新冠病毒Nsp1蛋白結構與功能的生物信息學分析及原核表達

劉 玲，李 璟，范 蕾，宣 焱，杜 淼，張德玖，李卓禧，陳曉聰，楊婭男，徐本錦

2019年12月，由新冠病毒(SARS-CoV-2)引起的肺炎疫情在中國武漢暴發(fā)，患者表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、肺部磨玻璃樣病變等呼吸系統(tǒng)病變，或伴隨腹瀉等消化系統(tǒng)癥狀[1-2]。截止2021年9月28日，新冠肺炎累計確診病例已超過2.31億例，累計死亡病例超過475萬例[3]。新冠疫情的迅速蔓延給全球醫(yī)療體系帶來了嚴峻考驗。因此，揭示SARS-CoV-2的傳播機制及其關鍵蛋白的結構與功能成為遏制疫情的關鍵。

SARS-CoV-2屬β冠狀病毒，是一種包膜單股正鏈RNA病毒[4-5]。其基因組約30 kb，由一個5′帽子和5′非翻譯區(qū)(5′UTR)，10個開放讀碼框(open reading frames，ORFs)以及一個多聚腺苷酸化的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)組成[6]。ORF1a和ORF1b是SARS-CoV-2的2個主要ORF，約占病毒基因組的70%(圖1)。ORF1ab通過核糖體移碼被翻譯成多聚蛋白pp1a或pp1ab[7-8]，最后被加工成16種非結構蛋白(non-structural protein，NSPs)，NSPs具有多種酶活性，參與病毒RNA復制和轉錄調控。

Nsp1由ORF1a的5′ 末端編碼(圖1)，是感染細胞中產生的第1種冠狀病毒蛋白[9]，其主要功能是通過結合核糖體抑制宿主基因表達[10-11]。目前，國內外有關SARS-CoV-2 Nsp1蛋白結構與功能方面的研究報道仍然較少。本研究利用生信分析手段對SARS-CoV-2 Nsp1的性質、翻譯后修飾、結構域等進行了系統(tǒng)分析，還對其進行了同源性分析、進化分析及原核表達。本研究有助于揭示Nsp1在SARS-CoV-2侵染宿主細胞中的作用機制，同時有助于加快針對Nsp1的靶向藥物研發(fā)。

圖1 SARS-CoV-2基因組結構示意圖Fig.1 Schematic of SARS-CoV-2 genome organisation

1 材料與方法

1.1 材料 限制性核酸內切酶NdeI、XhoI購自NEB，pET-22b空質粒為本實驗室保存，DNA分子量標準購自寶生物(大連)，蛋白分子量標準、質粒提取、凝膠回收試劑盒以及感受態(tài)細胞購自全式金公司，其它生化試劑購自國藥。

1.2 載體構建及原核表達 用XhoI和NdeI對pET-22b空質粒和Nsp1基因同時雙酶切，回收酶切產物后將Nsp1基因與載體連接，轉化Top10感受態(tài)細胞并進行菌落PCR驗證。Nsp1蛋白的誘導表達步驟參照文獻執(zhí)行[12]。

1.3 生信分析 對Nsp1蛋白的理化特性、跨膜螺旋、親/疏水性等進行全面分析，相關分析網(wǎng)站如表1所示。Nsp1蛋白的多序列比對與系統(tǒng)進化分析參照文獻執(zhí)行[12]。

表1 生物信息分析網(wǎng)址Tab.1 Bioinformatics analysis websites

2 結 果

2.1 Nsp1的理化特性 Nsp1由180個氨基酸殘基構成(共20種)，相對分子量19.78 kDa，等電點5.36，負電性氨基酸殘基數(shù)(Asp + Glu)為27，正電性氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)為19，占比最高的殘基是甘氨酸(12.20%)，其次是纈氨酸和亮氨酸(均為11.70%)。見表2。Nsp1的分子式為C872H1383N247O270S4，原子總數(shù)為2 776，消光系數(shù)12 950(mol/L)-1cm-1。在哺乳動物細胞中的半衰期約30 h，在酵母中超過20 h，在E.coli內超過10 h。Nsp1的不穩(wěn)定指數(shù)約28.83，脂肪系數(shù)達89.72，平均親水性指數(shù)-0.378。

表2 新冠病毒Nsp1蛋白的氨基酸組成Tab.2 Amino acid composition of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

