蒙藥藍刺頭對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠TGF-β1、UI、BMD的作用*

趙 軍，師建平

1 內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；2 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學中醫(yī)學院

蒙醫(yī)認為骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）因于腎虛、赫依過剩。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松（postmenopausal osteoporosis，PMOP）因女性絕經(jīng)后卵巢功能衰退導致，屬腎虛證。蒙藥藍刺頭可接骨愈傷、固骨質(zhì)［1］。蒙藥藍刺頭常用于接骨藥中。本研究觀察蒙藥藍刺頭對PMOP模型大鼠血清白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）、股骨頭轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、骨密度（bone mineral density，BMD）、子宮指數(shù)（uterus index，UI）的調(diào)節(jié)作用，為運用蒙醫(yī)“補暖補精-清鎮(zhèn)赫依-固骨質(zhì)壯骨”理論防治PMOP提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品與試劑蒙藥藍刺頭（廣州中醫(yī)藥大學科技產(chǎn)業(yè)園有限公司提供，產(chǎn)地：新疆烏魯木齊市天山區(qū)；采摘時間：2018年7月）；強骨膠囊（北京岐黃制藥有限公司；批號：188103；規(guī)格：0.25 g/粒，30粒/瓶）；己烯雌酚片（合肥久聯(lián)制藥有限公司；批號：20180925；規(guī)格：0.5 mg/片）。IL-1 ELisa試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司；批號：20180512）；TGF-β1免疫組化試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司；批號：53682567）。

1.2 實驗動物雌性4月齡Wistar大鼠96只，購于內(nèi)蒙古大學實驗動物研究中心，實驗動物合格證號：SCXK（蒙）2002-0001。內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎(chǔ)實驗樓病理實驗室飼養(yǎng)。每籠13只，購回適應(yīng)環(huán)境7天。

1.3 方法

1.3.1 模型復制與分組 將96只大鼠隨機平均分為7組。參考文獻［2］制備PMOP模型，假手術(shù)組不切卵巢只切除卵巢周圍少量脂肪。去卵巢30天后隨機選取各組造模大鼠3只切除子宮HE染色［3］，確定造模是否成功。造模4周后假手術(shù)組、模型組麻醉切除子宮，病理HE可見假手術(shù)組子宮內(nèi)膜層較模型組厚，內(nèi)膜內(nèi)腺腔較明顯。模型組子宮較假手術(shù)組縮小明顯，提示去勢后大鼠呈低雌激素狀態(tài)，造模成功。見圖1。

圖1 光鏡下雌鼠子宮HE染色（×400）

1.3.2 藥物干預與標本采集 成模90天后行藥物干預。蒙藥藍刺頭高、中、低劑量組據(jù)大鼠代謝速率比、人鼠體質(zhì)量比折算后分別以27.5000、13.7500、6.8750 mg/mL劑量灌胃給藥，臨床等效劑量以低劑量組為準，高、中、低劑量比例為4∶2∶1。己烯雌酚組予己烯雌酚0.0313 mg/mL，強骨膠囊組予強骨膠囊23.4375 mg/mL，均按成人劑量給藥；假手術(shù)組、模型組予相應(yīng)體積生理鹽水。最終每組按8只計算。采血離心測血清IL-1；剖取雙側(cè)完整股骨，4%甲醛溶液保存，測左側(cè)股骨頭TGF-β1；Micro-CT測右側(cè)股骨BMD；扭力天平稱大鼠子宮濕重，電子天平稱各組大鼠體質(zhì)量，計算UI。

1.3.3 BMD與TGF-β檢測 應(yīng)用顯微CT分析大鼠右側(cè)股骨近端干骺端BMD（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院核醫(yī)學科輔助完成）。免疫組化法測左股骨頭TGF-β1，大鼠股骨脫鈣［4］后進行免疫組化染色。每組大鼠取5張切片（n0），每張切片隨機選擇5個視野（n1），光學顯微鏡下觀察各組染色，并應(yīng)用醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)檢測鏡下細胞光密度值。股骨頭TGF-β1以細胞質(zhì)、細胞膜染成淡黃色/棕黃色為陽性（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學病理學實驗中心協(xié)助完成）。

1.3.4 IL-1檢測 按試劑盒說明書檢測IL-1。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0分析數(shù)據(jù)，多樣本均數(shù)比較用方差分析，以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BMD及UI1）與假手術(shù)組比較，模型組BMD增高（P＜0.01）；與模型組比較，蒙藥藍刺頭中劑量組、己烯雌酚組、強骨膠囊組BMD增高（P＜0.05）；蒙藥藍刺頭高、低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；蒙藥藍刺頭中劑量組與己烯雌酚組、強骨膠囊組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。2）UI模型組與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；模型組與蒙藥藍刺頭低劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；假手術(shù)組與蒙藥藍刺頭高、中劑量組及強骨膠囊組、己烯雌酚組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；蒙藥藍刺頭高、中、低劑量組與強骨膠囊組、己烯雌酚組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。蒙藥藍刺頭各劑量組UI呈線性，劑量越大，UI越高。見表1。

