乳腺癌組織KiSS-1、MMP-2表達(dá)水平與老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后的關(guān)系*

朱 偉，楊 霜，崔立娟，張肖玲，楊 凱

江蘇省張家港市中醫(yī)醫(yī)院病理科，江蘇蘇州 215600

改良根治術(shù)是目前乳腺癌治療最常用術(shù)式，不僅可解除腫瘤占位效應(yīng)，延長患者生存期限，還可保留胸肌，術(shù)后外觀較好[1]。但文獻(xiàn)指出，改良根治術(shù)后2～3年內(nèi)仍有10%～30%的乳腺癌患者可能會出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的情況，繼而增加患者預(yù)后不良風(fēng)險[2]。同時，由于老年乳腺癌患者多合并基礎(chǔ)疾病，機(jī)體免疫力低下，預(yù)后不良風(fēng)險更高[3]。因此，明確老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后情況及可能與預(yù)后相關(guān)的指標(biāo)，對指導(dǎo)乳腺癌早期干預(yù)尤為重要。目前，臨床多采用影像學(xué)手段明確乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移情況，以評估患者預(yù)后，雖可觀察病灶變化，但所獲結(jié)果僅為當(dāng)下表現(xiàn)，無法定量分析腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險，應(yīng)用存在局限[4]。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因-1(KiSS-1)是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，報道指出，KiSS-1與乳腺癌、宮頸癌等惡性腫瘤密切相關(guān)，該基因表達(dá)缺失可能會增加腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險[5]?；|(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)作為MMP家族重要成員，不僅可降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，而且可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫耐受[6]。結(jié)合KiSS-1、MMP-2作用機(jī)制，二者可能與老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后有關(guān)，但具體關(guān)系尚未明確。鑒于此，本研究著重分析乳腺癌組織中KiSS-1、MMP-2表達(dá)水平與老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2012年3月至2017年3月在本院接受改良根治術(shù)治療且完成1年隨訪的女性老年乳腺癌患者資料。設(shè)計(jì)基線資料填寫表，閱讀患者相關(guān)基線資料并記錄研究所需資料，包括：年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、合并基礎(chǔ)疾病(高血壓，收縮壓≥140 mm Hg，舒張壓≥90 mm Hg；糖尿病，空腹血糖≥7.0 mmol/L，和(或)餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L)、美國紐約麻醉醫(yī)師協(xié)會(ASA)分級[8](Ⅰ～Ⅲ級)、腫瘤最大徑、病理類型(浸潤癌、非浸潤癌)、TNM分期[9](Ⅰ～Ⅱ期)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(影像學(xué)檢查可見同側(cè)Ⅰ、Ⅱ水平腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，或同側(cè)內(nèi)乳淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)乳腺癌診斷符合《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范(2015版)》[7]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)手術(shù)病理檢查確診；(2)年齡≥60歲；(3)單側(cè)乳腺癌；(4)具有改良根治術(shù)手術(shù)指征(TNM分期于Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌，腫瘤未累及胸肌筋膜)，且首次接受改良根治術(shù)治療；(5)病理組織切片保存完整；(6)全部患者病歷資料、相關(guān)檢查資料及隨訪資料等均完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并胃癌、宮頸癌等其他惡性腫瘤患者；(2)合并先天性心臟病、肝腎衰竭等重要臟器病變患者；(3)合并感染性肺炎患者；(4)合并免疫系統(tǒng)疾病或凝血功能異常患者；(5)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者；(6)術(shù)前接受放化療、免疫抑制劑等相關(guān)治療患者。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，最終納入115例患者作為研究對象。納入患者年齡63～75歲，平均(68.52±1.71)歲；BMI 17.5～24.8 kg/m2，平均(21.03±1.04)kg/m2；病理類型：浸潤癌78例，非浸潤癌37例。

1.2儀器與試劑 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析儀(型號：lepgen-96)購自濟(jì)南歐萊博電子商務(wù)有限公司；低速離心機(jī)(型號：TD5K)購自上海舜制儀器有限公司；Trizol試劑盒均購自上海通蔚生物有限公司；2×Mic、DNA Ladder試劑均購自上海時代生物科技有限公司；CEA試劑盒購自上?？道噬锟萍加邢薰?。

1.3方法

1.3.1預(yù)后評估及分組 改良根治術(shù)后患者均接受1年隨訪，隨訪期間間隔3個月復(fù)查1次CT或MRI，若檢查結(jié)果正常，則間隔6個月復(fù)查1次。統(tǒng)計(jì)患者隨訪1年期間病死、腫瘤復(fù)發(fā)(CT或MRI檢查可見原病灶切除部位出現(xiàn)新病灶)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(CT或MRI檢查可見縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸壁轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移等)情況，將病死、腫瘤復(fù)發(fā)、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者納入預(yù)后不良組，其他則納入預(yù)后良好組。

