艾灸關(guān)元穴對甲狀腺功能減退大鼠的影響*

康春嵋，劉冬，黑伊凡

北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029

甲狀腺功能減退癥簡稱甲減，是指由于甲狀腺激素合成及分泌減少或其生理效應(yīng)不足導(dǎo)致的機體代謝異常的一種疾病，女性發(fā)病率高于男性，可出現(xiàn)面色蒼白、智力低下、記憶力減退等癥狀。據(jù)統(tǒng)計，我國甲減的發(fā)病率約為2%～3%，并發(fā)心血管系統(tǒng)、運動系統(tǒng)、消化系統(tǒng)疾病，需及時采取有效的治療措施控制病情[1]。根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，甲減可歸屬于“虛勞”“水腫”范疇，與先天稟賦不足及后天飲食勞倦、情志不遂、水土失宜密切相關(guān)[2]。艾灸是一種中醫(yī)特色療法，可溫經(jīng)散寒、補腎助陽、升陽固脫[3]。關(guān)元穴位于人體臍下三寸，艾灸關(guān)元穴可培本固元、補益下焦，治氣血虧虛、陰陽失調(diào)之癥，研究證實，艾灸關(guān)元穴可調(diào)節(jié)內(nèi)分泌軸[4]。臨床研究顯示，灸法治療甲減效果確切，所選穴位主要包括關(guān)元、足三里等[5]，但艾灸關(guān)元穴治療甲減的具體作用及機制仍需要進一步探討。故此，本研究以甲減大鼠體質(zhì)量、甲狀腺功能指標(biāo)、甲狀腺濾泡上皮細胞的變化為指標(biāo)，探討艾灸關(guān)元穴對甲減大鼠的影響，以期為此療法在臨床中的推廣及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物4周齡SPF級雌雄各半Wistar大鼠60只，體質(zhì)量70～110 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(京)-20190004。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲食和進水，飼養(yǎng)溫度：20～25 ℃，空氣濕度：50%～65%，12 h光照12 h黑暗，保持環(huán)境安靜。本研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審批通過，審批號：BJUCM201911-002。

1.2 藥物與試劑丙硫氧嘧啶(propylthiouracil，PTU)(南通精華制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：171209)；艾灸條(南陽楚艾艾草制品有限公司，規(guī)格：直徑18 mm，長度200 mm，生產(chǎn)批號：180115)；促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)、總?cè)饧谞钕僭彼?total triiodothyroxine 3，TT3)、TT4酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒、二甲基亞砜(dimethylsurfoxide，DMSO)溶液、蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色試劑盒(美國Invitrogen公司，生產(chǎn)批號：180804A、181111C、180917A、20190210、20180617C)；0.25%胰蛋白酶溶液(美國羅氏公司，貨號：G198256)；四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色(methyl thiazolil tetracolium，MTT)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：190412)；RNase、碘化丙啶(propidium iodide，PI)(美國Bio-Rad公司，批號：201906、201901)。

1.3 儀器PL203型電子天平(瑞士梅特勒公司)；M16型高速離心機(湖南湘儀儀器廠，離心半徑：10 cm)；3111型CO2培養(yǎng)箱(美國賽默飛公司)；MK3型酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；Accuri?C6 Plus型流式細胞儀(美國BD公司)。

2 方法

2.1 動物分組、建模及干預(yù)60只雌雄各半Wistar大鼠采用隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組和艾灸組，每組各20只，模型組和艾灸組給予0.05%PTU喂養(yǎng)建立甲減大鼠模型，空白組正常飲食飲水。當(dāng)血清高敏促甲狀腺激素(sensitive thyroid stimulating hormone，sTSH)>10 IU·L-1時，甲減大鼠模型建立成功[6]。模型建立完成后，艾灸組予以關(guān)元穴艾灸，具體操作如下：捆綁大鼠，參照鄧春雷《實驗針灸學(xué)》[7]選穴，臍下15 mm處為關(guān)元穴，即臍與恥骨聯(lián)合上緣3/5交點位置，懸針灸，艾灸需與大鼠皮膚保持1.5 cm距離，艾灸30 min，隔天1次，持續(xù)4個月，空白組和模型組均捆綁懸針灸，但不予以艾灸操作。

