江西地區(qū)嚙齒動物中溫州病毒的檢測及病毒基因特征分析

劉師文，李健雄，施 勇，熊 英，吳楊博文，龔 甜

溫州病毒(Wenzhou mammarenavirus，WENV)是2015年首次報道的沙粒病毒新種[1]。沙粒病毒屬沙粒病毒科，是有包膜的負鏈RNA病毒，基因組分大(L)、小(S)2個節(jié)段，大小分別約7.2 kb、3.5 kb。L 段編碼病毒 RNA 依賴性 RNA 聚合酶 (RdRp) 和作為基質蛋白的鋅結合蛋白(Z)， S 區(qū)段編碼病毒糖蛋白前體 (GPC) 和核蛋白 (NP)[2]。沙粒病毒科成員分為4個屬，與人類關系最密切的為哺乳動物沙粒病毒屬(mammarenavirus，MARV)，嚙齒動物是該屬病毒最主要的宿主，嚙齒動物感染 MARV 一般不表現(xiàn)任何臨床癥狀，人直接或間接接觸鼠類( 包括排泄物) 感染病毒而發(fā)病。人類阿根廷出血熱、拉薩熱、玻利維亞出血熱等嚴重的發(fā)熱出血相關疾病都由該屬病毒引起[3]。MARV屬中發(fā)現(xiàn)的新病毒可能具有嚴重的致病性和致死性，因此，需要探究其生物學特征、地理分布情況和感染人的證據(jù)，提高對它們的監(jiān)測和診斷能力，以降低潛在的人獸共患病風險。

WENV作為MARV屬新種于2015年首次被報道，隨后中國云南、海南、山東、廣東、新疆、湖南以及東南亞等地區(qū)有發(fā)現(xiàn)[4-10]，其他地方暫未見有關報道。江西地區(qū)嚙齒動物物種豐富，是人獸共患病的熱點地區(qū)，由嚙齒動物引起的腎綜合征出熱發(fā)病率最高達21.69/10萬。因此，了解新發(fā)病毒在江西嚙齒動物中的流行對于準確預測本地潛在人獸共患病的風險至關重要。高安市、安義縣是江西省腎綜合征出血熱宿主動物監(jiān)測點，為了解該新病毒是否在江西地區(qū)有流行，本研究對江西省高安市、安義縣采集的嚙齒動物肺標本進行WENV檢測及病毒基因組測序分析，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 組織破碎儀(Next Advance)、96道核酸提取儀(QIAGEN)、PCR儀(eppendorf)、凝膠成像儀(BIO-RAD)、基因測序儀Ion Gene Studio S5(Thermo Fisher)，PrimScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 (TAKARA)、GoTaq○RGreen Master Mix(Promega)、NuGEN Ovation○RRNA-Seq System V2(NuGEN)、文庫制備及測序上機試劑(Thermo Fisher)

1.2 樣本處理 收集2021年江西高安市、安義縣兩地室內和室外采集的鼠肺樣本。取適量鼠肺至1.5 mL離心管中，加入無菌1×PBS溶液，蓋好離心管蓋放至組織破碎儀粉碎2 min，制成10%鼠肺樣本懸液，懸液經6 000 g，4 ℃離心10 min后取上清液提取核酸。核酸提取按照QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒說明進行。

1.3 巢式PCR檢測WENV核酸 參照文獻[1]，合成兩對擴增WENV部分L基因引物，第1次RT-PCR擴增采用第1對引物和PrimScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2試劑。第2次PCR以第1次擴增產物為模板，采用第2對引物和GoTaq○RGreen Master Mix試劑擴增，產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，目的產物大小610 bp。陽性PCR產物送上海生物工程有限公司進行測序。

1.4 病毒全基因組測序 選取一個WENV陽性樣本核酸，采用NuGEN Ovation○RRNA-Seq System V2試劑進行逆轉錄、cDNA鏈合成、cDNA擴增回收；采用Ion XpressTMPlus Reagents Kit、Ion XpressTMPlus Fragment Library Kit、Ion 520TM&Ion 530TMOT2 Reagents等試劑進行文庫構建和測序微球(Ion SphereTMParticles)模板的制備，文庫讀長約200 bp。將測序微球加入到Ion 530TM芯片，在Ion Gene Studio S5 平臺進行測序。

1.5 基因序列分析 選擇WENV Rn366株作為參考序列，采用CLC軟件(CLC Genomics Workbench 21)對測序儀原始數(shù)據(jù)進行比對、拼接獲得待測毒株的基因組序列。下載GenBank WENV參考序列(表1)，用MEGA X軟件對基因序列進行比對分析，以最大似然法進行分析構建系統(tǒng)進化樹(bootstrap值：1 000)。

表1 WENV參考株序列信息Tab.1 Sequence information of reference strains

2 結 果

2.1 WENV核酸檢測 共收集7種嚙齒動物肺組織樣本164份，其中黑線姬鼠66份、黃毛鼠39份、小家鼠21份、黃胸鼠15份、褐家鼠9份、社鼠7份、鼩鼱7份。按地區(qū)安義縣102份、高安市62份。共檢出WENV核酸陽性3份(1.83%，3/164)，巢式PCR電泳圖見圖1，陽性樣本均來自高安地區(qū)黃毛鼠(7.69%，3/39)。

注：泳道1-5分別為：Marker、JXGAW45/2021、JXGAW46/2021、JXGAW56/2021、陰性對照。圖1 巢式PCR產物凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of nested PCR products

2.2 3株WENV部分L基因測序 對JXGAW45/2021、JXGAW46/2021、JXGAW56/2021這3個陽性樣本進行了部分L基因測序，3株病毒之間核苷酸序列(長度566 bp)同源性93.66%～98.50%，氨基酸序列同源性95.21%～100%。與GenBank中其他14株WENV部分L基因核苷酸同源性為81.60%～88.98%，均與9-24株同源性最高，分別為88.98%、88.15%、88.98%。系統(tǒng)進化分析見圖2，江西WENV在部分L基因系統(tǒng)進化樹中獨立分支。

