江西地區(qū)嚙齒動(dòng)物中溫州病毒的檢測及病毒基因特征分析

劉師文，李健雄，施 勇，熊 英，吳楊博文，龔 甜

溫州病毒(Wenzhou mammarenavirus，WENV)是2015年首次報(bào)道的沙粒病毒新種[1]。沙粒病毒屬沙粒病毒科，是有包膜的負(fù)鏈RNA病毒，基因組分大(L)、小(S)2個(gè)節(jié)段，大小分別約7.2 kb、3.5 kb。L 段編碼病毒 RNA 依賴性 RNA 聚合酶 (RdRp) 和作為基質(zhì)蛋白的鋅結(jié)合蛋白(Z)， S 區(qū)段編碼病毒糖蛋白前體 (GPC) 和核蛋白 (NP)[2]。沙粒病毒科成員分為4個(gè)屬，與人類關(guān)系最密切的為哺乳動(dòng)物沙粒病毒屬(mammarenavirus，MARV)，嚙齒動(dòng)物是該屬病毒最主要的宿主，嚙齒動(dòng)物感染 MARV 一般不表現(xiàn)任何臨床癥狀，人直接或間接接觸鼠類( 包括排泄物) 感染病毒而發(fā)病。人類阿根廷出血熱、拉薩熱、玻利維亞出血熱等嚴(yán)重的發(fā)熱出血相關(guān)疾病都由該屬病毒引起[3]。MARV屬中發(fā)現(xiàn)的新病毒可能具有嚴(yán)重的致病性和致死性，因此，需要探究其生物學(xué)特征、地理分布情況和感染人的證據(jù)，提高對它們的監(jiān)測和診斷能力，以降低潛在的人獸共患病風(fēng)險(xiǎn)。

WENV作為MARV屬新種于2015年首次被報(bào)道，隨后中國云南、海南、山東、廣東、新疆、湖南以及東南亞等地區(qū)有發(fā)現(xiàn)[4-10]，其他地方暫未見有關(guān)報(bào)道。江西地區(qū)嚙齒動(dòng)物物種豐富，是人獸共患病的熱點(diǎn)地區(qū)，由嚙齒動(dòng)物引起的腎綜合征出熱發(fā)病率最高達(dá)21.69/10萬。因此，了解新發(fā)病毒在江西嚙齒動(dòng)物中的流行對于準(zhǔn)確預(yù)測本地潛在人獸共患病的風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要。高安市、安義縣是江西省腎綜合征出血熱宿主動(dòng)物監(jiān)測點(diǎn)，為了解該新病毒是否在江西地區(qū)有流行，本研究對江西省高安市、安義縣采集的嚙齒動(dòng)物肺標(biāo)本進(jìn)行WENV檢測及病毒基因組測序分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 組織破碎儀(Next Advance)、96道核酸提取儀(QIAGEN)、PCR儀(eppendorf)、凝膠成像儀(BIO-RAD)、基因測序儀Ion Gene Studio S5(Thermo Fisher)，PrimScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 (TAKARA)、GoTaq○RGreen Master Mix(Promega)、NuGEN Ovation○RRNA-Seq System V2(NuGEN)、文庫制備及測序上機(jī)試劑(Thermo Fisher)

1.2 樣本處理 收集2021年江西高安市、安義縣兩地室內(nèi)和室外采集的鼠肺樣本。取適量鼠肺至1.5 mL離心管中，加入無菌1×PBS溶液，蓋好離心管蓋放至組織破碎儀粉碎2 min，制成10%鼠肺樣本懸液，懸液經(jīng)6 000 g，4 ℃離心10 min后取上清液提取核酸。核酸提取按照QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒說明進(jìn)行。

1.3 巢式PCR檢測WENV核酸 參照文獻(xiàn)[1]，合成兩對擴(kuò)增WENV部分L基因引物，第1次RT-PCR擴(kuò)增采用第1對引物和PrimScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2試劑。第2次PCR以第1次擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，采用第2對引物和GoTaq○RGreen Master Mix試劑擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，目的產(chǎn)物大小610 bp。陽性PCR產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.4 病毒全基因組測序 選取一個(gè)WENV陽性樣本核酸，采用NuGEN Ovation○RRNA-Seq System V2試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、cDNA鏈合成、cDNA擴(kuò)增回收；采用Ion XpressTMPlus Reagents Kit、Ion XpressTMPlus Fragment Library Kit、Ion 520TM&Ion 530TMOT2 Reagents等試劑進(jìn)行文庫構(gòu)建和測序微球(Ion SphereTMParticles)模板的制備，文庫讀長約200 bp。將測序微球加入到Ion 530TM芯片，在Ion Gene Studio S5 平臺(tái)進(jìn)行測序。

