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    賴氨酸磷酸氫鈣顆粒現(xiàn)行質(zhì)量標準存在的問題及改進建議

    2022-08-08 03:21:00李春煥鞏麗萍薛維麗張乃斌杭寶建咸瑞卿
    食品與藥品 2022年4期
    關(guān)鍵詞:專屬性磷酸氫鈣溶出度

    李春煥,鞏麗萍,石 峰,薛維麗,張乃斌,杭寶建,咸瑞卿

    (山東省食品藥品檢驗研究院 國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室 山東省仿制藥一致性評價工程技術(shù)研究中心,山東 濟南 250101)

    賴氨酸磷酸氫鈣顆粒是由鹽酸賴氨酸、磷酸氫鈣與輔料制成的復方制劑,臨床主要用于促進幼兒生長發(fā)育及兒童和孕婦鈣質(zhì)的補充[1-4]。在國家評價性抽驗工作中,我們通過對該品種的質(zhì)量標準進行研究,發(fā)現(xiàn)現(xiàn)行中國藥典、美國藥典、英國藥典、歐洲藥典、日本藥局方中均收載有鹽酸賴氨酸和磷酸氫鈣原料藥,但均未收載該制劑。目前,我國有16家具備批準文號的生產(chǎn)企業(yè),其中15家執(zhí)行國家標準WS-10001-(HD-0389)-2002,1家執(zhí)行注冊標準YBH00102018。在本次國家評價性抽驗工作中,我們對全國范圍內(nèi)抽取的167批賴氨酸磷酸氫鈣顆粒進行了法定標準檢驗和探索性研究工作,發(fā)現(xiàn)現(xiàn)行質(zhì)量標準中賴氨酸鑒別專屬性差、磷酸鹽與鈣鹽的鑒別反應(yīng)靈敏度低、干燥失重檢查和溶出度檢查缺失、賴氨酸含量測定方法專屬性差及限度設(shè)置不合理等問題。為改進和完善賴氨酸磷酸氫鈣顆粒的質(zhì)量標準,我們通過實驗分析和比較,對“賴氨酸鑒別”、“磷酸鹽與鈣鹽的鑒別反應(yīng)”及“賴氨酸含量測定方法”進行了修改,并增訂了“干燥失重檢查”和“溶出度檢查”。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    Agilent 1260 Infinity II高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司);Mettler Toledo XSE205DU電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)

    1.2 試藥

    鹽酸賴氨酸對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:140673-202010,含量:100.0 %);甲醇、乙腈為色譜純,水為Millipore Q-POD?制備的純化水,其他試劑均為分析純。

    2 賴氨酸鑒別

    2.1 存在的問題

    現(xiàn)行質(zhì)量標準均采用茚三酮與α-氨基酸加熱反應(yīng)產(chǎn)生藍紫色物質(zhì)的原理來鑒別賴氨酸,該方法的專屬性不強,無法區(qū)別賴氨酸與其他氨基酸,需進一步建立專屬性強、靈敏性高的賴氨酸鑒別方法。

    2.2 方法改進

    采用柱前衍生-高效液相色譜法(HPLC)對賴氨酸進行鑒別。

    2.2.1 溶液制備

    2.2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取鹽酸賴氨酸對照品12 mg,置100 ml量瓶中,加水約30 ml,超聲5 min,用水稀釋至刻度,搖勻,即得。

    2.2.1.2 常見氨基酸混合對照品溶液制備 精密稱取鹽酸半胱氨酸14.40 mg,酪氨酸21.15 mg,異亮氨酸15.20 mg,鹽酸組氨酸24.55 mg,甲硫氨酸18.00 mg,苯丙氨酸22.30 mg,亮氨酸16.50 mg,蘇氨酸21.85 mg,纈氨酸15.00 mg,絲氨酸19.95 mg,天冬氨酸16.85 mg,鹽酸賴氨酸22.95 mg,谷氨酸18.45 mg,精氨酸25.45 mg,丙氨酸10.11 mg,脯氨酸16.93 mg,鹽酸羥賴氨酸14.31 mg,甘氨酸9.59 mg,羥脯氨酸19.38 mg,鹽酸鳥氨酸22.85 mg,分別置50 ml量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,分別取2.5 ml,置同一25 ml量瓶中,制成20種氨基酸的混合對照品溶液。