WENV全S、L基因系統(tǒng)進化分析見圖2、3，本研究獲得的序列用黑三角形圖標。

圖2 L片段部分基因系統(tǒng)進化分析(566 bp)Fig.2 Phylogenetic analysis of WENV based on partial L segment

2.3 JXGAW45/2021株全基因組序列分析 選取JXGAW45/2021進行NGS測序，獲得2.0G的測序數(shù)據(jù)，經比對、拼接獲得基因全序，其中S、L分別含3 429、7 145個核苷酸，序列已上傳GenBank，登錄號分別為：OL738673、OL738674。

S基因存在兩個相對的開放閱讀編碼區(qū)，分別編碼：GP(ORF：132～1 610)共492個氨基酸，NP(ORF：1 673～3 376)共567個氨基酸，2個開放閱讀框中間存在63個核苷酸間隔序列。L基因存在兩個相對的開放閱讀編碼區(qū)，分別編碼：Z(ORF：53-328)共91個氨基酸，RdRp共2 228個氨基酸(ORF：443-7129)，2個開放閱讀框中間存在115個核苷酸間隔序列。

核苷酸全序列同源性比較結果見表2，JXGAW45/2021與其他WENV核苷酸全序列同源性為82.58%～85.75%，氨基酸同源性為88.76%～96.83%。S、L全序核苷酸與浙江分離株Rn-242株同源性最高，分別為85.75%、84.95%。和其他種沙粒病毒相比，與LORV核苷酸同源性最高分別為68.72%、62.80%。與LASV的糖蛋白氨基酸同源性達72.06%。WENV全S、L基因系統(tǒng)進化分析見圖3和圖4。

表2 JXGAW45/2021與其他病毒同源性比較Tab.2 Genome or ORF comparisons between JXGAW45/2021and other mammarenacirues

圖3 WENV全S基因系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of WENV based on complete S segment

圖4 WENV全L基因系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of WENV based on complete L segment

3 討 論

2015年在浙江省首次發(fā)現(xiàn)WENV以后，至今在中國6個省份以及東南亞3個國家相繼被發(fā)現(xiàn)，提示該病毒地理分布廣泛。多數(shù)沙粒病毒的宿主動物僅一種，而WENV宿主廣泛，如褐家鼠、小家屬、黃胸鼠、黃毛鼠、社鼠等[4-11]。WENV與廣泛分布的不同物種的嚙齒動物(通常在人類居住地和近郊棲息地中發(fā)現(xiàn))的關聯(lián)說明了廣泛的人獸共患病傳播的可能性。江西地區(qū)尚無WENV相關病毒的報道。本研究調查了江西省高安市和安義縣兩地野生嚙齒動物的WENV感染情況，結果表明，7種嚙齒動物中僅黃毛鼠存在WENV的核酸，總檢出率1.83%，黃毛鼠檢出率7.69%。所有WENV陽性樣本均來自從高安地區(qū)。廣州和云南的嚙齒動物調查研究結果表明WENV的分布可能僅限于當?shù)匦∶娣e范圍[11,4]。江西地區(qū)是否僅高安地區(qū)存在WENV，后期還需要進行更大范圍的調查。在江西，黃毛鼠是優(yōu)勢物種之一，與人類共生，這表明WENV溢出的風險很高。建立特異性強的WENV血清學試驗對比流行地區(qū)和非流行地區(qū)人群抗體水平，對于判斷WENV是否作為人類病原體非常必要。

病毒分類委員會規(guī)定同種沙粒病毒的S、L基因核苷酸同源性需分別大于80%、76%。本研究通過高通量測序獲得GAW45/2021的全基因組序列，S、L片段核苷酸序列與WENV參考株核苷酸同源性均大于80%，與其他種沙粒病毒核苷酸同源性小于70%，屬WENV種。與WENV參考株相比，GAW45/2021 S基因變異在14%以上、L基因變異在15%以上；部分L基因及S、L全基因系統(tǒng)進化分析均顯示GAW45/2021 在WENV進化樹中程獨立分支，為WENV新的變異株。部分L基因系統(tǒng)進化樹分支結構與L全基因系統(tǒng)進化樹分支結構不同，顯示了WENV系統(tǒng)進化的復雜性，提示WENV系統(tǒng)進化時分析應盡可能采用全基因序列。

一項WENV感染對鼠嚙齒動物發(fā)育的潛在致畸作用研究表明，WENV感染可影響自然宿主生理和影響發(fā)育過程[12]。北京和山東地區(qū)的健康人群血清學調查發(fā)現(xiàn)，全人群WENV抗體陽性率為1.5%～4.6%，表明WENV在人群中可能存在散發(fā)感染[13]。WENV緬甸變異株核酸在呼吸道感染病例中被檢出，因病例數(shù)量有限或混合感染，WENV與疾病的因果關系還需進一步確定[10]。WENV對動物和人疾病關聯(lián)的報道都顯示了其可能的潛在致病性。

江西地區(qū)WENV的發(fā)現(xiàn)豐富了WENV的地理分布，證實了江西人群存在潛在的WENV感染風險；病毒全基因組序列信息的獲得，有助于更好地了解WENV的起源和進化模式，也為建立該病毒實驗室監(jiān)測技術奠定了基礎。

利益沖突：無

引用本文格式：劉師文，李健雄，施勇，等. 江西地區(qū)嚙齒動物中溫州病毒的檢測及病毒基因特征分析[J].中國人獸共患病學報，2022，38(7)：597-601. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.078