2.2 大鼠體質(zhì)量檢測采用電子天平于艾灸干預(yù)前及艾灸1個月、2個月、3個月、4個月后稱量各組大鼠的體質(zhì)量。

2.3 甲狀腺功能指標(biāo)檢測分別于艾灸干預(yù)前及艾灸1個月、2個月、3個月、4個月后采用心臟穿刺取血法取血3～4 mL，每次采血時間均限定在 900-1100，以免甲狀腺激素分泌的節(jié)律性影響檢測結(jié)果。取血后，3 500 r·min-1離心10 min，取上清置于1.5 mL 離心管中，-20 ℃保存。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，采用ELISA試劑盒測定各組大鼠TSH、TT3、TT4的水平。

2.4 甲狀腺濾泡上皮細胞形態(tài)學(xué)變化觀察艾灸干預(yù)結(jié)束后采用斷頭法處死大鼠，迅速取甲狀腺組織，固定、透明、石蠟包埋和連續(xù)切片(層厚為 4 μm)，HE染色后光鏡下觀察細胞生長形態(tài)。

2.5 甲狀腺濾泡上皮細胞增殖抑制率檢測采用MTT法檢測甲狀腺濾泡上皮細胞增殖抑制率。取0.25%胰蛋白酶溶液消化甲狀腺組織，過濾并獲得濾泡上皮細胞。置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，棄上清液，每孔加入40 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清液，每孔加入200 μL DMSO溶液，微孔板震蕩后采用酶標(biāo)儀于570 nm處檢測光密度(optical density，OD)值，并計算細胞增殖抑制率。

細胞增殖抑制率=(1-干預(yù)組OD值/空白組OD值)×100%

2.6 甲狀腺濾泡上皮細胞凋亡率檢測采用流式細胞儀檢測甲狀腺濾泡上皮細胞的凋亡率。細胞培養(yǎng)24 h后以PBS緩沖液調(diào)整細胞密度為1.0×105·mL-1。加入FITC，避光孵育25 min，加入PI(含RNase)后避光孵育5 min，過濾并以流式細胞儀檢測，采用配套Cellquest軟件分析濾泡上皮細胞凋亡率。

3 結(jié)果

3.1 艾灸關(guān)元穴對甲減大鼠體質(zhì)量的影響各組大鼠干預(yù)期間均無死亡，模型組和艾灸組均造模成功。干預(yù)前，與空白組比較，模型組和艾灸組雌性和雄性大鼠體質(zhì)量均明顯下降(P<0.05)。艾灸干預(yù)1個月、2個月、3個月、4個月后，與空白組比較，模型組雌性和雄性大鼠體質(zhì)量均明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組雌性和雄性大鼠體質(zhì)量均明顯升高(P<0.05)；與干預(yù)前比較，模型組雌性和雄性大鼠體質(zhì)量均明顯下降(P<0.05)，且呈時間依賴性；艾灸組雌性和雄性大鼠體質(zhì)量均明顯升高(P<0.05)。提示艾灸關(guān)元穴可升高甲減大鼠的體質(zhì)量。見表1、表2。

表1 各組雌性大鼠干預(yù)期間體質(zhì)量變化

表2 各組雄性大鼠干預(yù)期間體質(zhì)量變化

3.2 艾灸關(guān)元穴對甲減大鼠甲狀腺功能的影響干預(yù)前，與空白組比較，模型組和艾灸組TSH顯著升高(P<0.05)，TT3、TT4顯著下降(P<0.05)。艾灸1個月、2個月、3個月及4個月后，與干預(yù)前比較，模型組TSH顯著升高(P<0.05)，TT3、TT4水平顯著下降(P<0.05)，且呈時間依賴性；艾灸組TSH顯著降低(P<0.05)，TT3、TT4顯著升高(P<0.05)。與空白組比較，模型組TSH顯著升高(P<0.05)，TT3、TT4水平顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組TSH顯著降低(P<0.05)，TT3、TT4水平顯著升高(P<0.05)。提示艾灸關(guān)元穴可增強甲減大鼠的甲狀腺功能。見表3、表4、表5。