1.5 基因序列分析 選擇WENV Rn366株作為參考序列，采用CLC軟件(CLC Genomics Workbench 21)對測序儀原始數(shù)據(jù)進(jìn)行比對、拼接獲得待測毒株的基因組序列。下載GenBank WENV參考序列(表1)，用MEGA X軟件對基因序列進(jìn)行比對分析，以最大似然法進(jìn)行分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(bootstrap值：1 000)。

表1 WENV參考株序列信息Tab.1 Sequence information of reference strains

2 結(jié) 果

2.1 WENV核酸檢測 共收集7種嚙齒動(dòng)物肺組織樣本164份，其中黑線姬鼠66份、黃毛鼠39份、小家鼠21份、黃胸鼠15份、褐家鼠9份、社鼠7份、鼩鼱7份。按地區(qū)安義縣102份、高安市62份。共檢出WENV核酸陽性3份(1.83%，3/164)，巢式PCR電泳圖見圖1，陽性樣本均來自高安地區(qū)黃毛鼠(7.69%，3/39)。

注：泳道1-5分別為：Marker、JXGAW45/2021、JXGAW46/2021、JXGAW56/2021、陰性對照。圖1 巢式PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of nested PCR products

2.2 3株WENV部分L基因測序 對JXGAW45/2021、JXGAW46/2021、JXGAW56/2021這3個(gè)陽性樣本進(jìn)行了部分L基因測序，3株病毒之間核苷酸序列(長度566 bp)同源性93.66%～98.50%，氨基酸序列同源性95.21%～100%。與GenBank中其他14株WENV部分L基因核苷酸同源性為81.60%～88.98%，均與9-24株同源性最高，分別為88.98%、88.15%、88.98%。系統(tǒng)進(jìn)化分析見圖2，江西WENV在部分L基因系統(tǒng)進(jìn)化樹中獨(dú)立分支。

WENV全S、L基因系統(tǒng)進(jìn)化分析見圖2、3，本研究獲得的序列用黑三角形圖標(biāo)。

圖2 L片段部分基因系統(tǒng)進(jìn)化分析(566 bp)Fig.2 Phylogenetic analysis of WENV based on partial L segment

2.3 JXGAW45/2021株全基因組序列分析 選取JXGAW45/2021進(jìn)行NGS測序，獲得2.0G的測序數(shù)據(jù)，經(jīng)比對、拼接獲得基因全序，其中S、L分別含3 429、7 145個(gè)核苷酸，序列已上傳GenBank，登錄號(hào)分別為：OL738673、OL738674。

S基因存在兩個(gè)相對的開放閱讀編碼區(qū)，分別編碼：GP(ORF：132～1 610)共492個(gè)氨基酸，NP(ORF：1 673～3 376)共567個(gè)氨基酸，2個(gè)開放閱讀框中間存在63個(gè)核苷酸間隔序列。L基因存在兩個(gè)相對的開放閱讀編碼區(qū)，分別編碼：Z(ORF：53-328)共91個(gè)氨基酸，RdRp共2 228個(gè)氨基酸(ORF：443-7129)，2個(gè)開放閱讀框中間存在115個(gè)核苷酸間隔序列。

核苷酸全序列同源性比較結(jié)果見表2，JXGAW45/2021與其他WENV核苷酸全序列同源性為82.58%～85.75%，氨基酸同源性為88.76%～96.83%。S、L全序核苷酸與浙江分離株Rn-242株同源性最高，分別為85.75%、84.95%。和其他種沙粒病毒相比，與LORV核苷酸同源性最高分別為68.72%、62.80%。與LASV的糖蛋白氨基酸同源性達(dá)72.06%。WENV全S、L基因系統(tǒng)進(jìn)化分析見圖3和圖4。