    2.2.1.3 供試品溶液制備 精密稱取樣品120 mg(相當于鹽酸賴氨酸12 mg),置100 ml量瓶中,加水約30 ml,超聲5 min,用水稀釋至刻度,搖勻,濾過,即得。

    2.2.1.4 衍生試劑制備 取2, 4-二硝基氟苯(凝點為25~28 ℃)2 ml,加乙腈至100 ml,搖勻,即得(需避光保存)。

    2.2.2 衍生方法 取對照品溶液和供試品溶液各1 ml,分別置10 ml量瓶中,加入0.5 mol/L碳酸氫鈉溶液1 ml及衍生試劑0.2 ml,混勻,置暗處,60 ℃水浴放置60 min,取出放冷至室溫,加pH 7.0磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀0.68 g,加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液29.1 ml,加水稀釋至100 ml,即得)稀釋至刻度,搖勻,取10 μl注入高效液相色譜儀。

    2.2.3 色譜條件 流動相:甲醇-0.05 mol/L醋酸鈉緩沖液(用稀醋酸調(diào)節(jié)pH至6.8±0.05)(65:35);流速:1 ml/min;色譜柱:Thermo BDS HYPERSIL C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm;150 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫30 ℃;檢測器:紫外檢測器,檢測波長:360 nm。

    2.3 結(jié)果

    2.3.1 擬定標準 供試品溶液主峰的保留時間應(yīng)與對照品溶液主峰的保留時間一致。

    基于卸點填埋工藝與暴露面積的異味控制,提出導入“面量比”的績效考核方式,即每天作業(yè)面積與垃圾量有合理比例關(guān)系,具體評價指標如表4所示。

    2.3.2 賴氨酸鑒別結(jié)果 167批供試品溶液主峰的保留時間均與對照品溶液主峰的保留時間一致,合格率100 %。

    3 磷酸鹽與鈣鹽的鑒別

    3.1 存在的問題

    WS-10001-(HD-0389)-2002標準中磷酸鹽與鈣鹽的鑒別反應(yīng)遵循中國藥典2020年版四部通則0301,其對磷酸鹽鑒別反應(yīng)(1)描述如下:取供試品的中性溶液,加硝酸銀試液,即生成淺黃色沉淀;分離,沉淀在氨試液或稀硝酸中均易溶解[5]。

    首先,調(diào)節(jié)溶液為中性后,因磷酸氫鈣在中性水溶液中不溶,因此濾液中鈣離子和磷酸氫根離子極少,導致鑒別反應(yīng)不靈敏;其次鹽酸賴氨酸中的氯離子加硝酸銀試液后會產(chǎn)生大量白色氯化銀沉淀,生成淺黃色磷酸銀沉淀的現(xiàn)象不明顯;最后取沉淀加氨試液全溶,但加稀硝酸溶液后不能完全溶解,鑒別反應(yīng)不靈敏,以上反應(yīng)現(xiàn)象見圖1。因此現(xiàn)行賴氨酸磷酸氫鈣顆粒質(zhì)量標準中的磷酸鹽和鈣鹽的鑒別方法靈敏度低,可行性差,鑒別現(xiàn)象不易觀察,需對其進行修訂。

    圖1 磷酸鹽鑒別反應(yīng)(1)現(xiàn)象

    3.2 改進的方法

    取本品的細粉適量(約相當于磷酸氫鈣50 mg),加水20 ml,充分振搖,離心過濾,取沉淀,加稀硝酸5 ml和水20 ml溶解,溶液顯鈣鹽和磷酸鹽的鑒別反應(yīng)。

    3.3 結(jié)果與分析

    采用修訂后的方法對國內(nèi)10家生產(chǎn)企業(yè)的167批樣品進行磷酸鹽和鈣鹽的鑒別,結(jié)果均呈正反應(yīng),反應(yīng)現(xiàn)象明顯,易于判斷。

    本方法取樣品加適量水溶解,離心過濾,可除去鹽酸賴氨酸,避免了氯離子對磷酸鹽鑒別的干擾。沉淀主要為磷酸氫鈣,分離后用適量稀硝酸溶解,進行磷酸鹽和鈣鹽的鑒別,方法簡單,現(xiàn)象明顯,易于觀察,靈敏度高。