1.3.2血清癌胚抗原(CEA)水平檢測 采集患者術(shù)前空腹外周靜脈血5 mL，以離心半徑10 cm、轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，收集上層血清，采用電化學(xué)發(fā)光法及相應(yīng)試劑盒檢測CEA，檢驗(yàn)流程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.3乳腺癌組織中KiSS-1、MMP-2表達(dá)水平檢測 取乳腺癌標(biāo)本組織(約100 mg)，置于液氮浴中研碎，添加1 mL Trizol裂解液，并采用Trizol試劑盒提取標(biāo)本總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為共20 μL，包括標(biāo)本RNA 1.5 μL、Rever Tra Ace 1 μL、Rnase抑制劑1 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、Rnase Free H2O 9.5 μL、Random Peimer 1 μL、5×RT緩沖液4 μL，然后依次置于30 ℃環(huán)境下孵育10 min、42 ℃環(huán)境下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)20 min、99 ℃環(huán)境下滅活5 min，最后于4 ℃環(huán)境下，用低速離心機(jī)以1 200 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，離心半徑為6 cm，提取標(biāo)本cDNA；取標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增上游引物序列為5′-TAGAATCCCTGGGCCTCCTG-3′，下游引物序列為5′-TCCCTTGGTGCCGTCTTC-3′。反應(yīng)條件：94 ℃環(huán)境下反應(yīng)2 min、94 ℃環(huán)境下反應(yīng)45 s、60 ℃環(huán)境下反應(yīng)30 s、72 ℃環(huán)境下反應(yīng)30 s，設(shè)定40個循環(huán)，最后在72 ℃環(huán)境下延伸7 min，反應(yīng)結(jié)束用2-ΔΔCt法分析KiSS-1、MMP-2表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后情況 115例老年乳腺癌患者隨訪1年內(nèi)預(yù)后不良26例，占22.61%(26/115)，其中病死5例，復(fù)發(fā)13例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移8例。

2.2老年乳腺癌改良根治術(shù)不同預(yù)后患者基線資料比較 預(yù)后不良組和預(yù)后良好組年齡、BMI、合并基礎(chǔ)疾病、ASA分級、腫瘤最大徑、病理類型、TNM分期、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 老年乳腺癌改良根治術(shù)不同預(yù)后患者基線資料比較

2.3老年乳腺癌改良根治術(shù)不同預(yù)后患者血清CEA水平及乳腺癌組織KiSS-1、MMP-2表達(dá)水平比較 預(yù)后不良組血清CEA水平、乳腺癌組織MMP-2表達(dá)水平高于預(yù)后良好組，乳腺癌組織KiSS-1表達(dá)水平低于預(yù)后良好組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同預(yù)后老年乳腺癌患者血清CEA水平及乳腺癌組織KiSS-1、MMP-2表達(dá)水平比較[M(P25,P75)]

2.4乳腺癌組織KiSS-1表達(dá)水平與MMP-2的相關(guān)性分析 經(jīng)一般線性雙變量Spearman直線相關(guān)檢驗(yàn)，乳腺癌組織KiSS-1表達(dá)水平與MMP-2呈負(fù)相關(guān)(r=-0.327，P<0.05)，見圖1。

2.5老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后不良的影響因素分析 以不同預(yù)后老年乳腺癌患者中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)CEA、KiSS-1、MMP-2作為自變量(均為連續(xù)變量)，老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后情況(1=預(yù)后不良，0=預(yù)后良好)作為因變量建立Logistic回歸模型，分析結(jié)果顯示，血清CEA、乳腺癌組織中KiSS-1、MMP-2異常表達(dá)與改良根治術(shù)預(yù)后有關(guān)，KiSS-1高表達(dá)可能是老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后不良的保護(hù)因素(OR=0.271，P<0.05)，CEA、CEAMMP-2高表達(dá)可能是老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素(OR=3.619、16.436，P<0.05)，見表3。

表3 老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后不良的影響因素分析

2.6KiSS-1、MMP-2單獨(dú)和聯(lián)合檢測對老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后不良的預(yù)測價值 以乳腺癌組織中KiSS-1、MMP-2表達(dá)作為檢驗(yàn)變量，老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后情況作為狀態(tài)變量(1=預(yù)后不良，0=預(yù)后良好)繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，KiSS-1、MMP-2單獨(dú)和聯(lián)合檢測預(yù)測老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后不良的AUC分別為0.898、0.820、0.939，均>0.800，均有一定預(yù)測價值，當(dāng)二者的cut-off值分別為5.825、2.015時，預(yù)測價值最佳。見圖2、表4。

3 討 論

乳腺癌作為女性常見惡性腫瘤，發(fā)病率約為24.2%，且流行病學(xué)調(diào)查顯示，近年來乳腺癌發(fā)病率逐年升高[10]。目前，臨床治療乳腺癌多采用改良根治術(shù)以切除腫瘤病灶，遏制疾病進(jìn)展，但術(shù)后仍可能會出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移情況，導(dǎo)致患者預(yù)后不良[11]。

