miR-125b、miR-126在兒童哮喘中的診斷價(jià)值及其與哮喘嚴(yán)重程度的關(guān)系*

王雪妝，林 堅(jiān)，王小花

海口市第三人民醫(yī)院兒科，海南?？?571100

哮喘是兒童常見(jiàn)病，其臨床癥狀包括喘息反復(fù)發(fā)作、胸悶、咳嗽等，嚴(yán)重影響患兒的學(xué)習(xí)及正常生活。流行病學(xué)調(diào)查提示，哮喘在全球患病率為29.1%～32.2%[1]。我國(guó)0～14歲兒童的哮喘發(fā)生率約為2.6%，以男童居多[2]。研究表明，哮喘的發(fā)生與多種因素相關(guān)，例如變應(yīng)原暴露、生活環(huán)境改變、家族遺傳、免疫功能下降等[3]。若患兒未能及時(shí)治療，隨著病程進(jìn)展，可誘發(fā)不可逆的氣道狹窄，或引起氣道重塑，目前，臨床針對(duì)哮喘大多采用激素、支氣管擴(kuò)張劑等治療，旨在控制病情進(jìn)展，但徹底根治難度大，少數(shù)患者甚至治療無(wú)效，總體預(yù)后欠佳[4]。哮喘的早期診療與嚴(yán)重程度評(píng)估對(duì)改善預(yù)后具有重要意義，既往臨床通過(guò)肺功能、炎癥指標(biāo)對(duì)哮喘進(jìn)行輔助診斷、評(píng)估，雖有一定價(jià)值，但特異度、靈敏度較低[5]。因此，臨床仍需尋求更理想的調(diào)控因子，提出新的治療靶點(diǎn)。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)微小核糖核酸(miRNAs)可能通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄水平，或者以其他方式對(duì)靶基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，參與哮喘發(fā)生、進(jìn)展[6]。更有學(xué)者提出miR-125b在氣道炎癥性疾病中發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用，它能促進(jìn)氣道炎癥進(jìn)展，但作用機(jī)制不明[7]。邢國(guó)英等[8]則認(rèn)為抑制肺組織中miR-126的表達(dá)水平，能緩解氣道炎癥，減輕氣道高反應(yīng)性?；谏鲜霰尘埃狙芯繑M定分析miR-125b、miR-126對(duì)兒童哮喘的診斷價(jià)值，觀察二者與哮喘嚴(yán)重程度的關(guān)系，進(jìn)一步掌握兒童哮喘的進(jìn)展機(jī)制，為臨床治療提供新思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2017年9月至2020年12月收治的120例哮喘患兒、79例單純上呼吸道感染患兒作為哮喘組、感染組，另選取同期84例體檢健康志愿兒童作為對(duì)照組。哮喘診斷符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[9]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有反復(fù)喘息、胸悶、氣促、咳嗽癥狀，多與冷空氣、呼吸道感染、接觸變應(yīng)原、過(guò)度通氣等因素相關(guān)，凌晨、夜間癥狀或加劇。(2)癥狀發(fā)作時(shí)肺部可聞及彌漫性、散在哮鳴音，以呼氣相為主。(3)排除其他疾病所致的氣促、反復(fù)喘息等因素。(4)若缺乏典型癥狀，則至少滿足下列1項(xiàng)，①支氣管舒張?jiān)囼?yàn)結(jié)果提示陽(yáng)性；②有可逆性氣流受限證據(jù)；③最大呼氣峰流量日間變異率≥13%(連續(xù)1～2周)；④支氣管激發(fā)試驗(yàn)結(jié)果提示陽(yáng)性。同時(shí)滿足(1)、(2)、(3)條或者(3)、(4)條則確診為哮喘。本研究方案獲本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試兒童均有家屬陪同并簽署知情同意書(shū)。3組性別、年齡、身高、體質(zhì)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但3組的家族過(guò)敏史人數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3組基線資料比較

