌肉1次，0.1 mL/只，每種途徑各免疫6只，免后14 d、28 d分別進(jìn)行心臟采血，用RFFIT法分別測血清中和抗體水平；于28 d用CVS肌肉接種攻擊，攻擊部位為左后肢肌肉。取融化后的CVS稀釋100倍即為肌肉攻擊毒，每只肌肉注射0.1 mL,病毒攻擊量為3.5 lgLD50/ 只金黃地鼠；以CVS固定毒作腦內(nèi)攻擊，觀察保護(hù)效果。

1.4 暴露后免疫 以3.5 lgLD50/只病毒量的狂犬病攻擊毒CVS對金黃地鼠肌肉感染進(jìn)行攻擊暴露，暴露6 h后進(jìn)行疫苗免疫，免疫部位與暴露部位相同，分別按以下程序免疫CTN181-3兩組，一組用vero細(xì)胞滅活狂犬病疫苗，另一組用滅活苗+狂犬病免疫球蛋白，每只0.1 mL。CTN181-3的病毒滴度為6.60 lgPFU/mL；Vero細(xì)胞滅活苗效價為5.1 IU/mL；狂犬病免疫球蛋白(效價181 IU/mL)按20 IU/kg體重注射量計算(金黃地鼠按120 g/只計算)，每只注射30 μL；對照組接種PBS溶液。觀察期為21 d，免疫程序如表1。

表1 暴露后研究免疫程序Tab.1 Immunization procedure of post-exposure study

2 結(jié) 果

2.1 CTN181-3株不同途徑免疫的抗體應(yīng)答

2.1.1 不同途徑免疫小鼠后的抗體應(yīng)答水平 對小鼠而言，無論口腔免疫還是肌肉免疫，僅免疫1次，均表現(xiàn)十分良好的抗體應(yīng)答。肌肉免疫后4 d，抗體陽轉(zhuǎn)率約為50%，至7 d時100%陽轉(zhuǎn)?？谇幻庖唠m然抗體增長較慢，但免后14 d抗體亦全部陽轉(zhuǎn)，幾何平均滴度(GMT)為1.34 IU/mL，至28 d GMT高達(dá)12.3 IU/mL，實驗結(jié)果見圖1。

圖1 不同途徑免疫小鼠后的抗體應(yīng)答動態(tài)Fig.1 Dynamics of antibody response after different route of immunization in mice

2.1.2 不同途徑免疫金黃地鼠后的抗體應(yīng)答水平 對金黃地鼠而言，無論口腔免疫還是肌肉免疫，僅免疫1次，均表現(xiàn)十分良好的抗體應(yīng)答，口腔免疫后14 d的陽轉(zhuǎn)率為100%，GMT為5.0 IU/mL，免后28 d時抗體水平略有下降，陽轉(zhuǎn)率為50%，GMT為0.70 IU/mL；肌肉免疫后14 d的陽轉(zhuǎn)率為100%，GMT為5.9 IU/mL，免后28 d時抗體水平進(jìn)一步提高，陽轉(zhuǎn)率均為100%，GMT大于11.0 IU/mL，見表2。

表2 金黃地鼠對CTN181-3不同途徑、不同時間的抗體應(yīng)答水平Tab.2 Antibody response level of golden hamster to different routes and time of CTN181-3

2.2 CTN181-3株不同途徑免疫小鼠后的細(xì)胞免疫應(yīng)答

2.2.1 口腔免疫后的細(xì)胞免疫應(yīng)答 CTN181-3株口腔免疫小鼠1次，7 d后開始產(chǎn)生有統(tǒng)計學(xué)差異的IFN-γ(圖2)和IL-2(圖3)，7 d后應(yīng)答水平均繼續(xù)升高。

圖2 小鼠口腔免疫CTN181-3株后的IFN-γ水平動態(tài)Fig.2 IFN-γ levels in mice after oral immunization with CTN181-3 strain

圖3 小鼠口腔免疫CTN181-3株后的IL-2水平動態(tài)Fig.3 IL-2 levels in mice after oral immunization with CTN181-3 strain

2.2.2 肌肉免疫后的細(xì)胞免疫應(yīng)答 CTN181-3株肌肉免疫小鼠1次，7 d開始產(chǎn)生有統(tǒng)計學(xué)差異的IFN-γ(圖4)和IL-2(圖5)免疫應(yīng)答，7 d后應(yīng)答水平繼續(xù)升高。

圖4 小鼠肌肉免疫CTN181-3株后的IFN-γ水平動態(tài)Fig.4 IFN-γ levels in mice after immunized with CTN181-3 strain

圖5 小鼠肌肉免疫CTN181-3株后的IL-2水平動態(tài)Fig.5 IL-2 levels in mice after immunized with CTN181-3 strain

2.3 CTN181-3株的保護(hù)效果

2.3.1 暴露前免疫保護(hù)效果 CTN181-3株通過口腔和肌肉兩種免疫途徑，僅免疫1次，28 d后小鼠經(jīng)腦內(nèi)，金黃地鼠經(jīng)肌肉CVS攻擊，兩種免疫途徑小鼠的保護(hù)率均為100%，金黃地鼠的保護(hù)率分別為67%和100%，口腔免疫的保護(hù)力較低，可能與金黃地鼠體重比小鼠大得多而接種量相同有關(guān)，結(jié)果見表3。

