加味香連丸HPLC指紋圖譜和11個成分定量分析

鐘國男，張余芳，林 冠，鐘小麗

（海口市婦幼保健院 藥劑科，海南 海口 570203）

加味香連丸為清熱劑，是由木香、黃連（姜炙）、黃芩、黃柏（酒炙）、白芍、當(dāng)歸、厚樸（姜炙）、枳殼（去瓤麩炒）、檳榔、延胡索（醋炙）、吳茱萸（甘草炙）、甘草（蜜炙） 十二味中藥組成[1]。方中黃連，清熱燥濕，止瀉痢，為君藥；黃芩、黃柏加強(qiáng)黃連清熱燥濕之功，共為臣藥；白芍、當(dāng)歸和血止痛，延胡索理氣止痛，厚樸、枳殼、檳榔、木香行氣和中，行滯止痛，吳茱萸溫中燥濕止瀉，為佐藥；甘草健脾和中，調(diào)和藥性，為使藥；諸藥合用，共奏清熱祛濕，化滯止痛之功。臨床用于抗生素相關(guān)性腹瀉[2]、放射性腸炎[3]、潰瘍性結(jié)腸炎[4]。加味香連丸收載于2020年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》），現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅對鹽酸小檗堿含量做限量要求，對木香、厚樸、枳殼和延胡索進(jìn)行薄層定性鑒別。有關(guān)其質(zhì)量控制的文獻(xiàn)主要集中于芍藥苷、柚皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、黃芩苷、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯等成分的測定[5-7]。

中藥制劑為多組分復(fù)雜體系，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中薄層鑒別及含量測定均不能對加味香連丸進(jìn)行整體描述和評價。中藥指紋圖譜是中藥或中藥制劑經(jīng)適當(dāng)處理后，借助一定的分析手段，得到的能標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖或光譜圖，能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而對藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評價，具有“整體性”和“模糊性”的特點，已廣泛應(yīng)用于中藥材和中藥制劑的質(zhì)量控制[8-11]。目前加味香連丸指紋圖譜研究尚未報道。本研究采用高效液相色譜（HPLC）法建立加味香連丸的指紋圖譜，并對其中的芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素11個主要活性成分的含量進(jìn)行分析，為全面控制加味香連丸的質(zhì)量提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；BSA124S萬分之一分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；XS205十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250DBG型數(shù)控超聲波清洗器（功率：250 W，頻率：40 kHz，昆山超聲波儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

芍藥苷對照品（批號：110736-201842，含量以97.4 %計），柚皮苷對照品（批號：110722-201815，含量以91.7 %計），新橙皮苷對照品（批號：111857-201804，含量以99.4 %計），阿魏酸對照品（批號：110773-201614，含量以99.0 %計），木香烴內(nèi)酯對照品（批號：111524-201911，含量以99.9 %計），去氫木香內(nèi)酯對照品（批號：111525-201912，含量以99.5 %計），黃芩苷對照品（批號：110715-201720，含量以93.5 %計），鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-202015，含量以85.9 %計），和厚樸酚對照品（批號：110730-201915，含量以99.8 %計），厚樸酚對照品（批號：110729-202015，含量以99.0 %計），延胡索乙素對照品（批號：110726-201819，含量以99.8 %計），均購自中國食品藥品檢定研究院。加味香連丸[北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號分別為2080882（S1），20810197（S2），3080036（S3），3081265（S4），3082242（S5），3086576（S6），3086783（S7），4082251（S8），4083197（S9），4084062（S10），6080152（S11），6082278（S12），6087253（S13），60897421（S14），8080524（S15），規(guī)格為每100丸重6 g。甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純，實驗用水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05 %磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，15 %A；5～20 min，15 %A→35 %A；20～55 min，35 %A→60 %A；55～65 min，60 %A；65～75 min，60 %A→80 %A；75～80 min，80 %A→5 %A），流速為1.0 ml/min，檢測波長230 nm（8～12 min）、225 nm（29～32 min）、280 nm（0～8 min，12～29 min和32～80 min），柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μl，色譜記錄時間80 min。