表2 JXGAW45/2021與其他病毒同源性比較Tab.2 Genome or ORF comparisons between JXGAW45/2021and other mammarenacirues

圖3 WENV全S基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of WENV based on complete S segment

圖4 WENV全L基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of WENV based on complete L segment

3 討 論

2015年在浙江省首次發(fā)現(xiàn)WENV以后，至今在中國6個(gè)省份以及東南亞3個(gè)國家相繼被發(fā)現(xiàn)，提示該病毒地理分布廣泛。多數(shù)沙粒病毒的宿主動(dòng)物僅一種，而WENV宿主廣泛，如褐家鼠、小家屬、黃胸鼠、黃毛鼠、社鼠等[4-11]。WENV與廣泛分布的不同物種的嚙齒動(dòng)物(通常在人類居住地和近郊棲息地中發(fā)現(xiàn))的關(guān)聯(lián)說明了廣泛的人獸共患病傳播的可能性。江西地區(qū)尚無WENV相關(guān)病毒的報(bào)道。本研究調(diào)查了江西省高安市和安義縣兩地野生嚙齒動(dòng)物的WENV感染情況，結(jié)果表明，7種嚙齒動(dòng)物中僅黃毛鼠存在WENV的核酸，總檢出率1.83%，黃毛鼠檢出率7.69%。所有WENV陽性樣本均來自從高安地區(qū)。廣州和云南的嚙齒動(dòng)物調(diào)查研究結(jié)果表明WENV的分布可能僅限于當(dāng)?shù)匦∶娣e范圍[11,4]。江西地區(qū)是否僅高安地區(qū)存在WENV，后期還需要進(jìn)行更大范圍的調(diào)查。在江西，黃毛鼠是優(yōu)勢物種之一，與人類共生，這表明WENV溢出的風(fēng)險(xiǎn)很高。建立特異性強(qiáng)的WENV血清學(xué)試驗(yàn)對比流行地區(qū)和非流行地區(qū)人群抗體水平，對于判斷WENV是否作為人類病原體非常必要。

病毒分類委員會(huì)規(guī)定同種沙粒病毒的S、L基因核苷酸同源性需分別大于80%、76%。本研究通過高通量測序獲得GAW45/2021的全基因組序列，S、L片段核苷酸序列與WENV參考株核苷酸同源性均大于80%，與其他種沙粒病毒核苷酸同源性小于70%，屬WENV種。與WENV參考株相比，GAW45/2021 S基因變異在14%以上、L基因變異在15%以上；部分L基因及S、L全基因系統(tǒng)進(jìn)化分析均顯示GAW45/2021 在WENV進(jìn)化樹中程獨(dú)立分支，為WENV新的變異株。部分L基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分支結(jié)構(gòu)與L全基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分支結(jié)構(gòu)不同，顯示了WENV系統(tǒng)進(jìn)化的復(fù)雜性，提示W(wǎng)ENV系統(tǒng)進(jìn)化時(shí)分析應(yīng)盡可能采用全基因序列。

一項(xiàng)WENV感染對鼠嚙齒動(dòng)物發(fā)育的潛在致畸作用研究表明，WENV感染可影響自然宿主生理和影響發(fā)育過程[12]。北京和山東地區(qū)的健康人群血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全人群WENV抗體陽性率為1.5%～4.6%，表明WENV在人群中可能存在散發(fā)感染[13]。WENV緬甸變異株核酸在呼吸道感染病例中被檢出，因病例數(shù)量有限或混合感染，WENV與疾病的因果關(guān)系還需進(jìn)一步確定[10]。WENV對動(dòng)物和人疾病關(guān)聯(lián)的報(bào)道都顯示了其可能的潛在致病性。

江西地區(qū)WENV的發(fā)現(xiàn)豐富了WENV的地理分布，證實(shí)了江西人群存在潛在的WENV感染風(fēng)險(xiǎn)；病毒全基因組序列信息的獲得，有助于更好地了解WENV的起源和進(jìn)化模式，也為建立該病毒實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突：無

引用本文格式：劉師文，李健雄，施勇，等. 江西地區(qū)嚙齒動(dòng)物中溫州病毒的檢測及病毒基因特征分析[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(7)：597-601. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.078