牛種布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立

馬曉菁，葉 鋒，2，劉麗婭，谷文喜，鐘 旗，易新萍

布魯氏菌病(簡(jiǎn)稱“布病”)是由布魯氏菌引起的人獸共患傳染病，該病主要造成家畜生殖系統(tǒng)損害。人可通過(guò)密切接觸患病動(dòng)物及動(dòng)物制品從而感染布病[1]。近十年來(lái)，我國(guó)布病流行形勢(shì)較為嚴(yán)峻，畜間和人間布病感染率維持在較高水平，同時(shí)人間布病感染趨勢(shì)也由主要的職業(yè)接觸感染向非職業(yè)的食源性感染轉(zhuǎn)變[2]。因此，牛場(chǎng)布病凈化，是預(yù)防和控制布病的重要部分。

布病是動(dòng)物源性疾病，通過(guò)控制家畜布病從而降低人間布病是一種低成本、高效益的防控措施[3]。疫苗免疫是我國(guó)家畜布病防控的重要策略，布病流行區(qū)主要采取以疫苗接種為主、檢疫-撲殺為輔的防控策略。在布魯氏菌疫苗的使用中，牛種布魯氏菌A19疫苗最為有效且使用較為廣泛，主要用于牛的免疫[4]。A19疫苗株外膜的脂多糖(LPS)含有O-側(cè)鏈，可以持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，從而使機(jī)體產(chǎn)生一定保護(hù)力。但疫苗免疫產(chǎn)生抗體和野毒感染產(chǎn)生抗體都是特異性抗體，無(wú)法通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)區(qū)分。易新萍等[6-7]應(yīng)用同源重組的方法敲除布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)中VirB12基因，獲得牛布魯氏菌A19缺失VirB12基因的突變株，即具有分子診斷標(biāo)記的A19-△VirB12標(biāo)記疫苗株。該標(biāo)記疫苗株免疫保護(hù)力與親本株A19無(wú)顯著差異，但毒力弱于親本株A19，已于2021年正式上市推廣[8]。本研究以布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)VirB8基因設(shè)計(jì)引物鑒別布魯氏菌屬，并以牛布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗缺失的VirB12基因序列作為診斷標(biāo)記，建立了區(qū)分牛布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗株與自然感染株的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，為今后快速、準(zhǔn)確鑒別診斷分子標(biāo)記疫苗免疫牛與野毒感染牛提供了快速、可靠的診斷方法。

1 材料與方法

1.1 菌種 實(shí)驗(yàn)中涉及的基因組DNA包括：牛種布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗株、牛種布魯氏菌A19疫苗株、羊種布魯氏菌M5疫苗株、豬種布魯氏菌S2疫苗株、大腸桿菌、沙門氏菌，均由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。

1.2 儀器與試劑 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applide Biosystems QuantStudio 5)，普通PCR擴(kuò)增儀(BIO-RAD T100TM Thermal Cycler)。熒光定量PCR試劑TaqProbe 2×qPCR Mix(寶生物工程(大連)有限公司)；普通PCR Mix(北京莊盟國(guó)際生物基因有限公司)；克隆載體pMD18-T(TaKaRa 公司)；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒(TaKaRa 公司)。

1.3 熒光定量PCR引物及探針 以布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)VirB8基因序列及VirB12基因序列，分別設(shè)計(jì)探針及引物(表1)，引物及探針均委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

表1 熒光定量PCR引物及探針序列Tab.1 Sequence of primers and probes of duplex fluorescence PCR

1.4 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)布魯氏菌VirB12基因序列(GenBank ID：LT671513.1)以及VirB8基因序列(GenBank ID: CP030752.1)，應(yīng)用軟件Primer5.0設(shè)計(jì)引物，分別擴(kuò)增VirB8基因片段，上游引物VirB8-F:ATGTTTGGACGCAAACAATCTCC，VirB8-R:TGCACAA CTCCCATTTCTGGAT；以及VirB12基因片段上游引物VirB12-F：GTCAGCTTCTC GCCAACACAAG，下游引物VirB12-R：CGTCGGAACCGCTCTATAGGTC。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系和條件：25 μL體系，其中PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物(1010μmol/L)各1 μL，牛種布魯氏菌A19疫苗株基因組DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收后連接pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選陽(yáng)性克隆后提取質(zhì)粒測(cè)定濃度。