    4 鹽酸賴氨酸含量測定

    4.1 存在的問題

    現(xiàn)行質(zhì)量標準采用紫外-可見分光光度法(茚三酮比色法)測定賴氨酸含量,企業(yè)調(diào)研及實際檢驗工作中均發(fā)現(xiàn),該方法受試劑、溫度、反應(yīng)時間等因素影響較大,專屬性不強,且限度范圍設(shè)置過寬(85.0 %~115.0 %),測定結(jié)果不能客觀準確地反映產(chǎn)品中的真實含量。

    4.2 改進的方法

    通過參考文獻資料[6-10],將賴氨酸含量測定方法修訂為柱前衍生-HPLC法,按2.2項下步驟進行衍生化并進樣測定。該方法專屬性強,準確度高。

    4.2.1 耐用性考察 選擇不同型號色譜柱進行耐用性考察,結(jié)果見表1。使用不同廠家的不同規(guī)格色譜柱,鹽酸賴氨酸色譜峰保留時間、理論板數(shù)符合要求,表明色譜條件耐用性良好。

    表1 鹽酸賴氨酸含量測定耐用性考察結(jié)果

    4.2.2 專屬性 空白輔料在對照品主峰保留時間處未有色譜峰出現(xiàn);相同條件下處理亮氨酸等20種氨基酸,僅亮氨酸保留時間與賴氨酸較為接近,兩峰分離度為2.0;因此本方法中空白輔料、衍生化試劑和實驗過程中用到的其他試劑及其他氨基酸對賴氨酸的鑒別均無干擾,該方法對鑒別鹽酸賴氨酸具有較好的專屬性。色譜圖見圖2~4。

    圖2 典型樣品色譜圖

    圖3 空白輔料色譜圖

    圖4 20種氨基酸混合對照品色譜圖

    4.2.3 線性及范圍 精密稱取對照品60.02 mg,置5 ml量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成每1 ml約含12 mg的鹽酸賴氨酸對照品儲備液。分別精密量取上述對照品儲備液10,20,50,100,150,200,300,400 μl,置10 ml量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,作為對照品系列溶液。按2.2項下方法,分別取對照品系列溶液注入液相色譜儀,測定,以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,進行線性回歸?;貧w方程:Y=10.238X-18.317,r=1.0000。結(jié)果表明,在12~480 μg/ml范圍內(nèi)鹽酸賴氨酸濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

    4.2.4 精密度 精密吸取鹽酸賴氨酸對照品溶液(0.1200 mg/ml)10 μl,注入液相色譜儀,連續(xù)進樣6次,測其峰面積,計算得RSD=0.19 %,表明儀器精密度良好。

    不同分析人員,在不同日期,取同廠家同批樣品(批號:20200103),按2.2.1.3項下方法制備供試品溶液,按2.2.2項下方法進行樣品衍生,按2.2.3項下色譜條件,用不同儀器進樣測定,平均含量為97.62 %,RSD=1.22 %(n=12),表明方法中間精密度良好。

    4.2.5 穩(wěn)定性 精密吸取供試品溶液10 μl,注入液相色譜儀,分別于4 h、20 h及24 h進樣一次,測定鹽酸賴氨酸色譜峰的峰面積,計算峰面積的RSD,觀察檢測過程中待測成分的穩(wěn)定性。結(jié)果,峰面積RSD為1.04 %,表明24 h內(nèi)供試品穩(wěn)定性良好,能滿足測定需要。

    4.2.6 重復性 取樣品約120 mg,精密稱定,按2.2.1.3項下方法,平行制備6份供試品溶液。精密吸取上述供試品溶液10 μl,注入液相色譜儀,以外標法計算鹽酸賴氨酸。結(jié)果,峰面積RSD為1.06 %,表明方法的重復性良好。

    4.2.7 回收率 按顆粒劑處方制備不含鹽酸賴氨酸的空白顆粒(含磷酸氫鈣10 g,蔗糖80 g)。分別稱取9份混合均勻的空白顆粒適量(約110 mg),分為3組,置100 ml量瓶中,每組分別加入對照品儲備液(精密稱取對照品60.04 mg,置5 ml量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對照品儲備液)0.5,1.0,1.5 ml,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,制得3個濃度水平的9份供試品溶液,按2.2.1.3項下方法處理,按2.2.2項下方法進行樣品衍生,按2.2.3項下色譜條件進樣測定,結(jié)果見表2。結(jié)果表明,測定方法的回收率良好。

