PEBP4、CMTM6、HOXD10在腦膠質瘤中的表達水平及其臨床價值*

岳新鵬，王鑫超，劉增強，巨 濤，亓乾偉，雷鵬飛，趙 茹

延安大學咸陽醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西咸陽 712000

腦膠質瘤是一種由腦或脊髓內膠質細胞惡性病變引起的原發(fā)性惡性腫瘤，發(fā)病率較高，臨床較常見，治療方式一般采用開顱手術清除腫瘤病灶[1]。但腦膠質瘤的侵襲性較強，手術只能切除一部分腫瘤病灶，無法切除已經(jīng)深度侵襲的腫瘤病灶，因此，尋找標志性的早期診斷指標對膠質瘤具有重要意義[2]。多項研究證實，磷脂酰乙醇胺結合蛋白4(PEBP4)在多種腫瘤疾病中表達明顯，并參與腫瘤的增生、分裂、轉移[3-4]。趨化素樣因子超家族6(CMTM6)是一種廣泛釋放的蛋白質，參與表觀遺傳調控及影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。既往有研究表明，CMTM6蛋白在肝細胞癌、腦膠質瘤中都有異常表達[6]。同源異形盒基因D10(HOXD10)是Ⅰ類同源異形盒基因家族中的一種特殊的轉錄調節(jié)因子，具有控制胚胎細胞發(fā)育、組織細胞增殖、分化的生理作用，并具有抑癌基因的作用[7]?；谝陨霞毎难芯?，本文將分析PEBP4、CMTM6、HOXD10之間的相關性，三者在腦膠質瘤組織中的表達水平，以及三者對腦膠質瘤的預測價值，以便為腦膠質瘤提供更好的診斷參考價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2019年6月至2020年6月收治的110例疑似腦膠質瘤患者作為研究對象，以病理活檢為金標準，經(jīng)診斷排除60例非腦膠質瘤的患者，將50例確診為腦膠質瘤的患者作為觀察組，其中男22例，女28例；年齡30～65歲，平均(45.36±20.32)歲；≥60歲18例，<60歲32例；腫瘤最大徑≥3 cm 27例，<3 cm 23例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期20例，Ⅲ+Ⅳ期30例；無淋巴結轉移36例，有淋巴結轉移14例；分化程度：中低分化26例，高分化24例。另選取同時期經(jīng)手術治療的50例腦外傷且無腦部腫瘤的患者作為對照組，其中男23例，女27例；年齡28～65歲，平均(44.65±10.34)歲。兩組性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準[批準號：(2019)倫審第(63)號]，患者及家屬均知情同意本研究。

觀察組納入標準：(1)患者診斷均符合腦膠質瘤相關診斷標準[8]；(2)經(jīng)過CT、MRI檢查及病理活檢確診為腦膠質瘤；(3)未經(jīng)手術、化療等治療的患者；(4)顱內單發(fā)腫瘤；(5)年齡不超過80歲；(6)無手術禁忌并且愿意接受此手術者。排除標準：(1)其他惡性腫瘤患者；(2)合并其他顱內病變患者；(3)有嚴重心臟、肝臟、腎臟功能障礙患者者；(4)術前發(fā)生瘤卒中的患者。

對照組納入標準：(1)經(jīng)過顱腦CT和病理活檢未被確診為腦膠質瘤的腦外傷患者；(2)生命體征平穩(wěn)，意識清晰；(3)年齡不超過80歲。排除標準：(1)合并器質性病變或者惡性腫瘤患者；(2)生命體征波動較大患者；(3)有嚴重心臟、肝臟、腎臟功能障礙患者。

1.2方法

1.2.1樣本采集 在無菌條件下，取手術切除的腦膠質瘤組織標本及進行腦損傷手術患者腦組織標本，用生理鹽水清除血塊、壞死組織和一些被電灼燒傷的組織，隨后立即置于液氮中保存，用于提取總RNA和蛋白，以便后期進行實驗。

1.2.2儀器和試劑 免疫組織化學染色實驗儀器包括RM2135石蠟切片機(德國Leica公司)和CX31光學顯微鏡(日本Olympus公司)。PEBP4抗體(ab99468)、CMTM6抗體(ab264067)、HOXD10抗體(ab138508)、羊抗兔IgG[辣根過氧化物酶(HRP)標記的ab205718]購自美國Abcam公司。實時熒光定量PCR(RT-PCR)儀器采用Gentier 96E全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)(西安天隆科技有限公司)。TransScript?Ⅱ Reverse Transcriptas試劑盒和TransStart?Green qPCR SuperMix試劑盒購自北京全式金公司。