2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素對照品，置量瓶中，分別加入甲醇溶液制備成質(zhì)量濃度分別為1.374，7.915，2.339，1.537，0.888，0.847，11.947，17.584，1.085，3.019，0.355 mg/ml的單一對照品儲備液。分別精密量取上述單一對照品儲備液適量，置同一10 ml量瓶中，加入70 %甲醇溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得濃度分別為137.4，791.5，233.9，153.7，88.8，84.7，1194.7，1758.4，108.5，301.9，35.5 μg/ml的混合對照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取加味香連丸供試品適量，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入70 %甲醇30 ml，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再次稱定重量，用70 %甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即為供試品溶液，備用[12]。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取加味香連丸供試品（批號：2080882），按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖及峰面積，以13號色譜峰黃芩苷的保留時間為參照，計算得各共有峰的相對保留時間RSD均小于1.3 %（n=6），相對峰面積RSD均小于1.9 %（n=6），說明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 取同一批加味香連丸供試品（批號：2080882）6份，每份約1 g，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖及峰面積，以13號色譜峰黃芩苷的保留時間為參照，計算得各共有峰的相對保留時間RSD均小于1.1 %（n=6），相對峰面積RSD均小于1.5 %（n=6），說明本方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取加味香連丸供試品（批號：2080882），按2.3項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，4，8，12，16，24 h，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖及峰面積，以13號色譜峰黃芩苷的保留時間為參照，計算得各共有峰的相對保留時間RSD均小于1.5 %（n=6），相對峰面積RSD均小于1.6 %（n=6），表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 指紋圖譜的建立及相似度評價 取15批加味香連丸供試品，按2.3項下方法分別制備成供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄HPLC色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A版）（以下簡稱《相似度評價系統(tǒng)》）軟件評價分析，以編號S1號樣品的色譜圖為參考圖譜，設(shè)置時間窗寬度0.2 min，采用多點校正全譜匹配法建立指紋圖譜共有模式，并以平均值法生成對照圖譜。結(jié)果共標(biāo)定29個共有峰，15批加味香連丸指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度分別為0.997，0.993，0.992，0.998，0.996，0.991，0.999，0.995，0.995，0.996，0.994，0.995，0.999，0.997，0.992，相似度均大于0.99，說明15批加味香連丸化學(xué)成分一致性較好。指紋圖譜及其共有模式見圖1。

圖1 15批加味香連丸HPLC指紋圖譜

指紋圖譜共獲得29個保留時間較穩(wěn)定的共有峰，通過比對混合對照品溶液色譜圖共指認(rèn)出11個化合物，分別是3號色譜峰芍藥苷、4號色譜峰柚皮苷、5號色譜峰新橙皮苷、8號色譜峰阿魏酸、11號色譜峰木香烴內(nèi)酯、12號色譜峰去氫木香內(nèi)酯、13號色譜峰黃芩苷、21號色譜峰鹽酸小檗堿、26號色譜峰和厚樸酚、27號色譜峰厚樸酚、28號色譜峰延胡索乙素，其中13號色譜峰保留時間相對居中，與相鄰色譜峰分離度好，峰高和峰面積較適中，因此選擇13號峰（黃芩苷）作為參照峰，計算其他共有峰的相對峰面積和相對保留時間[13-14]。結(jié)果29個共有峰的相對保留時間RSD均小于1.90 %（n=15），相對峰面積RSD為0.90 %～21.27 %，具體數(shù)據(jù)見表1。對照品溶液色譜圖見圖2。

表1 15批加味香連丸共有峰相對峰面積

圖2 混合對照品溶液HPLC圖譜

2.5 加味香連丸中11個成分含量測定

2.5.1 色譜條件 同2.1項下色譜條件。

2.5.2 混合對照品溶液的制備 按2.2項下方法制備。

2.5.3 供試品溶液的制備 按2.3項下方法制備。

2.5.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液0.2，1，2，4，8，10 ml，置10 ml量瓶，用70 %甲醇溶液定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以樣品濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程見表2。

表2 回歸方程和線性范圍

2.5.5 精密度試驗 取加味香連丸供試品（批號：2080882），按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖及11個化合物峰面積。結(jié)果芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素峰面積RSD分別為0.96 %，1.12 %，0.88 %，1.36 %，1.41 %，1.22 %，1.57 %，0.69 %，1.01 %，1.24 %，1.18 %（n=6），說明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗 取加味香連丸供試品（批號：2080882），按2.3項下方法制備供試品溶液，室溫條件放置0，4，8，16，20，24 h，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖及11個化合物峰面積。結(jié)果芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素峰面積RSD分別為1.15 %，0.77 %，0.92 %，1.03 %，1.41 %，1.11 %，0.89 %，1.36 %，1.44 %，1.25 %，1.39 %（n=6），表明室溫條件下供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7 重復(fù)性試驗 取同一批加味香連丸供試品（批號：2080882）6份，每份約1.0 g，精密稱定，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖及11個化合物峰面積。結(jié)果芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素平均含量分別為1.041，5.996，1.772，1.163，0.673，0.642，9.051，13.321，0.822，2.287，0.269 mg/g，RSD分別為1.16 %，0.55 %，0.34 %，0.61 %，0.77 %，0.59 %，1.15 %，0.39 %，0.62 %，0.74 %，0.26 %（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.8 加樣回收試驗 取已知含量的加味香連丸供試品9份，研細(xì)，每份取約0.5 g，精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，分成3組，分別精密加入含芍藥苷（0.208 mg/ml）、柚皮苷（1.201 mg/ml）、新橙皮苷（0.355 mg/ml）、阿魏酸（0.233 mg/ml）、木香烴內(nèi)酯（0.135 mg/ml）、去氫木香內(nèi)酯（0.129 mg/ml）、黃芩苷（1.813 mg/ml）、鹽酸小檗堿（2.668 mg/ml）、和厚樸酚（0.165 mg/ml）、厚樸酚（0.458 mg/ml）、延胡索乙素（0.054 mg/ml）混合對照品溶液3，2.5，2 ml，按2.3項下方法制備，按2.1項下色譜條件分析，記錄色譜圖及峰面積，計算11個化合物的平均加樣回收率及RSD值。結(jié)果芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素平均加樣回收率分別為102.3 %，96.2 %，101.6 %，102.7 %，100.8 %，98.4 %，101.9 %，102.5 %，98.2 %，103.7 %，102.9 %，RSD分別為0.55 %，2.29 %，1.07 %，0.84 %，1.01 %，1.28 %，1.61 %，0.72 %，0.91 %，0.72 %，1.49 %（n=9）。具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 加樣回收結(jié)果（n=9）