表1 各組大鼠右側(cè)股骨干骺端BMD及UI比較（±s）

表1 各組大鼠右側(cè)股骨干骺端BMD及UI比較（±s）

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

組別蒙藥藍刺頭高劑量組蒙藥藍刺頭中劑量組蒙藥藍刺頭低劑量組強骨膠囊組己烯雌酚組模型組假手術(shù)組鼠數(shù)8 8 8 8 8 8 8 BMD（g/cm3）0.216±0.957△0.266±0.156*0.225±0.852△0.254±0.261*0.273±0.156*0.172±0.102△△0.339±0.095**UI（mg/g）1.597±0.067*1.473±0.069*0.915±0.065△1.413±0.071*1.692±0.062*0.263±0.077△△2.135±0.059**

2.2 大鼠血清IL-1水平與模型組比較，蒙藥藍刺頭中劑量組、己烯雌酚組、強骨膠囊組血清IL-1降低（P＜0.05）；模型組與假手術(shù)組比較差異明顯（P＜0.01）；蒙藥藍刺頭高、低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；蒙藥藍刺頭中劑量組與強骨膠囊組、己烯雌酚組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清IL-1比較（±s） pg/mL

表2 各組大鼠血清IL-1比較（±s） pg/mL

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

組別蒙藥藍刺頭高劑量組蒙藥藍刺頭中劑量組蒙藥藍刺頭低劑量組強骨膠囊組己烯雌酚組模型組假手術(shù)組鼠數(shù)8888888 IL-1 0.305±0.097△0.334±0.076*0.281±0.065△0.326±0.082*0.356±0.051*0.393±0.023△△0.221±0.015**

2.3 大鼠左側(cè)離體股骨頭中TGF-β1表達與模型組比較，蒙藥藍刺頭中劑量組、己烯雌酚組、強骨膠囊組左側(cè)股骨頭中TGF-β1增加（P＜0.05），模型組低于假手術(shù)組（P＜0.01）；蒙藥藍刺頭高、低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；蒙藥藍刺頭中劑量組、強骨膠囊組、己烯雌酚組與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；蒙藥藍刺頭中劑量組與強骨膠囊組、己烯雌酚組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3及圖2。

表3 各組大鼠左側(cè)離體股骨頭TGF-β1比較（±s）

表3 各組大鼠左側(cè)離體股骨頭TGF-β1比較（±s）

注：n1表示每組取5個標本；n0表示每個標本取5個視野進行觀察。與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

組別蒙藥藍刺頭高劑量組蒙藥藍刺頭中劑量組蒙藥藍刺頭低劑量組強骨膠囊組己烯雌酚組模型組假手術(shù)組測定視野數(shù)（n1，n0）25 25 25 25 25 25 25 TGF-β1平均光密度（μm2）80.783±0.235△93.234±0.207*83.459±0.896△81.237±0.783*114.369±0.929*20.396±0.264△△153.687±0.188**

圖2 各組大鼠左側(cè)離體股骨TGF-β1表達

3 討論

目前我國絕經(jīng)后婦女OP存在發(fā)病率高、危害性大等特點，已給社會帶來巨大經(jīng)濟負擔。單一抑制骨吸收藥物同時也會抑制骨形成，長期服用會妨礙骨礦化，影響療效；單一促骨形成藥物又刺激破骨細胞活化，促進骨吸收［5］。信號通路或因子在體內(nèi)生物活性廣泛，單一靶點藥物往往伴有較大副作用［6］。PMOP多由雌激素缺乏導致。雌激素替代療法副反應(yīng)嚴重［7］。目前雌激素替代物中的植物雌激素成研究熱點。研究［8-9］表明，蒙藥藍刺頭具有植物雌激素樣作用，可通過雌激素樣作用促進骨形成，調(diào)節(jié)骨吸收/骨形成偶聯(lián)，降低骨轉(zhuǎn)換率，有防治PMOP的作用。IL-1為骨吸收刺激因子，可直接作用于破骨細胞前體細胞使其分化為破骨細胞［10］，也可通過旁分泌使破骨細胞增殖［11］；雌激素通過抑制IL-1等活性使破骨細胞數(shù)目減少而抗OP，雌激素下降后這種抑制作用減弱，血清IL-1濃度升高；TGF-β1主要存在于骨基質(zhì)中，對成骨具有明顯促進作用，在PMOP中有重要調(diào)節(jié)作用；子宮為對雌激素最敏感受體，UI可間接反映體內(nèi)雌激素水平，同時骨密度是驗證OP的“金標準”。本研究結(jié)果表明，一定劑量蒙藥藍刺頭可降低大鼠血清IL-1，增加股骨頭TGF-β1，提高BMD，具有抑制骨吸收、促進成骨的作用。去勢致雌激素水平下降，子宮萎縮變小，UI降低，蒙藥藍刺頭可增加UI表明蒙藥藍刺頭具有植物雌激素樣作用，一定劑量蒙藥藍刺頭可有效防治PMOP，緩解去勢所致副作用。

綜上所述，大鼠去卵巢后血清IL-1與UI明顯增高，股骨頭TGF-β1表達及BMD降低，適當劑量蒙藥藍刺頭可使血清IL-1與UI降低，股骨頭TGF-β1與BMD提高，效果與己烯雌酚、強骨膠囊相當，起有效促進成骨作用，這為蒙醫(yī)“補暖補精-清鎮(zhèn)赫依-固骨質(zhì)壯骨”理論防治PMOP提供了實驗依據(jù)，利于指導臨床，但其詳細機制、作用通道還需進一步研究。