復(fù)方斑蝥膠囊輔助治療對胃癌患者臨床療效及外周血NLRP3炎性小體表達的影響*

王亞玲，王昌明△，李 曉

1 彭州市人民醫(yī)院，四川 彭州 611930；2 成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤科

目前，胃癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，化療作為其主要的治療手段，在臨床得到了廣泛運用，但因其存在較為嚴重的不良反應(yīng)，部分患者依從性較差［1］。在化療藥物基礎(chǔ)上，給予中醫(yī)藥輔助治療惡性腫瘤，顯示出了較好的臨床療效。胃癌患者多氣虛無力，血脈瘀滯，根據(jù)中醫(yī)“久病多瘀”理論認為益氣化瘀是治療胃癌的關(guān)鍵［2］。復(fù)方斑蝥膠囊臨床廣泛運用于肺癌、乳腺癌等疾病的輔助治療［3-4］，但其機制尚不完全清楚。近年來，已有研究表明腫瘤作為一類炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)的激活與腫瘤的發(fā)生及進展密切相關(guān)，腫瘤的免疫防治作為重要的治療手段而備受關(guān)注［5］。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3）炎性小體是免疫炎癥反應(yīng)的重要組成部分，參與了惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，因此抑制NLRP3激活是腫瘤治療的重要方向［6］。本研究通過觀察復(fù)方斑蝥膠囊輔助治療對胃癌患者NLRP3炎性小體表達的影響，為探討其作用機制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料將2017年8月至2019年8月于彭州市人民醫(yī)院就診的胃癌患者110例按隨機數(shù)字表法分為對照組和觀察組各55例。兩組患者性別、年齡、TNM分期等比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。研究獲得了本院倫理委員會的批準。

1.2 納入標準1）有明確的病理學(xué)確診；2）未接受過放、化療及相關(guān)手術(shù)治療；3）知情同意。

1.3 排除標準1）各種急、慢性感染及合并自身免疫性疾病者；2）近期使用過激素、免疫抑制劑者；其他部位惡性腫瘤者；3）對復(fù)方斑蝥膠囊過敏者。

1.4 設(shè)備與試劑熒光定量PCR儀（美國Biorad公司）；人淋巴細胞分離液（美國Sigma公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒（Takara公司）；人血清白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和白細胞介素18（interleukin-18，IL-18）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（中國武漢博士德公司）；抗NLRP3、Caspase-1及GAPDH單克隆抗體（美國Santa公司）。

1.5 治療方法

1.5.1 對照組 采用FOLFOX4方案進行化療：奧沙利鉑甘露醇注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥公司；國藥準字H20050962；規(guī)格：100 mL∶奧沙利鉑0.1 g+甘露醇5.0 g）85 mg/m2，靜脈滴注，每日2 h，第1天；注射用亞葉酸鈣（哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)公司；國藥準字H20034073；規(guī)格：200 mg）200 mg/m2，靜脈滴注，第1～2天；氟尿嘧啶（上海旭東海普藥業(yè)公司；國藥準字H31020593；規(guī)格：10 mL∶氟尿嘧啶0.25 g）400 mg/m2，靜脈滴注0.75 g，第1～2天，此后微量泵入（5 mL/h），共計44 h。以14天為1個治療周期，連續(xù)用藥4周期后評估療效。

1.5.2 觀察組 在對照組治療的基礎(chǔ)上加用復(fù)方斑蝥膠囊（貴州益佰制藥公司；國藥準字Z52020238；規(guī)格：0.25 g）每次3粒，每日2次，以14天為1個治療周期，共治療4個周期。

1.6 觀察指標

1.6.1 標本采集與處理 抽取胃癌患者治療前后靜脈血4 mL，置于肝素抗凝管中，加入等體積人淋巴細胞分離液，經(jīng)離心半徑15 cm，2991 r/min離心15 min后，得到外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）。

1.6.2 炎性小體NLRP3及Caspase-1 mRNA水平qRT-PCR法檢測 運用Trizol法提取外周血PBMC總RNA，測定RNA濃度，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。依據(jù)TaKaRa公司提供的熒光定量PCR試劑盒說明書建立20μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：預(yù)變性，95℃120 s，95℃5 s，60℃30 s，40個循環(huán)；溶解曲線：95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s，60℃15 s。結(jié)果分析：以GAPDH為內(nèi)參，計算各組相應(yīng)基因的△△CT值。以目的基因的量為定量結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.6.3 PBMCs中的NLRP3、Caspase-1的蛋白表達水平免疫印跡法檢測 提取兩組患者治療前后人PBMCs總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取50μg蛋白于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜，給予5%脫脂牛奶封閉2 h，分別孵育抗NLRP3抗體（1∶400）、Caspase-1抗體（1∶400）及抗GAPDH抗體（1∶500），4℃避光孵育過夜。次日取出膜，給予避光室溫孵育辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶10000），采用凝膠成像系統(tǒng)測定蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的條帶與GAPDH灰度比值。

1.6.4 IL-1β、IL-18水平檢測 采用ELISA法測定外周血上清液IL-1β和IL-18水平。

1.6.5 臨床療效及不良反應(yīng) 根據(jù)實體腫瘤治療評價標準，臨床療效分為完全緩解、部分緩解、穩(wěn)定及進展，總有效率為完全緩解+部分緩解；根據(jù)患者臨床狀態(tài)、生活自理程度、精神狀態(tài)等，參照Karnofsky評分標準進行評分，總分100分，10分1個等級，得分越高，健康狀況越好。根據(jù)WHO抗癌藥物急性及亞急性毒性反應(yīng)分級標準，以治療結(jié)束時較治療前評分提高10分以上為改善；評分不超過10分為穩(wěn)定；評分低于10分以上為無效。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血PBMCs中NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表達兩組患者治療后外周血PBMCs中NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表達均低于治療前（P＜0.05），觀察組低于對照組（P＜0.05），見圖1及表1。