1.5 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增 優(yōu)化PCR反應(yīng)體系中各引物與探針濃度，確定最佳擴(kuò)增條件。熒光定量PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件：20 μL體系，其中TaqProbe 2×qPCR Mix 10 μL，引物VirB8-RF(10 μmol/L)及VirB8-RR(10 μmol/L)各0.6 μL，VirB12-RF(10 μmol/L)以及VirB12-RR(10 μmol/L)各0.2 μL，探針VirB8-P (10 μmol/L)和VirB12-P(10 μmol/L)各0.2 μL，待檢DNA樣品2 μL(50～200 ng)，ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃ 3 s，64 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.6 雙重實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè) 分別以牛種布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗株、牛種布魯氏菌A19疫苗株、羊種布魯氏菌M5疫苗株以及豬種布魯氏菌S2疫苗株、大腸桿菌、沙門氏菌基因組DNA為模板，進(jìn)行Realtime-PCR擴(kuò)增，評(píng)價(jià)該方法特異性。

1.7 雙重實(shí)時(shí)熒光PCR敏感性檢測(cè) 分光光度儀測(cè)定布魯氏菌VirB8基因和VirB12基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒質(zhì)量濃度，質(zhì)粒濃度分別為338.6 ng/μL及240 ng/μL，載體片段與VirB8基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度共為5 888 bp，載體片段與VirB12基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度共為3 423 bp。利用公式(1)，分別計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)。10倍系列稀釋VirB12基因和VirB8基因重組質(zhì)粒，分別以1010、109、108、107、106、105、104、103、102、101以及100copies/mL為模板，進(jìn)行Realtime-PCR擴(kuò)增，每個(gè)梯度設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，評(píng)價(jià)該方法的敏感性。

拷貝數(shù)(copies/L)=[6.02×1023×質(zhì)粒質(zhì)量濃度(ng/mL)×10-9]/[DNA長(zhǎng)度(bp)× 660](1)

2 結(jié) 果

2.1 敏感性擴(kuò)增及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 布魯氏菌VirB8基因和VirB12基因重組質(zhì)粒濃度分別為1.24×1011copies/μL和3.78×1010copies/μL，將重組質(zhì)粒稀釋至1010～100copies/μL進(jìn)行Realtime-PCR擴(kuò)增，結(jié)果可見(jiàn)VirB8基因重組質(zhì)粒靈敏度為102copies/μL(圖1)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.809 3，截距為44.284，相關(guān)系數(shù)為R2=0.996(圖2)，VirB12基因重組質(zhì)粒靈敏度為103copies/μL(圖3)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-4.346 3，截距為50.025 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.997(圖4)，結(jié)果表明已建立的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法誤差較小。

圖1 不同拷貝數(shù)VirB8標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增圖Realtime-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Real-time PCR results of VirB8 standard plasmid with different copies

圖2 VirB8基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒不同拷貝數(shù)Realtime-PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Realtime PCR amplification standard curve of VirB8 standard plasmid with different copies

圖3 VirB12基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒不同拷貝數(shù)Realtime-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Real-time PCR results of VirB12 Standard plasmid with different copies

圖4 VirB12基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒不同拷貝數(shù)Realtime-PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Real-time PCR amplification standard curve of VirB12 standard plasmid with different copies

2.2 特異性擴(kuò)增結(jié)果 以牛種布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗株、牛種布魯氏菌A19疫苗株、羊種布魯氏菌M5疫苗株、豬種布魯氏菌S2疫苗株、大腸桿菌和沙門氏菌基因組DNA為模板，滅菌水為空白對(duì)照，進(jìn)行布魯氏菌Realtime-PCR擴(kuò)增，結(jié)果可見(jiàn)，牛種布魯氏菌A19疫苗株、羊種布魯氏菌M5疫苗株以及豬種布魯氏菌S2疫苗株基因組DNA出現(xiàn)VirB8基因及VirB12基因兩條擴(kuò)增曲線，并獲得相應(yīng)Ct值(表2)，牛種布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗株基因組DNA僅VirB8基因擴(kuò)增獲得擴(kuò)增曲線，Ct值為29.831，大腸桿菌、沙門氏菌基因組DNA與滅菌水均無(wú)擴(kuò)增曲線，為陰性(圖5)，結(jié)果表明雙重實(shí)時(shí)熒光PCR具有良好的特異性。

表2 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增Ct值Tab.2 Ct values of dual real-time PCR

1-2：羊種布魯氏菌M5疫苗株基因組DNA；3-4：牛種布魯氏菌A19疫苗株基因組DNA；5-6：豬種布魯氏菌S2疫苗株基因組DNA；7：牛種布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗株基因組DNA8：大腸桿菌基因組DNA；9：沙門氏菌基因組DNA；10：滅菌水 圖5 雙重?zé)晒舛縋CR特異性擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Specific amplification results of duplex realtime-PCR