CEA是乳腺癌診斷和預(yù)后評估常用的血清標(biāo)志物，主要由內(nèi)胚層細(xì)胞分泌而來，血清水平升高提示腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移高風(fēng)險[12]。但有報道指出，血清CEA水平評估乳腺癌預(yù)后特異度不佳，且容易受到炎癥影響，應(yīng)用存在局限[13]。因此，需尋求其他評估老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后的新型指標(biāo)。本研究比較了老年乳腺癌改良根治術(shù)不同預(yù)后患者的基線資料、血清CEA水平及乳腺癌組織KiSS-1、MMP-2表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)老年乳腺癌改良根治術(shù)預(yù)后不良組乳腺癌組織MMP-2表達(dá)水平高于預(yù)后良好組(P<0.05)，乳腺癌組織KiSS-1表達(dá)水平低于預(yù)后良好組(P<0.05)，推測KiSS-1、MMP-2也可用于老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后的評估。

KiSS-1作為一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，最早由黑色素瘤細(xì)胞株分離而來，近年來研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中KiSS-1表達(dá)缺失[14]。據(jù)報道，KiSS-1基因編碼殘基肽可結(jié)合G蛋白偶聯(lián)受體54(GPR54)，促進(jìn)磷脂酰肌醇二磷酸水解及鈣離子活動，且可加速花生四烯酸釋放、絲裂原活化蛋白激酶p38磷酸化，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[15]。此外，KiSS-1基因編碼殘基肽結(jié)合GPR54還可激活磷脂酶C，促使細(xì)胞內(nèi)鈣離子排出，從而抑制腫瘤細(xì)胞的復(fù)制、侵襲能力[16]。MMP是機(jī)體重要降解酶，它不僅具有降解細(xì)胞外基質(zhì)作用，還可調(diào)控生長因子表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[17]。MMP-2是MMP家族中參與降解細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶，MMP-2被激活后可轉(zhuǎn)變?yōu)棰粜湍z原酶，從而發(fā)揮破壞細(xì)胞外基質(zhì)屏障，促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用[18]。據(jù)報道，在乳腺癌發(fā)展過程中，MMP-2可利用降解基質(zhì)原理增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，且可為血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、新血管生成提供有利條件[19]。參考上述研究結(jié)果，結(jié)合KiSS-1、MMP-2的作用機(jī)制，推測二者可能與老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后有關(guān)。

本研究Logistic回歸模型分析結(jié)果顯示，KiSS-1高表達(dá)可能是老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后不良的保護(hù)因素(OR=0.271，P<0.05)，而MMP-2高表達(dá)可能是老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素(OR=16.436，P<0.05)，證實(shí)了老年乳腺癌組織KiSS-1、MMP-2異常表達(dá)與改良根治術(shù)預(yù)后有關(guān)。推測其可能原因：乳腺癌組織中KiSS-1表達(dá)降低會減少氨基酸殘基肽(轉(zhuǎn)移抑素)生成，而氨基酸殘基肽可抑制腫瘤細(xì)胞增殖分化、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，因此KiSS-1低表達(dá)可能會降低其抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的作用，導(dǎo)致乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后不良[20]；乳腺癌組織中MMP-2表達(dá)增加則會破壞腫瘤細(xì)胞屏障與基底膜，加速腫瘤新血管生成，從而促使腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，影響患者改良根治術(shù)預(yù)后[21]。ROC曲線分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織KiSS-1、MMP-2預(yù)測老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后不良風(fēng)險均有理想的價值，當(dāng)二者的的cut-off值分別為5.825、2.015時，可獲得最佳預(yù)測效果，而且隨著KiSS-1表達(dá)降低、MMP-2表達(dá)增加，患者預(yù)后不良風(fēng)險增加。本研究結(jié)果提示，對于術(shù)前乳腺癌組織中KiSS-1低表達(dá)、MMP-2高表達(dá)的老年乳腺癌患者，改良根治術(shù)后臨床應(yīng)根據(jù)患者實(shí)際情況合理選擇放化療輔助干預(yù)，以抑制腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，改善患者預(yù)后。而KiSS-1、MMP-2聯(lián)合檢測預(yù)測老年乳腺癌改良根治術(shù)預(yù)后不良的AUC高于單獨(dú)檢測，臨床可考慮將二者聯(lián)合觀察，使患者整體獲益。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，老年乳腺癌組織KiSS-1表達(dá)水平與MMP-2呈負(fù)相關(guān)(r=-0.327，P<0.05)，這一結(jié)果可能與KiSS-1能夠阻斷MMP通路有關(guān)，但具體影響機(jī)制未來仍需探討。此外，本研究雖經(jīng)Logistic回歸模型分析證實(shí)CEA異常表達(dá)與老年乳腺癌改良根治術(shù)預(yù)后有關(guān)，但因其存在一定局限，因此未分析其對老年乳腺癌改良根治術(shù)預(yù)后不良的預(yù)測價值，且研究僅統(tǒng)計(jì)乳腺癌患者隨訪1年內(nèi)預(yù)后情況，研究存有局限，未來仍需延長隨訪時間、展開前瞻性研究加以驗(yàn)證。

綜上所述，乳腺癌組織KiSS-1、MMP-2表達(dá)水平與改良根治術(shù)預(yù)后不良有關(guān)，考慮未來可檢測老年乳腺癌患者術(shù)前KiSS-1、MMP-2表達(dá)水平，為老年乳腺癌患者改良根治術(shù)預(yù)后評估提供輔助。