2.2 Nsp1蛋白跨膜結構分析 在線預測Nsp1的跨膜結構，結果顯示該蛋白無跨膜區(qū)(圖2)。

圖2 新冠病毒Nsp1蛋白的跨膜結構預測Fig.2 Transmembrane structure prediction of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

2.3 Nsp1的親水與疏水特性 結果表明，Nsp1的L88疏水特性最強，分值1.878，N162親水特性最強，分值-2.611；含有親水氨基酸112個，疏水氨基酸60個，平均親水指數(shù)-0.378，提示Nsp1是一個親水蛋白(圖3)。

圖3 新冠病毒Nsp1蛋白親水/疏水性分析Fig.3 Hydrophobic/hydrophobic analysis of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

2.4 Nsp1的磷酸化修飾預測 Nsp1存在12個磷酸化修飾位點，其中S17、S34、S40、S74、S100、S135、S142和S166為絲氨酸修飾位點，T151為蘇氨酸修飾位點，Y68、Y97和Y154為酪氨酸修飾位點(圖4、表3)。

圖4 新冠病毒Nsp1蛋白的磷酸化位點Fig.4 Phosphorylation sites of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

表3 Nsp1蛋白的磷酸化位點及對應的激酶Tab.3 Phosphorylation sites of Nsp1 protein and corresponding kinases

2.5 Nsp1蛋白亞細胞定位與信號肽預測 預測得知56.5%的Nsp1在細胞質，30.4%存在于細胞核，線粒體、分泌小泡和細胞骨架中各占4.3%。對N端前70個殘基進行分析后發(fā)現(xiàn)，Nsp1蛋白不含信號肽(圖5)。

圖5 新冠病毒Nsp1蛋白信號肽預測Fig.5 Prediction of SARS-CoV-2 Nsp1 protein signal peptide

2.6 Nsp1蛋白糖基化位點預測 沒有信號肽的蛋白質不太可能暴露于N-糖基化機制，因此可能不會被糖基化(在體內)。利用NetNGlyc 1.0 Server預測后發(fā)現(xiàn)，Nsp1蛋白可能不會被N-糖基化修飾(圖6)。

圖6 新冠病毒Nsp1蛋白N-糖基化位點Fig.6 N-glycosylation site of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

O-糖基化修飾預測發(fā)現(xiàn)，Nsp1有3個可能的O-糖基化修飾位點：S40、S74和T163(圖7)。

圖7 新冠病毒Nsp1蛋白O-糖基化位點Fig.7 O-glycosylation sites of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

2.7 Nsp1蛋白二級結構分析 使用Prabi網(wǎng)站對Nsp1蛋白的二級結構進行分析。結果顯示，Nsp1中α-螺旋占25.56%，延伸鏈占20.56%，β-轉角占8.89%，無規(guī)則卷曲占45.00%(圖8)。

圖8 新冠病毒Nsp1蛋白二級結構Fig.8 Secondary structure of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

2.8 Nsp1蛋白的相互作用網(wǎng)絡 最新的蛋白質組學分析顯示[13]，Nsp1與6個蛋白存在相互作用，分別是：DNA引物酶小亞基(PRIM1)，DNA引物酶大亞基(PRIM2)，DNA聚合酶α復合物催化亞基(POLA1)，DNA聚合酶α復合物輔助亞基(POLA2)，Plakophilin-2(PKP2)及前膠原半乳糖基轉移酶1(COLGALT1)(圖9)。

圖9 新冠病毒Nsp1蛋白相互作用網(wǎng)絡Fig.9 Interaction network of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

2.9 Nsp1蛋白結構域分析 Nsp1含有2個結構域，N端為冠狀病毒Nsp1球狀結構域(T12-G133)，C端為β-冠狀病毒Nsp1 C末端結構域(E148-G179)(圖10)。Nsp1是α冠狀病毒和β冠狀病毒的一個特征性蛋白，在抑制宿主基因表達和抗病毒反應方面表現(xiàn)出功能保守性和機制多樣性。盡管冠狀病毒Nsp1蛋白之間的序列同源性較低，但其核心結構共享一個相對保守的球狀結構域。

圖10 新冠病毒Nsp1蛋白的結構域分析Fig.10 Domain analysis of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

Sarbe冠狀病毒Nsp1的C末端結構域通過與核糖體40S亞基的mRNA通道結合，干擾mRNA結合進而抑制宿主蛋白質翻譯。這種抑制機制可能是Sarbe冠狀病毒特有的，因為Nsp1的C端在α冠狀病毒中較短，并且在包括MERS冠狀病毒在內的其他β冠狀病毒中并不高度保守。