1.2.3檢測方法 (1)采用免疫組織化學染色方法檢測PEBP4、CMTM6、HOXD10陽性表達率。腦組織標本做甲醛固定，石蠟包埋、組織切片，分別滴加1∶50的PEBP4、CMTM6、HOXD10抗體，4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后滴加HRP標記的羊抗兔二抗(1∶200)，室溫孵育20 min，PBS清洗加HRP標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min，DAB顯色液顯色，沖洗，蘇木精復染等后于顯微鏡下觀察。選擇每張切片免疫反應較強的區(qū)域，高倍鏡視野(×400)觀察5個不重復區(qū)域，計數(shù)陽性細胞。根據(jù)CST公司抗體說明書進行免疫組織化學染色計分：①陽性細胞的百分率評分，陽性表達細胞數(shù)≤5%為0分，5%<陽性表達細胞數(shù)≤25%為1分，25%<陽性表達細胞數(shù)≤50%為2分，50%<陽性表達細胞數(shù)≤75%為3分，陽性表達細胞數(shù)>75%為4分；②細胞染色程度評分，沒有染色者為0分，淺黃色者為1分，黃色或棕褐色者為2分，褐色者為3分。以陽性細胞百發(fā)率和細胞染色程度評分總和為最終評分，0分為陰性，1～7分為陽性，其中1～3分為低表達，4～7分為高表達。(2)RT-PCR檢測PEBP4、CMTM6、HOXD10表達水平。使用Trizol提取腦膠質瘤組織及正常腦組織的總RNA，檢測RNA純度，取2 μg總RNA反轉錄,將所得cDNA行反轉錄PCR擴增。PCR條件：預變性95 ℃，5 min，之后每一步變性95 ℃，30 s；58 ℃，30 s；延伸72 ℃，45 s，共進行35個循環(huán)。循環(huán)結束后取Ct的平均值，以β-actin為內參，用2-ΔΔCt的計算方法計算PEBP4、CMTM6、HOXD10在正常腦組織及腦膠質瘤組織中的相對表達量。β-actin、PEBP4、CMTM6、HOXD10引物序列見表1。

表1 β-actin、PEBP4、CMTM6、HOXD10引物序列

2 結 果

2.1兩組腦組織PEBP4、CMTM6、HOXD10陽性率和表達水平比較 與對照組相比，觀察組腦組織中PEBP4、CMTM6陽性率和表達水平升高，HOXD10陽性率和表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組腦組織PEBP4、CMTM6、HOXD10陽性率和表達水平比較

2.2腦膠質瘤患者臨床特征與PEBP4、CMTM6、HOXD10的關系分析 PEBP4、CMTM6、HOXD10表達水平與腦膠質瘤患者的性別、年齡、腫瘤類型無關，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；PEBP4、CMTM6、HOXD10表達水平與腦膠質瘤患者腫瘤最大徑、TNM分期、淋巴結有無轉移、分化程度有關，腫瘤最大徑≥3 cm、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結轉移、中低分化程度的患者腦組織中PEBP4、CMTM6表達水平較高，而HOXD10表達水平較低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 腦膠質瘤患者臨床特征與PEBP4、CMTM6、HOXD10的關系

2.3PEBP4、CMTM6、HOXD10表達水平之間的相關性分析 Pearson相關分析結果顯示，PEBP4表達水平與CMTM6呈正相關(r=0.358，P<0.001)，PEBP4、CMTM6表達水平與HOXD10均呈負相關(r=-0.412、-0.433，P<0.001)。見圖1。

注：A為PEBP4表達水平與CMTM6間關系散點圖；B為PEBP4表達水平與HOXD10間關系散點圖；C為CMTM6表達水平與HOXD10間關系散點圖。

2.4PEBP4、CMTM6、HOXD10單獨和聯(lián)合檢測對腦膠質瘤的診斷價值分析 ROC曲線分析結果顯示，PEBP4、CMTM6、HOXD10單獨檢測診斷腦膠質瘤的曲線下面積(AUC)分別為0.815(95%CI：0.716～0.913，P<0.001)、0.746(95%CI：0.636～0.855，P<0.001)、0.870(95%CI：0.789～0.852，P<0.001)，3項指標聯(lián)合檢測診斷腦膠質瘤的AUC為0.909(95%CI：0.842～0.976，P<0.001)，3項指標聯(lián)合檢測對腦膠質瘤的診斷價值較單獨檢測的診斷價值更高(P<0.01)。見表4、圖2。

表4 PEBP4、CMTM6、HOXD10單獨和聯(lián)合檢測對腦膠質瘤的診斷價值參數(shù)