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 哮喘組納入標(biāo)準(zhǔn)：滿足兒童哮喘相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡≤14歲；就診前1周內(nèi)未使用激素、免疫抑制劑等藥物；就診時(shí)為急性發(fā)作期。感染組納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床診斷(根據(jù)鼻咽部特征、病史等結(jié)合胸部影像學(xué)診斷)為單純上呼吸道感染；年齡≤14歲；就診前1周內(nèi)未使用激素、免疫抑制劑等藥物。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：同期體檢的健康兒童，體檢結(jié)果均正常；年齡≤14歲；體檢前1周內(nèi)無(wú)藥物應(yīng)用史。排除標(biāo)準(zhǔn)：危重癥支氣管哮喘者；肝、腎、心等臟器不全者；患其他急性、慢性感染疾病者；患血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病者；惡性腫瘤者。

1.3方法

1.3.1肺功能檢測(cè) 利用FGC-A+型肺功能檢測(cè)儀(安徽安科生物工程股份有限公司)測(cè)定患兒的用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼氣容積(FEV1)，并計(jì)算FEV1/FVC。

1.3.2血清miR-125b、miR-126水平檢測(cè) 哮喘組、感染組在治療前檢測(cè)，對(duì)照組在體檢當(dāng)日檢測(cè)。采集3組空腹肘靜脈血3 mL，以轉(zhuǎn)速3 500 r/min，離心半徑8 cm，離心10 min，分離血清，將血清置于-80 ℃冰箱保存待檢。采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)測(cè)定血清miR-125b、miR-126水平，主要儀器包括YJ-875超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司)、LX-C75L滅菌器(合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司)、FQD-48A PCR儀(杭州博日科技股份有限公司)，主要試劑均由賽默飛世爾科技有限公司提供，包括異丙醇、氯仿、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑以及PCR引物。采用Trizol試劑提取總RNA，待提取完畢，對(duì)其濃度與純度予以測(cè)定，取2 μl總RNA檢測(cè)，分析A260/A280比值，若比值為1.8～2.0，則表明滿足檢測(cè)需求。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并利用PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s、59 ℃退火延伸50 s，40個(gè)循環(huán)。miR-125b上游引物為5′-UCCCUGAGACCCUAPCUUGUGA-3′，下游引物為5′-ACAPGUUAGGGUCUCAGGGAUU-3′；miR-126上引物為5′-GCTGGCGACGGGACATTATTA-3′，下游引物為5′-CCGTGGACGGCGCATTATTA-3′；內(nèi)參U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-APCGCTTCACGAPTTTGCGT-3′。利用2-ΔΔCt法分析miR-125b、miR-126相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3兒童哮喘嚴(yán)重程度評(píng)估 哮喘嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[10]：(1)輕度，走路時(shí)伴有氣喘，可平臥，伴或不伴煩躁、焦慮情緒，有散在的哮鳴音，脈率略增高，血氧飽和度(SaO2)>95%；(2)中度，說(shuō)話時(shí)有氣短癥狀，喜好坐位，常伴有煩躁、焦慮情緒，有彌散、響亮的哮鳴音，脈率加快，SaO2為90%～95%；(3)重度，休息狀態(tài)下伴有氣短癥狀，喜好前弓位，常伴有焦躁、焦慮情緒，伴彌漫、響亮、雙相的哮鳴音，脈率明顯加快，SaO2<90%。根據(jù)哮喘嚴(yán)重程度，將哮喘患兒分成輕度組(42例)、中度組(47例)及重度組(31例)。

2 結(jié) 果

2.13組血清miR-125b、miR-126水平及肺功能指標(biāo)比較 3組血清miR-125b、miR-126水平與FEV1、FEV1/FVC差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而FVC差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩兩比較，哮喘組血清miR-125b、miR-126水平高于感染組與對(duì)照組(P<0.05)，感染組血清miR-125b、miR-126水平高于對(duì)照組(P<0.05)，哮喘組FEV1、FEV1/FVC低于感染組與對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 三組血清miR-125b、miR-126水平及肺功能指標(biāo)比較