3 討 論

我國(guó)是畜牧業(yè)大國(guó)，近年來(lái)布魯氏菌病流行形勢(shì)仍較為嚴(yán)峻，不僅對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展造成影響，同時(shí)危害公共衛(wèi)生安全。疫苗免疫在家畜布病防控和根除過(guò)程中具有重要的意義，尤其在布病流行較為嚴(yán)重的地區(qū)[9]。2016年我國(guó)出臺(tái)《布魯氏菌病防治計(jì)劃(2016-2020年)》，其中明確在全國(guó)范圍內(nèi)，家畜布病防治實(shí)行區(qū)域化管理，采取以免疫接種、監(jiān)測(cè)凈化、風(fēng)險(xiǎn)防范等為主的防治策略[10]。

目前布病防控仍以布魯氏菌弱毒活疫苗為主[11]。我國(guó)生產(chǎn)的布魯氏菌弱毒活疫苗主要有豬種布魯氏菌S2、羊種布魯氏菌M5/M5-90株、牛種布魯氏菌A19株以及牛種布魯氏菌A19-△VirB12疫苗株[8]，其中牛種布魯氏菌A19疫苗株是19世紀(jì)50年代從蘇聯(lián)引進(jìn)的S19株。S19疫苗自19世紀(jì)30年代起便在全球范圍內(nèi)廣泛用于奶牛布病的預(yù)防，是世界公認(rèn)的奶牛布病防控的最有效疫苗[12-13]。A19疫苗株為光滑型布氏菌，免疫后能夠持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，但由于疫苗免疫產(chǎn)生抗體與布氏菌野毒感染產(chǎn)生抗體均為特異性抗體，因此用現(xiàn)有的血清學(xué)診斷方法無(wú)法將疫苗免疫抗體與自然感染抗體區(qū)分，影響疫苗免疫地區(qū)布病的檢疫及凈化。牛種布魯氏菌A19-△VirB12疫苗株是以我國(guó)A19疫苗為親本株，應(yīng)用同源重組技術(shù)敲除布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)中VirB12基因而構(gòu)建的突變株，該突變株具有與親本株相同的保護(hù)力，但毒力卻低于親本株，同時(shí)獲得了診斷標(biāo)記[6-7]。

布氏菌VirB8蛋白是IV型分泌系統(tǒng)中必備組成成分，也是早期分泌蛋白[14-15]。鐘旗[16]等建立了VirB8-PCR方法用于布氏菌屬檢測(cè)，具有良好的特異性。實(shí)時(shí)熒光PCR是通過(guò)加入特異性熒光探針，通過(guò)收集熒光信號(hào)進(jìn)行核酸實(shí)時(shí)檢測(cè)的技術(shù)，可準(zhǔn)確測(cè)定樣品中DNA含量，且無(wú)需進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，既縮短了檢測(cè)時(shí)間，又避免了擴(kuò)增產(chǎn)物的污染[17]。Winchell JM等[18]建立了區(qū)分羊種、牛種以及豬種布魯氏菌Realtime-PCR，將熒光定量PCR方法應(yīng)用于布魯氏菌檢測(cè)，并具有良好的特異性及敏感性。本研究依據(jù)布魯氏菌VirB8基因片段可用于布魯氏菌屬鑒別，及牛種布魯氏菌A19-△VirB12疫苗株無(wú)法擴(kuò)增獲得VirB12基因片段的特點(diǎn)，以布魯氏菌VirB8基因以及VirB12基因序列設(shè)計(jì)引物及探針建立鑒別牛種布魯氏菌A19-△VirB12疫苗株雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，該方法具有良好的特異性及敏感性，對(duì)VirB8基因和VirB12基因擴(kuò)增靈敏度分別為102copies/μL、103copies/μL，相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.996，R2=0.997，結(jié)果表明該方法誤差較小。該方法僅用于鑒別區(qū)分牛種布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗株與布魯氏菌野毒株，無(wú)法鑒別牛種布魯氏菌A19疫苗株與布魯氏菌野毒株。

綜上所述，本研究建立的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法具有良好的特異性、敏感性，在判定檢測(cè)樣品為布魯氏菌的同時(shí)鑒別區(qū)分布魯氏菌自然感染與A19-△VirB12疫苗株免疫，為今后布病的防控提供技術(shù)支撐。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：馬曉菁，葉鋒，劉麗婭，等. 牛種布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(7)：638-642. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.075