2.10 Nsp1蛋白的三維結構 根據(jù)蛋白質三級結構建立網(wǎng)站構建Nsp1蛋白的三級結構。結果只顯示10～126位點，148～180位點的三級結構模型(圖11)。

圖11 新冠病毒Nsp1蛋白的三維結構分析Fig.11 Three-dimensional structure analysis of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

2.11 Nsp1蛋白序列同源性分析 通過Uniprot網(wǎng)站檢索發(fā)現(xiàn)，與新冠Nsp1序列最接近的是Bat SARS-like coronavirus WIV1(85.0%)，接著是Bat coronavirus Rp/Shaanxi 2011、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒、SARS coronavirus WH20和SARS coronavirus PUMC02，序列一致性均為84.4%，與Bat Hp-betacoronavirus/Zhejiang2013的序列相似度為28.7%。所有序列中相同的殘基占比21.1%(*所示)，性質相似的占比19.4%(:所示)，相似性較低的占比16.1%(.所示)(圖12)。

圖12 新冠病毒Nsp1蛋白序列同源性Fig.12 Homology of SARS-CoV-2 Nsp1 protein sequence

2.12 Nsp1的進化樹構建 結果顯示，這15種病毒的蛋白與SARS-CoV-2的Nsp1蛋白親緣關系較遠，BtRs-BetaCoV/YN2013與非典型冠狀病毒HKU3聚為一支，置信度為72，聚為一支后與蝙蝠非典型冠狀病毒W(wǎng)IV1聚為一支，置信度為39。此外，BtRf-BetaCoV/JL2012與Bat SARS-like coronavirus YNLF_31C聚類為同一支，置信度78；Bat coronavirus Rp/Shaanxi2011與BtRs-BetaCoV/HuB2013聚類為同一支，置信度48(圖13)。

圖13 新冠病毒Nsp1蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.13 Phylogenetic tree of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

2.13 表達載體pET-22b-Nsp1的構建

2.13.1Nsp1的酶切與PCR驗證 用NdeI與XhoI對Nsp1進行酶切(圖14A)；PCR擴增Nsp1序列，電泳檢測顯示片段大小合適(圖14B)。

A：Nsp1雙酶切實驗 1：Nsp1酶切產物 M：2-log DNA marker B：菌落PCR 1～6陽性單克隆 圖14 Nsp1的酶切與菌落PCRFig.14 Restriction endonuclease digestion and colony PCR validation of Nsp1

2.13.2 pET-22b-Nsp1的酶切及轉化 用NdeI與XhoI同時酶切重組載體，電泳檢測顯示片段大小正確(圖15A)；將pET-22b-Nsp1轉化Top10，于37 ℃恒溫培養(yǎng)13 h(圖15B左)，提取質粒后測序驗證，選取正確的轉化BL21(圖15B右)。

A：pET-22b-Nsp1酶切實驗 1：不酶切 2：雙酶切 B：pET-22b-Nsp1轉化實驗(左：Top10，右：BL21)圖15 pET-22b-Nsp1的酶切和轉化Fig.15 Enzyme digestion and transformation of pET-22b-Nsp1

2.14 Nsp1的蛋白表達 菌體培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時用0.5 mmol/L IPTG去誘導，12%SDS-PAGE檢測顯示，Nsp1蛋白表達量經誘導之后顯著上調(泳道4和泳道10)；對誘導前和誘導后的全細胞裂解液、上清液、沉淀分別檢測后發(fā)現(xiàn)，Nsp1主要表達在沉淀(泳道3、6；泳道9、12)(圖16)。對泳道6和12的相應位置進行切膠并質譜鑒定(圖17)，發(fā)現(xiàn)沉淀中表達的確實是目標蛋白Nsp1。

圖16 Nsp1蛋白的誘導表達檢測Fig.16 Detection of induced expression of Nsp1 protein

圖17 Nsp1蛋白的質譜鑒定Fig.17 Identification of nsp1 protein by mass spectrometry

3 討 論

新冠疫情的全球蔓延給世界公共衛(wèi)生安全帶來了巨大挑戰(zhàn)，盡快闡明SARS-CoV-2的傳播機制并開發(fā)有效的抗病毒藥物是遏制疫情蔓延的關鍵所在[14]。結構分析顯示，Nsp1的C末端結構域阻礙mRNA在核糖體上的進入通道(mRNA entry tunnel)，加速宿主細胞mRNA降解，導致宿主蛋白合成減少并促進病毒存活[11,15]。Nsp1還能有效阻斷RIG-I依賴的先天免疫反應，抑制宿主細胞對病毒的清除[11,16]。由于Nsp1參與病毒生命周期的多個階段，因此它是一個潛在的抗病毒靶點和重要的毒力因子。