圖2 PEBP4、CMTM6、HOXD10單獨和聯(lián)合檢測診斷腦膠質瘤的ROC曲線

3 討 論

腦膠質瘤是一種常見的腦部腫瘤，多數(shù)患者屬原發(fā)性腦膠質瘤。腦膠質瘤患者不經(jīng)治療生存期一般低于6個月，即使經(jīng)過手術將腫瘤組織切除，也會有殘留的腫瘤細胞，而殘留的腫瘤細胞可以導致腫瘤的再次復發(fā)[9-10]。腦膠質瘤起源于神經(jīng)膠質細胞，生物學不同于其他部位的腫瘤，其主要位于腦白質內，無明顯的邊界，呈實質性，多發(fā)性生長時，向內生長可破壞深部結構，向外生長可侵及腦皮質，大多不侵犯同一個腦葉，根據(jù)病理可以分為低級別腦膠質瘤和高級別腦膠質瘤[11]。本研究分析PEBP4、CMTM6、HOXD10在腦膠質瘤組織中的表達水平，三者之間的相關性，以及它們對腦膠質瘤的診斷價值，以期為臨床診療提供參考依據(jù)，并提高患者生存率。

PEBP4是一種胞質可溶性蛋白，能夠促進腫瘤的轉移、浸潤、增殖，參與多種信號通路轉導，患者病情越嚴重，則機體內PEBP4表達水平越高，生存期越短[12]。本研究中PEBP4在觀察組腦組織中的表達水平和陽性表達率均高于對照組(P<0.05)。PEBP4對腦膠質瘤細胞活力、細胞凋亡、生存周期、遷移和擴散等方面有促進作用，并且能夠影響機體多種腫瘤發(fā)展因子膽堿乙酰轉移酶的分泌，因此，PEBP4能夠加快腦膠質瘤的發(fā)展[3]。有研究顯示，PEBP4表達水平越高，患者腦膠質瘤TNM分期就會越高，病情更加嚴重[4]。因此，干預PEBP4的表達可能會成為后期膠質瘤分子治療的新方向。本研究結果顯示，腦膠質瘤中組織PEBP4表達水平升高，與上述研究結論一致，為進一步了解PEBP4在腦膠質瘤中的功能和作用機制打下了基礎。

CMTM6蛋白屬于CMTM家族，由3號染色體基因編碼組成，為一種特殊的蛋白Marvel結構域，在穿膜蛋白和分泌蛋白的轉運中起核心作用，CMTM6在人體正常組織內有廣泛表達，主要存在于細胞膜和胞內體上[13-14]。Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫也顯示CMTM6在直腸、膀胱中呈高表達[15]。并且CMTM6在各種腫瘤的抑制點位都有廣泛表達，其編碼蛋白可以激活趨化免疫細胞，通過調控細胞周期和信號通路，參與腫瘤的侵襲、發(fā)展[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組腦組織中CMTM6表達水平比對照組高，并且腫瘤的TNM分期越高，CMTM6表達水平也越高，因此，CMTM6可以作為腦膠質瘤的有效診斷指標。

HOXD10基因屬于HOXD家族，目前，有很多學者發(fā)現(xiàn)，HOXD10在膠質瘤中存在異常表達[18-19]。有研究發(fā)現(xiàn)，HOXD10可以下調腫瘤轉移基因RhoC的表達，上調腫瘤抑制基因Nm23-H1的表達，從而抑制腫瘤細胞的遷移、侵襲及體內新生血管的形成，同時還可以相互重建細胞，從而達到阻止人正常腦組織細胞向膠質瘤細胞發(fā)展[20-21]，證明HOXD10可能是一種抑癌基因。本研究發(fā)現(xiàn)，HOXD10在觀察組腦組織中呈低表達，其表達水平與腫瘤最大徑、TNM分期、淋巴結轉移及分化程度有關，因此，HOXD10可能參與腦膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展，這與上述研究一致。

另外，本研究進一步分析了PEBP4、CMTM6、HOXD10表達水平之間的相關性及這3項指標對腦膠質瘤的診斷價值，結果顯示，PEBP4表達水平與CMTM6呈正相關(r=0.358，P<0.001)，而PEBP4、CMTM6表達水平與HOXD10均呈負相關(r=-0.412、-0.433，P<0.001)。出現(xiàn)這一結果的原因可能是PEBP4能夠促進腫瘤細胞的遷移擴散，CMTM6能夠參與膠質瘤的發(fā)展，猜測二者可能涉及相同的機制，因此二者呈正相關。HOXD10在腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，能夠降低腫瘤的侵襲、轉移能力，因此，PEBP4、CMTM6表達水平與HOXD10均呈負相關。同時，PEBP4、CMTM6、HOXD10聯(lián)合檢測診斷腦膠質瘤的價值較高，但本文研究的樣本例數(shù)相對較少，可能結果不夠準確，還需要累積樣本進一步分析，以尋找其具體作用機制，為臨床上腦膠質瘤的診治提供參考。

綜上所述，在腦膠質瘤組織中PEBP4、CMTM6表達水平升高，HOXD10表達水平降低，這3項指標間有一定相關性，其聯(lián)合檢測診斷腦膠質瘤的價值較高。