表3 各組大鼠不同時間TSH變化

表4 各組大鼠不同時間TT3變化

表5 各組大鼠不同時間TT4變化

3.3 艾灸關(guān)元穴對甲減大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞形態(tài)的影響空白組大鼠甲狀腺濾泡排列均勻、形態(tài)規(guī)則、中等大小，濾泡上皮細胞整齊排列，多為單層立方體狀，濾泡腔內(nèi)可見豐富的膠質(zhì)；模型組大鼠甲狀腺濾泡排列不規(guī)則、呈多形性變化，部分濾泡伴有局部增生，濾泡腔大小不均勻，有紅色深染膠質(zhì)，濾泡上皮細胞部分變矮、且呈扁平狀，核呈梭形排列；艾灸組大鼠甲狀腺濾泡及濾泡上皮細胞結(jié)構(gòu)病理改變得到明顯改善。見圖1。

注：箭頭所示為甲狀腺濾泡上皮細胞形態(tài)改變、濾泡腔異常變化

3.4 甲狀腺濾泡上皮細胞增殖及凋亡測定與空白組比較，模型組增殖抑制率和凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組增殖抑制率和凋亡率顯著下降(P<0.05)，提示艾灸關(guān)元穴可促進甲減大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞增殖并抑制其凋亡。見表6、圖2。

表6 甲狀腺濾泡上皮細胞增殖抑制率和凋亡率結(jié)果

4 討論

甲減病因復(fù)雜，常見的病因有缺碘或甲狀腺合成、分泌不足等[8-9]，目前，針對該病常用的西醫(yī)療法有甲狀腺制劑替代治療，給氧、控制感染、輸液、保護心肌組織等對癥治療，但是甲狀腺制劑替代療法需終身用藥，而對癥治療的成效往往不甚理想[10-12]。因此，甲減患者西醫(yī)治療仍存在明顯的不足與缺陷，需積極探討新型、高效的治療方案。

甲減的臨床癥狀主要有畏寒、嗜睡、乏力、肢體腫脹等，其中畏寒、嗜睡屬于中醫(yī)的“陽虛”，乏力、肢體腫脹則屬于中醫(yī)的“氣虛”[13]。腎藏精，骨生髓，腦為髓海，腎氣不足、髓海不充可致全身乏力、精神萎靡[14]。脾主四肢肌肉，脾氣虛弱則四肢無力。脾主運化，腎主水，脾腎陽虛，氣血不足，則水液泛溢，肢體腫脹[15-16]?，F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)家認為，“虛損”貫穿了甲減的病理發(fā)展過程[17]，根據(jù)虛則補之、損則益之的中醫(yī)原則，需予以溫腎助陽法干預(yù)。艾灸有溫補陽氣、除濕祛瘀之效，關(guān)元穴為強壯要穴，是足三陰與任脈之會，其中足三陰是足厥陰肝經(jīng)、足太陰脾經(jīng)、足少陰腎經(jīng)三經(jīng)，此穴位對應(yīng)肝、脾、腎三臟，對其艾灸可達益腎固本、補精益氣的功效[18-19]。既往報道顯示，艾灸關(guān)元穴能夠?qū)θ梭w全身各器官、免疫系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生影響，對人體糖代謝、脂代謝起到不可忽視的作用[20-21]。另有研究指出，艾灸關(guān)元穴可以使全身循環(huán)系統(tǒng)得到改善，細胞炎癥減少，自身免疫力提高，還可活躍老年大鼠下丘腦-垂體-甲狀腺軸，對陽虛證有良好的治療作用[22-23]。因而，采用艾灸關(guān)元穴治療甲減是可行的，可有效控制其癥狀。