表1 兩組患者治療前后外周血PBMCs中NLRP3、Caspase-1 mRNA水平比較（±s）

表1 兩組患者治療前后外周血PBMCs中NLRP3、Caspase-1 mRNA水平比較（±s）

注：*表示與同組治療前比較，P＜0.05；#表示與對照組治療后比較，P＜0.05

組別對照組觀察組例數(shù)55 55時間治療前治療后治療前NLRP3 mRNA 1.12±0.20 0.73±0.19*1.09±0.15*#Caspase-1 mRNA 1.06±0.18 0.77±0.14*1.10±0.16*#治療后0.54±0.17 0.60±0.12

圖1 兩組患者治療前后PBMCs中的NLRP3、Caspase-1蛋白表達水平

2.2 IL-1β和IL-18水平與治療前比較，兩組患者治療后外周血IL-1β和IL-18水平均降低（P＜0.05），觀察組低于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者治療前后IL-1β和IL-18水平比較（±s）pg/mL

表2 兩組患者治療前后IL-1β和IL-18水平比較（±s）pg/mL

注：*表示與同組治療前比較，P＜0.05；#表示與對照組治療后比較，P＜0.05

組別對照組觀察組例數(shù)55 55時間治療前治療后治療前治療后IL-1β 21.14±4.26 16.23±3.45*20.59±5.12 12.50±4.14*#IL-18 31.26±5.14 23.74±5.05*32.10±6.12 16.62±4.19*#

2.3 臨床療效總有效率觀察組為74.55%，高于對照組的61.82%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 兩組患者臨床療效比較［n（%）］

2.4 Karnofsky評分療效治療后兩組患者Karnofsky評分療效比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 兩組患者治療后Karnofsky評分療效比較［n（%）］

2.5 不良反應(yīng)兩組患者骨髓抑制、消化道癥狀、肝功能損傷、口腔黏膜炎癥等發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

中醫(yī)理論認為，氣虛無力、血脈瘀滯是胃癌的重要病因，故益氣扶正、化瘀解毒是治療胃癌的關(guān)鍵［2］。復(fù)方斑蝥膠囊主要成分包括斑蝥、刺五加、女貞子、黃芪、三棱等，具有提高機體免疫力，誘發(fā)腫瘤細胞凋亡的作用［7］。胃癌的發(fā)病機制復(fù)雜，炎癥信號通路的激活是其重要機制之一，抑制炎癥信號通路的激活是胃癌治療的重要方向。NLRP3炎性小體是炎癥的啟動點，通常情況下，機體NLRP3活性處于抑制狀態(tài)，當(dāng)NLRP3受外在刺激被激活時，可進一步激活下游Caspase-1，隨后導(dǎo)致炎性因子IL-1β和IL-18水平升高，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)［8］。有研究顯示，NLRP3炎性小體在胃癌患者中呈高表達［9］，復(fù)方斑蝥膠囊對胃癌患者NLRP3炎性小體表達的影響，目前研究尚未闡明。

免疫逃逸是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一，其中，炎癥通路的激活，參與了腫瘤的免疫逃逸［10］。目前，已知存在五種炎性小體，其中NLRP3炎性小體研究較多，其結(jié)構(gòu)和功能最明確。相關(guān)研究顯示，NLRP3可促進炎癥性疾病如慢性阻塞性肺疾病、糖尿病腎病及動脈粥樣硬化等疾病的進展，其可作為影響患者病情嚴重程度及預(yù)后的獨立危險因素，同時也是炎癥性疾病潛在的治療靶點［11-13］。有研究顯示，在腫瘤動物模型及腫瘤患者組織中均檢測出高表達的NLRP3炎性小體，其可激活下游炎性細胞因子，促進腫瘤血管新生，降低NLRP3炎性小體表達可抑制腫瘤血管新生，改善腫瘤患者預(yù)后［14］。本研究在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上加用復(fù)方斑蝥膠囊輔助治療胃癌可提高臨床療效。以往研究顯示，炎癥可促進細胞焦亡，而細胞焦亡是引起組織器官功能障礙的主要機制之一，在細胞焦亡通路中，Caspase-1是重要的剪切酶，其作為NLRP3炎性小體的下游，在腫瘤組織中的表達顯著升高，可能進一步參與腫瘤的進展［15］。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方斑蝥膠囊可降低胃癌患者NLRP3炎性小體及下游相關(guān)炎性通路的激活，其可能與改善患者臨床癥狀及提高治療效果相關(guān)。NLRP3炎性小體是機體炎癥反應(yīng)啟動及持續(xù)放大的重要環(huán)節(jié)，相關(guān)研究顯示，抑制NLRP3炎性小體的激活可降低機體炎癥反應(yīng)，改善炎癥性疾病及相關(guān)惡性腫瘤患者臨床療效及預(yù)后［6，12］，而復(fù)方斑蝥膠囊可能通過降低NLRP3炎性小體水平抑制炎性通路激活，提高臨床療效。

綜上所述，復(fù)方斑蝥膠囊可降低胃癌患者NLRP3炎性小體表達水平，抑制下游炎性通路的激活，提高患者臨床療效。但本研究樣本量偏少，同時復(fù)方斑蝥膠囊如何調(diào)控NLRP3炎性小體的機制還有待于進一步研究。