表3 CTN181-3對小鼠和金黃地鼠不同免疫途徑的保護(hù)力Tab.3 Protective effects of CTN181-3 on different pathways in mice and golden hamster

2.3.2 暴露后免疫保護(hù)效果 CVS病毒攻擊8周齡金黃地鼠后6 h，按不同分組進(jìn)行免疫，免疫后逐日觀察，記錄動物的發(fā)病死亡情況，到觀察期結(jié)束，分別計算各組動物的保護(hù)率。結(jié)果見表4。

表4 CTN181-3對金黃地鼠暴露后免疫的保護(hù)效果Tab.4 Protective effect of CTN181-3 strain in golden hamster by post-exposure treatment(PET)

為更直觀地表示金黃地鼠暴露后用不同疫苗免疫的保護(hù)情況，繪制存活率曲線，見圖6。

t/d圖6 金黃地鼠暴露后用不同疫苗免疫的保護(hù)率Fig.6 Survival rate of golden hamster with different vaccines after exposure to rabies virus

表4和圖6的結(jié)果顯示，暴露狂犬病毒后，對照組的金黃地鼠用PBS溶液免疫，在暴露后第10 d和第11 d全部死亡，保護(hù)率為0；減毒株CTN181-3在0 d免疫1次，其保護(hù)率即能達(dá)到50%，若在3 d再加強免疫1次保護(hù)率可上升到100%；滅活苗組分別在0 d、3 d、7 d和14 d各免疫1次，保護(hù)率僅為50%；滅活苗組在0 d時使用狂犬病免疫球蛋白，無論在暴露同側(cè)還是異側(cè)使用，暴露后的保護(hù)率均能到達(dá)100%。然而，值得注意的是，減毒株CTN181-3在0 d免疫1次的保護(hù)率與滅活苗免疫4次對動物的保護(hù)率相當(dāng)，可達(dá)50%。

3 討 論

CTN181-3株具有很好的免疫原性，小鼠或金黃地鼠無論是口腔或肌肉免疫1針后，14 d的中和抗體陽轉(zhuǎn)率均達(dá)100%，GMT達(dá)5 IU/mL以上，28 d后抗體水平升高達(dá)10 IU/mL以上，并對CVS固定毒的攻擊保護(hù)率為67%～100%。

除了體液免疫，細(xì)胞免疫也是重要的免疫屏障。接種狂犬病疫苗后細(xì)胞因子的釋放，已經(jīng)在小鼠和人類中研究過[16-17]。CTN181-3株表現(xiàn)出明顯的誘發(fā)細(xì)胞免疫的能力，用CTN181-3株口腔免疫或肌肉免疫小鼠后7 d后開始有統(tǒng)計學(xué)差異的IFN-γ和IL-2產(chǎn)生，說明疫苗免疫后早期(7 d)以IFN-γ和IL-2為代表的細(xì)胞免疫即已開始介入免疫保護(hù)效應(yīng)。在接種 SAG2 的狐貍中也觀察到減毒株誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫現(xiàn)象。用 SAG2 免疫狐貍后，IFN-γ隨之增加[18]。有研究描述了接種狂犬病疫苗早期后在體內(nèi)誘導(dǎo)出大量IFN-γ，提示細(xì)胞因子作為生物體的一線防御機(jī)制發(fā)揮重要的抗病毒作用[19]。Barkhouse等的一項研究表明，IFN-γ的表達(dá)不僅可以提高疫苗的安全性，還可以提高暴露前后的有效性[20]。IL-2作為T細(xì)胞生長因子可誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，也可促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞活化增殖，從而參與狂犬病毒激發(fā)的細(xì)胞免疫和體液免疫[21]。

也許是 IFN-γ和IL-2的作用，CTN181-3株在暴露狂犬病毒后表現(xiàn)出顯著的保護(hù)效果。金黃地鼠暴露后用CTN181-3 于0 d免疫1次，保護(hù)率就能達(dá)到50%，這相當(dāng)于滅活苗免疫3次的保護(hù)率；若在第3 d再加強免疫1次，保護(hù)率可上升到100%，與滅活疫苗和免疫球蛋白聯(lián)合使用的效果相同。該結(jié)果與湯重發(fā)等[22]的研究結(jié)果一致，即以CTN181-3株免疫1次的保護(hù)率能到77%，免疫2次可達(dá)100%。

近年來，關(guān)于狂犬病毒減毒株的安全性和有效性的動物實驗報道較多，認(rèn)為這種高減毒活疫苗有望發(fā)展成為人用的暴露后免疫疫苗，這或許將是狂犬病疫苗發(fā)展的新方向。

利益沖突：無

引用本文格式：石磊泰，鄒劍，李玉華，等. 減毒狂犬病病毒CTN181-3株免疫學(xué)特性研究[J].中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(7)：602-606. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.088