王斌等[24]研究顯示，對甲狀腺功能減退癥大鼠予以左甲狀腺鈉發(fā)現(xiàn)，3個月后大鼠的甲狀腺功能顯著改善。為觀察甲減大鼠的甲狀腺功能動態(tài)變化，故本研究選擇艾灸1個月、艾灸2個月、艾灸3個月和艾灸4個月作為觀察時間點。本研究中，干預(yù)前模型組、艾灸組體質(zhì)量、血清TT3、TT4水平均低于空白組，血清TSH水平高于空白組，提示模型組、艾灸組建模成功，且表明罹患甲減可導(dǎo)致體質(zhì)量、血清TT3、TT4水平下降，而血清TSH水平則顯著升高。PTU可通過“縫隙連接”膜通道阻斷小分子運動，還可加速甲狀腺濾泡上皮細胞凋亡，已在既往研究中證實可用于建立實驗性甲減模型[25-26]。本研究中，干預(yù)后模型組體質(zhì)量、血清TT3、TT4水平均持續(xù)顯著下降，血清TSH水平均持續(xù)顯著升高，表明罹患甲減后若未得到及時有效的治療和控制，體質(zhì)量將會不斷顯著下降，甲狀腺功能異常的程度也將會不斷顯著加重；干預(yù)后不同時刻艾灸組體質(zhì)量、血清TT3、TT4水平均高于干預(yù)前和模型組，血清TSH水平均低于干預(yù)前和模型組，且艾灸組上述指標(biāo)的水平均與空白組接近，提示艾灸關(guān)元穴可以改善甲減大鼠體質(zhì)量下降及甲狀腺功能指標(biāo)。

甲狀腺激素主要是由甲狀腺濾泡上皮細胞合成和分泌的，其形態(tài)、濾泡內(nèi)腔液體量及狀態(tài)均與其功能緊密相關(guān)[27]。正常情況下，甲狀腺濾泡排列整齊、大小均勻，且濾泡上皮細胞呈立方形。當(dāng)甲狀腺功能減退后，濾泡上皮細胞可呈現(xiàn)出變矮、扁平狀，其中的膠質(zhì)狀液體含量增加[28-29]。本研究結(jié)果顯示，空白組大鼠甲狀腺濾泡及上皮細胞狀態(tài)正常，模型組呈顯著異常，艾灸組較模型組有明顯改善，且與空白組相近，證實模型組和艾灸組甲減模型建立成功，同時也表明艾灸關(guān)元穴可促使甲狀腺濾泡及上皮細胞的結(jié)構(gòu)與功能恢復(fù)正常。在甲狀腺濾泡上皮細胞增殖抑制率、凋亡率對比結(jié)果中顯示，模型組增殖抑制率和凋亡率最高，艾灸組均次之，空白組均最低，提示艾灸關(guān)元穴可促進甲狀腺濾泡上皮細胞增殖，抑制凋亡。艾灸關(guān)元穴不僅能夠刺激內(nèi)分泌軸恢復(fù)平衡，還可增強機體抵抗力，減輕甲減對機體造成的危害，推測該療法是通過改善甲狀腺濾泡及上皮細胞的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)揮調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、改善甲狀腺功能的作用。

綜上所述，艾灸關(guān)元穴可改善甲減大鼠體質(zhì)量下降及甲狀腺激素紊亂，促進甲狀腺組織濾泡及上皮細胞結(jié)構(gòu)與功能的恢復(fù)，促進甲狀腺濾泡上皮細胞增殖，抑制細胞凋亡。本研究為甲減患者提供一種高效可行的臨床治療方案，但艾灸關(guān)元穴發(fā)揮上述作用的具體機制及途徑尚不明確，仍需要進一步探討研究。