    表2 加標回收率考察結(jié)果

    4.2.8 檢出限與定量限 精密量取對照品溶液(0.1201 mg/ml)1 ml,置100 ml量瓶中,加水稀釋至刻度,混勻,精密量取3 ml和10 ml,分別置100 ml量瓶中,加水稀釋至刻度,混勻,分別得濃度為0.036,0.12 μg/ml的對照品溶液。衍生化后取10 μl進樣測定,信噪比分別為3.1和10.4,得鹽酸賴氨酸的檢出限和定量限分別為0.036,0.12 μg/ml(以衍生前鹽酸賴氨酸計)。

    4.3 結(jié)果與分析

    分別根據(jù)現(xiàn)行質(zhì)量標準W S-1 0 0 0 1-(HD-0389)-2002(UV法)及擬定標準(柱前衍生-HPLC)測定10家生產(chǎn)企業(yè)的167批樣品,結(jié)果顯示,擬定方法專屬性強、重現(xiàn)性好,能有效反映產(chǎn)品質(zhì)量,各批次樣品檢測結(jié)果均在90.0 %~110.0 %范圍,因此限度修訂為“90.0 %~110.0 %”較為合理。法定標準的檢測結(jié)果顯示其含量分布范圍較改進后方法寬,且現(xiàn)行標準方法采用紫外-可見分光光度法,專屬性不強,因此建議采用靈敏度高、選擇性好的柱前衍生HPLC法測定樣品中賴氨酸的含量。

    5 增訂干燥失重檢查

    賴氨酸磷酸氫鈣顆粒為含糖顆粒,根據(jù)《中國藥典》2020年版制劑通則顆粒劑項下要求需檢查干燥失重,現(xiàn)行國家標準WS-10001-(HD-0389)-2002無干燥失重檢查項,注冊標準YBH00102018收載了干燥失重檢查。因此我們對收集的所有顆粒劑樣品,按《中國藥典》2020年版四部“干燥失重”檢查法測定顆粒劑干燥失重,考察各企業(yè)工藝穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)1批不合格的樣品。因此增訂賴氨酸磷酸氫鈣顆?!案稍锸е亍钡臋z查是有必要的。

    根據(jù)探索性研究,我們擬增訂賴氨酸磷酸氫鈣顆粒干燥失重測定方法:取本品,在80 ℃減壓干燥至恒重,減失重量不得過2.0 %[5]。

    6 增訂溶出度檢查

    6.1 存在的問題

    溶出度是口服固體制劑的重點關(guān)注項目,是體現(xiàn)藥品有效性的重要指標,溶出曲線反映了藥品的溶出速率[5,11]。賴氨酸磷酸氫鈣顆粒為混懸顆粒,需進行溶出度檢查,但現(xiàn)行國家質(zhì)量標準WS-10001-(HD-0389)-2002中無溶出度檢查項,注冊標準YBH00102018雖收載了溶出度檢查方法,但存在溶出條件不合理、測定方法專屬性不強等缺點。此次我們探索賴氨酸磷酸氫鈣顆粒的溶出介質(zhì)、溶出方法及溶出限度,建立合適的溶出條件及檢測方法,增訂溶出度檢查項。

    6.2 改進的方法

    擬增訂賴氨酸磷酸氫鈣顆粒溶出度測定方法:取本品,照溶出度與釋放度測定法[5]以鹽酸溶液(9→1000)900 ml為溶出介質(zhì),轉(zhuǎn)速為每分鐘50轉(zhuǎn),依法操作,經(jīng)45 min時,取溶液適量,濾過,取續(xù)濾液適量,備用。

    6.2.1 鹽酸賴氨酸溶出量測定及限度要求 精密量取上述濾液2 ml,加水定容至10 ml,搖勻,作為供試品溶液。精密量取上述供試品溶液1 ml,照改進后的含量測定方法,依法測定,計算每袋溶出量,限度為標示量的80 %。

    6.2.2 磷酸氫鈣溶出量測定及限度要求 精密量取上述濾液5 ml,置50 ml量瓶中,加5 %鑭溶液(取氧化鑭6.6 g,加鹽酸10 ml使溶解,加水稀釋至100 ml,搖勻)1 ml,加0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。取磷酸氫鈣對照品約25 mg,精密稱定,置50 ml量瓶中,加0.1 mol/L鹽酸溶液使溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取4.5 ml、5.0 ml、5.5 ml,分別置50 ml量瓶中,各加5 %鑭溶液1 ml,分別用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度,搖勻,作為對照品溶液。取供試品溶液與對照品溶液,照原子吸收分光光度法(中國藥典2020年版四部通則0406第一法)[5],在422.7 nm的波長處測定,計算每袋的溶出量,限度為標示量的80 %。