2.2哮喘患兒血清miR-125b、miR-126水平與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性 Pearson線性相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清miR-125b、miR-126水平與FVC無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，與FEV1、FEV1/FVC均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.634、-0.420、-0.731、-0.645，P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 哮喘患兒血清miR-125b、miR-126水平與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性

2.3血清miR-125b、miR-126單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)哮喘的診斷價(jià)值分析 血清miR-125b、miR-126單獨(dú)檢測(cè)診斷哮喘的AUC分別為0.763、0.749，最佳臨界值分別為2.227、9.993，miR-125b、miR-126聯(lián)合檢測(cè)診斷哮喘的AUC為0.846。見(jiàn)表4、圖1。

圖1 血清miR-125b、miR-126單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)診斷哮喘的ROC曲線

表4 血清miR-125b、miR-126單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)哮喘的診斷價(jià)值

2.4不同哮喘嚴(yán)重程度患兒血清miR-125b、miR-126水平比較 不同哮喘嚴(yán)重程度患兒血清miR-125b、miR-126水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩兩比較，重度組、中度組血清miR-125b、miR-126水平高于輕度組(P<0.05)，重度組血清miR-125b、miR-126水平高于中度組(P<0.05)。見(jiàn)表5。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清miR-125b、miR-126水平與哮喘嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(r=0.746、0.695，P<0.05)。

表5 不同哮喘嚴(yán)重程度患兒血清miR-125b、miR-126水平比較

3 討 論

哮喘的主要特征為氣道高反應(yīng)性、持續(xù)性氣道炎癥及氣道重塑，其發(fā)病機(jī)制至今尚未徹底明確。現(xiàn)階段，哮喘缺乏特效藥物治療，臨床上以對(duì)癥處理為主，但其復(fù)發(fā)率高，因此，亟需尋求可靠指標(biāo)對(duì)哮喘進(jìn)行早期診斷，并及時(shí)評(píng)估哮喘嚴(yán)重程度，以便盡早治療，改善病情，降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[11]。目前，已有研究提示，miRNA能對(duì)平滑肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，參與哮喘進(jìn)展[12]。還有研究認(rèn)為，不同miRNA在哮喘中發(fā)揮不同的作用，因其靶基因不同，故可能抑制或促進(jìn)哮喘進(jìn)展[13]。臨床可考慮尋求與哮喘相關(guān)的miRNA，為該病治療提出新靶點(diǎn)。李莉等[14]研究提示，miR-125b參與了急性加重期慢性阻塞性肺疾病進(jìn)展，其表達(dá)水平與患者炎癥、肺功能變化有關(guān)。慢性阻塞性肺疾病與哮喘均可引起氣道高反應(yīng)性與肺功能改變，二者有相似之處，故本次考慮分析miR-125b與哮喘之間的關(guān)系。鄔超等[15]則認(rèn)為，miR-126在難治性哮喘中呈異常表達(dá)，其可能參與調(diào)控哮喘進(jìn)展過(guò)程?；诖?，本研究也將miR-126納入研究范圍。