生物信息學分析對于目的蛋白的表達具有很強的指導意義，E.coli表達系統(tǒng)以其安全性好、操作簡便、表達量高、容易放大培養(yǎng)等優(yōu)點，被廣泛用于基因工程藥物生產[17]。此外，原核表達對于快速制備抗體和體外功能研究具有較大優(yōu)勢。目的蛋白的理化性質、分子量、氨基酸組成、等電點、親疏水性、序列保守程度、GC含量、密碼子組成等對于原核表達都具有重要影響。通常情況下，蛋白分子量超過100 kD或低于5 kD時均難以表達。分子量太小的易被降解，通過加入融合標簽GST、Trx、MBP或者較大的促融合蛋白標簽有助于使目的蛋白正確折疊，并以可溶形式表達；對于密碼子進行優(yōu)化，也可提高目的蛋白的翻譯效率和表達量。本文生物信息學分析顯示，Nsp1蛋白分子量19.78 kDa，等電點5.36，性質較穩(wěn)定，在哺乳動物中半衰期約30 h，在E.coli內大于10 h，無信號肽和跨膜螺旋，親水性較強，不屬于分泌蛋白。無規(guī)則卷曲在Nsp1蛋白中占比最高(45.00%)，其次是α螺旋(25.56%)和延伸鏈(20.56%)，以上結果為進一步揭示該蛋白的結構及功能提供了數(shù)據(jù)基礎。

糖基化和磷酸化修飾是生物體內最重要的翻譯后修飾方式，糖基化對蛋白的折疊、免疫原性、穩(wěn)定性及定位具有重要影響。磷酸化修飾可改變蛋白的生物活性，從而調控細胞內信號轉導。蛋白的磷酸化修飾與病毒粒子增殖、組裝和復制密切相關，在調控病毒與宿主的代謝中起重要作用。本研究分析顯示，Nsp1有3個O-糖基化位點及12個磷酸化位點，然而仍需進一步實驗驗證。系統(tǒng)鑒定病毒蛋白的磷酸化位點并揭示其調控機制將有助于抗病毒藥物的研發(fā)和病毒感染機制的闡明。

SARS-CoV的Nsp1蛋白通過“雙管齊下”的策略抑制宿主基因表達，它首先結合核糖體40S亞基，在翻譯起始的不同階段使經典的mRNA翻譯(canonical mRNA translation)停滯[18-19]。其次，Nsp1與核糖體結合導致宿主mRNA的酶切和降解。然而，Nsp1與病毒mRNA的5′ UTR保守區(qū)相互作用進而避免自身蛋白翻譯停滯的機制還有待進一步研究[20]。本文多序列比對顯示，SARS-CoV-2與SARS-CoV的Nsp1序列一致性為84.4%(圖12)，提示二者具有相似的理化性質和生物學功能。研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV Nsp1的C末端殘基K164和H165在β冠狀病毒中高度保守，二者對Nsp1與40S亞基的相互作用至關重要，K164A和H165A的突變導致Nsp1無法結合40S并抑制翻譯起始[19]。近期，Schubert等[21]和Thoms等[11]的電鏡結構分析顯示，SARS-CoV-2 Nsp1的C末端區(qū)域折疊成兩個螺旋，插入mRNA入口通道，阻礙mRNA進入進而抑制宿主蛋白翻譯。第1個螺旋(P153-N160)與40S核糖體蛋白uS3和uS5形成疏水作用，第2個螺旋(S166-N178)與eS30和18S rRNA的h18相互作用。保守的KH二肽(K164和H165)與h18形成關鍵相互作用，這種相互作用是基于H165與U607和U630之間的堿基堆積力，以及K164與G625和U630的磷酸骨架之間的靜電相互作用。此外，SARS-CoV-2 Nsp1的K164和H165殘基對于核糖體結合和抑制宿主基因表達至關重要[11, 22]。以上結論與本文多序列比對結果相吻合。