2.5.9 樣品含量測定 取15批加味香連丸供試品，精密稱定，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件分析，記錄色譜圖及峰面積，并計算11個化合物的含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品測定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

本文采用DAD檢測器，在190～400 nm全波長掃描加味香連丸供試品溶液，發(fā)現(xiàn)在波長280 nm處色譜峰數(shù)量較多，但芍藥苷在230 nm波長處、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯在225 nm波長處有最大吸收，為使各成分及指紋圖譜均在其最大吸收波長處進(jìn)行測定，采用不同時段切換不同檢測波長的方法，即0～8 min，12～29 min和32～80 min檢測波長為280 nm，檢測26個共有峰及柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素，8～12 min檢測波長為230 nm，檢測芍藥苷，29～32 min檢測波長為225 nm，檢測木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯。

3.2 洗脫條件的選擇

本研究首先考察了不同比例乙腈-水、甲醇-水及乙腈-甲醇-水流動相系統(tǒng)對加味香連丸各成分的分離效果，發(fā)現(xiàn)甲醇作為有機(jī)相時，供試品溶液色譜圖中色譜峰較少，基線不平穩(wěn)，柱壓較高，而乙腈作為有機(jī)相不僅洗脫能力強(qiáng)、基線平穩(wěn)、柱壓低，且色譜峰峰形較好；水作為水相時，目標(biāo)成分木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯分離度不佳，水相更換為0.05 %磷酸水溶液后，兩者可達(dá)到分離度要求，其他各色譜峰分離度也較好，基線平穩(wěn)，峰形較好，指紋圖譜色譜峰數(shù)量多，故選用乙腈-0.05 %磷酸作為流動相梯度洗脫系統(tǒng)。

3.3 供試品制備方法優(yōu)化

本研究以加味香連丸指紋圖譜中色譜峰數(shù)量、相鄰色譜峰分離效果及11個待測化合物提取率為指標(biāo)，依次對提取方式（超聲提取、加熱回流提取、冷浸提?。?、提取溶劑（水、稀乙醇、70 %乙醇、95 %乙醇、甲醇、70 %甲醇、50 %甲醇）進(jìn)行考察，結(jié)果顯示70 %甲醇溶液超聲提取色譜峰較多，相鄰色譜峰分離效果較好，11個化合物的提取率較高；同時對70 %甲醇溶液超聲提取時間（15，30，40，60 min）考察，結(jié)果顯示提取時間為30 min時27個共有峰峰面積及11個化合物提取率最大，故最終確定70 %甲醇超聲提取30 min作為加味香連丸供試品溶液的制備方法。

3.4 測定結(jié)果分析

15批加味香連丸相似性評價結(jié)果顯示，樣品與對照指紋圖譜間相似度均大于0.99，說明加味香連丸批間差異較小，質(zhì)量較穩(wěn)定，共生成29個共有峰，通過與對照品比對指認(rèn)了其中11個共有峰。11個化合物含量測定結(jié)果顯示，芍藥苷含量為0.652～1.618 mg/g、柚皮苷含量為3.843～6.058 mg/g、新橙皮苷含量為0.658～1.775 mg/g、阿魏酸含量為0.766～1.259 mg/g、木香烴內(nèi)酯含量為0.368～0.781 mg/g、去氫木香內(nèi)酯含量為0.433～0.761 mg/g、黃芩苷含量為6.310～9.807 mg/g、鹽酸小檗堿含量為10.512～13.461 mg/g、和厚樸酚含量為0.614～0.941 mg/g、厚樸酚含量為1.365～2.521 mg/g、延胡索乙素含量為0.169～0.469 mg/g。根據(jù)《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定加味香連丸“每1 g含黃連、黃柏以鹽酸小檗堿計，不得少7.0 mg”，本研究鹽酸小檗堿測定結(jié)果符合上述規(guī)定。

本研究建立了加味香連丸HPLC指紋圖譜，并同時指認(rèn)和測定了芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素11個化合物的含量，方法穩(wěn)定簡單，能系統(tǒng)快速地評價該制劑的質(zhì)量，對全面控制加味香連丸的質(zhì)量具有指導(dǎo)意義。