本研究結(jié)果顯示，哮喘組血清miR-125b、miR-126水平較感染組與對(duì)照組增高(P<0.05)，提示二者表達(dá)水平上調(diào)可能與哮喘發(fā)生有關(guān)。miR-125b是miRNA家族的一員，既往有研究指出它可能通過(guò)上調(diào)炎癥因子(如白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8等)水平，參與氣道炎癥進(jìn)展[16]。小鼠實(shí)驗(yàn)提示，將miR-125b基因敲除，能減輕局部炎癥，這表明miR-125b在疾病過(guò)程中可能發(fā)揮促炎作用，抑制miR-125b表達(dá)對(duì)緩解炎癥有益[17]。本研究中哮喘兒童的血清miR-125b呈高表達(dá)，可能與其促炎作用存在關(guān)聯(lián)。在哮喘的氣道炎癥進(jìn)展過(guò)程中有多種類型的細(xì)胞參與，例如氣道上皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等[18]。miR-126則在嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞產(chǎn)生介質(zhì)的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，它能通過(guò)調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致炎癥或免疫因子表達(dá)異常，促進(jìn)哮喘發(fā)病與進(jìn)展[19]。研究表明：高表達(dá)的miR-126能使哮喘氣道炎癥、氣道高反應(yīng)加重；抑制miR-126表達(dá)，可使肥大細(xì)胞白細(xì)胞介素-4分泌減少，繼而緩解哮喘病情，提示miR-126可能為哮喘治療的靶點(diǎn)之一[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘組FEV1、FEV1/FVC較感染組與對(duì)照組降低(P<0.05)，表明哮喘可引起嚴(yán)重的肺功能損害。哮喘患者因存在氣道高反應(yīng)及炎癥，上皮細(xì)胞容易生成大量粘液，導(dǎo)致氣道阻塞，增加肺部感染風(fēng)險(xiǎn)，致肺損害[21]。本研究進(jìn)一步分析提示，血清miR-125b、miR-126水平與FEV1、FEV1/FVC均呈負(fù)相關(guān)(r<0，P<0.05)，且miR-125b、miR-126單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)診斷哮喘的AUC分別為0.763、0.749、0.846，說(shuō)明miR-125b、miR-126對(duì)兒童哮喘診斷均有一定價(jià)值。

miR-125b高表達(dá)可能具有促炎作用，能加重氣道炎癥，從而導(dǎo)致肺功能損害加劇；miR-126高表達(dá)則可能通過(guò)介導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等釋放細(xì)胞炎癥因子，造成機(jī)體免疫-炎癥系統(tǒng)異常，加重肺損害。二者可能共同參與哮喘疾病進(jìn)展，影響患兒病情。哮喘嚴(yán)重程度不同，臨床表現(xiàn)存在差異，預(yù)后往往也不同，臨床應(yīng)盡早明確哮喘嚴(yán)重程度，為改善預(yù)后提供依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，隨著哮喘嚴(yán)重程度越重，患兒的血清miR-125b、miR-126水平越高(P<0.05)，且二者表達(dá)水平與哮喘嚴(yán)重程度均呈正相關(guān)(r>0，P<0.05)。孟曉敏等[22]以鼻竇炎患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)miR-125b在鼻竇炎組織中呈高表達(dá)，其可能通過(guò)調(diào)控干擾素-β、真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1，促進(jìn)鼻竇炎炎癥進(jìn)展，這進(jìn)一步提示miR-125b可能通過(guò)促炎機(jī)制，參與疾病進(jìn)展，導(dǎo)致疾病程度加重。RAHBARGHAZI等[23]則發(fā)現(xiàn)，C-Kit+細(xì)胞治療能下調(diào)miR-126表達(dá)與轉(zhuǎn)錄水平，緩解哮喘進(jìn)展，間接提示miR-126水平增高與哮喘進(jìn)展有關(guān)，為本研究結(jié)果給予了支持。臨床可將下調(diào)miR-125b、miR-126表達(dá)水平作為兒童哮喘新的治療靶點(diǎn)，改善病情。本研究也存在局限性，如受研究時(shí)限影響，未增設(shè)隨訪分析血清miR-125b、miR-126水平與兒童哮喘預(yù)后的關(guān)系，未來(lái)將對(duì)此進(jìn)行探討。

綜上所述，哮喘患兒血清miR-125b、miR-126水平明顯增高，且與哮喘嚴(yán)重程度均呈正相關(guān)，二者對(duì)哮喘的診斷均有一定價(jià)值。