結構域分析顯示，Nsp1的N端(T12-G133)為冠狀病毒Nsp1球狀結構域，C端(E148-G179)為β-冠狀病毒Nsp1 C末端結構域(圖10)。Zhao K等[23]對SARS-CoV-2 Nsp1 N末端(K11-K125)的結構與功能研究發(fā)現(xiàn)，單獨的N末端不能與核糖體共定位并抑制宿主蛋白翻譯，單獨的C端可與核糖體共定位但其抑制蛋白質翻譯能力明顯減弱。有趣的是，將Nsp1的C端與增強型綠色熒光蛋白(EGFP)或其他蛋白融合以取代其N端，可將蛋白翻譯抑制能力恢復到與全長Nsp1相當水平。這就說明Nsp1的N末端能夠穩(wěn)定C末端同核糖體的結合，并作為非特異性屏障阻斷mRNA通道從而抑制宿主細胞翻譯，因此SARS-CoV-2 Nsp1主要通過其C端抑制宿主翻譯，但N末端是Nsp1發(fā)揮功能所必需的。K141、S142和F143殘基靠近SARS-CoV-2 Nsp1的C末端，參與40S核糖體亞基的結合[11, 21, 24]。本研究發(fā)現(xiàn)，K141-F143序列保守性不高，除SARS-CoV-2之外，其它序列中有14條對應殘基均為K141-Y143。此外，Benedetti等[25]鑒定到一個K141-F143缺失的SARS-CoV-2基因組，這種缺失變異可能改變Nsp1蛋白的結構，抑制Nsp1同40S核糖體結合，影響病毒和宿主基因表達調控的活性[26]。以上結果表明，SARS-CoV-2的Nsp1基因正在經歷一個進化過程，這可能有助于病毒更好地適應人類宿主。

最后，本文構建了SARS-CoV-2 Nsp1蛋白的表達載體pET-22b-Nsp1并完成原核表達，初步建立了Nsp1蛋白表達條件。當培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時加入IPTG(0.5 mmol/L)誘導，先37 ℃、220 r/min培養(yǎng)2.5 h，接著25 ℃、160 r/min繼續(xù)培養(yǎng)9 h。結果顯示，Nsp1蛋白出現(xiàn)過表達且主要在細菌裂解液離心之后的沉淀中表達(圖16)，經質譜鑒定(圖17)，沉淀中主要表達的確實是目標蛋白Nsp1。因此大規(guī)模純化Nsp1用于疫苗研發(fā)或結構分析應考慮優(yōu)先從沉淀中進行。另一方面，從功能研究的角度考慮，可采取改變培養(yǎng)溫度16 ℃～30 ℃、降低IPTG濃度(0.01～0.1)mmol/L并延長誘導時間使蛋白更多的在上清表達，因為上清表達的蛋白要比經包涵體純化的蛋白活性好。需要指出的是，本文還預測到Nsp1存在糖基化和磷酸化修飾，鑒于原核表達系統(tǒng)沒有翻譯后修飾功能，因此功能研究實驗應考慮從真核系統(tǒng)去表達該蛋白。

綜上，本文對SARS-CoV-2的Nsp1進行了較為全面的生信分析、表達載體構建及原核表達，研究結果將有助于深入了解Nsp1的生物學功能和設計靶向藥。基于本研究結果，將來可針對以下方向進行重點攻關：1)Nsp1蛋白有效抑制宿主細胞翻譯但不影響自身蛋白表達的分子機制的闡明；2)針對Nsp1蛋白的靶向藥物設計；3)針對Nsp1蛋白所涉及的關鍵信號通路開發(fā)特異性的抑制劑；4)針對Nsp1蛋白或基因的高靈敏度病毒檢測方法的開發(fā)；5)系統(tǒng)鑒定Nsp1蛋白的翻譯后修飾位點并闡明其調控機理。

4 結 論

Nsp1性質穩(wěn)定，親水性較強，有多個翻譯后修飾位點，原核表達后發(fā)現(xiàn)其主要在細菌裂解液離心后的沉淀中表達。因此，其功能研究可能采用真核系統(tǒng)的可溶性表達更適宜。此外，該蛋白序列保守性高，且主要定位于宿主細胞的細胞質與細胞核中，提示其功能重要。本研究為針對該蛋白的純化、結晶、結構分析、抗體制備和體外功能研究提供了重要的較好的數(shù)據(jù)基礎，有助于加快針對Nsp1的靶向藥物研發(fā)。

(感謝中國科學院生物物理研究所質譜平臺為本文Nsp1蛋白鑒定所提供的大力支持。)

利益沖突：無

引用本文格式：劉玲，李璟，范蕾，等. 新冠病毒Nsp1蛋白結構與功能的生物信息學分析及原核表達[J].中國人獸共患病學報，2022，38(7)：566-576. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.074