    6.3 方法學研究

    6.3.1 方法的選擇 注冊標準YBH00102018采用籃法,但未收集到該企業(yè)的樣品,未對該方法的適用性進行研究。部分其他企業(yè)由于粒度較小,采用籃法時,顆粒或粉末易從籃網(wǎng)漏出,不便于操作,因此采用槳法。

    6.3.2 溶出介質(zhì)的選擇 采用槳法,轉(zhuǎn)速為50轉(zhuǎn)/min,分別選擇水、0.1 mol/L鹽酸溶液、醋酸鹽緩沖液(pH 4.5)、磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)為溶出介質(zhì),體積均為900 ml,考察賴氨酸磷酸氫鈣顆粒中鹽酸賴氨酸和磷酸氫鈣的溶出行為。

    由于鹽酸賴氨酸易溶于水,磷酸氫鈣在水中不溶、在稀鹽酸或稀硝酸中易溶。因此,鹽酸賴氨酸在4種溶出介質(zhì)中均能較快溶出(見圖5)。磷酸氫鈣在水、磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)中,60 min時溶出度均小于10 %,在醋酸鹽緩沖液(pH 4.5)中60 min時溶出度小于45 %,在0.1 mol/L鹽酸溶液中30 min時溶出度超過80 %(見圖6)。以上結(jié)果顯示賴氨酸和磷酸氫鈣在0.1 mol/L鹽酸溶液中溶出良好,故選擇900 ml的0.1 mol/L鹽酸溶液作為溶出介質(zhì)。

    圖5 不同溶出介質(zhì)中鹽酸賴氨酸溶出曲線

    圖6 不同溶出介質(zhì)中磷酸氫鈣溶出曲線

    6.3.3 轉(zhuǎn)速的選擇 采用槳法,以900 ml 0.1mol/L鹽酸溶液為溶出介質(zhì),比較樣品在75轉(zhuǎn)/min和50轉(zhuǎn)/min兩種轉(zhuǎn)速下的溶出行為(見圖7、圖8)。結(jié)果顯示在75轉(zhuǎn)/min條件下鹽酸賴氨酸和磷酸氫鈣的溶出速度過快,20 min時溶出量均超過90 %;在50轉(zhuǎn)/min轉(zhuǎn)速下即可較快溶出,所以選擇50轉(zhuǎn)/min進行試驗。

    圖7 不同轉(zhuǎn)速下鹽酸賴氨酸溶出曲線

    圖8 不同轉(zhuǎn)速下磷酸氫鈣溶出曲線

    6.4 結(jié)果與分析

    參考167批樣品的檢測數(shù)據(jù),我們將鹽酸賴氨酸和磷酸氫鈣的溶出度限度均設(shè)定為不低于標示量的80 %。用擬定方法測定167批顆粒劑的溶出度,合格率為100 %。對檢驗結(jié)果進行匯總分析后發(fā)現(xiàn),167批顆粒劑樣品的鹽酸賴氨酸平均溶出度為98.5 %,RSD為2.38 %;磷酸氫鈣平均溶出度為92.9 %,RSD為2.82 %。各生產(chǎn)廠家鹽酸賴氨酸的溶出度均高于磷酸氫鈣,與鹽酸賴氨酸極易溶解有關(guān)。不同生產(chǎn)廠家之間兩種成分的溶出度離散程度均較大,因此有必要在標準中增訂溶出度項,確保產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。

    7 小結(jié)

    質(zhì)量標準是藥品質(zhì)量控制的依據(jù),檢驗項目設(shè)置的合理性與方法的科學性、先進性體現(xiàn)了藥品的內(nèi)在質(zhì)量。通過對賴氨酸磷酸氫鈣顆粒進行國家評價性抽驗工作,提示賴氨酸磷酸氫鈣顆?,F(xiàn)行質(zhì)量標準不能滿足質(zhì)量控制的要求,建議對現(xiàn)行質(zhì)量標準進行統(tǒng)一和完善,修訂鑒別項目、增訂缺失的檢驗項目、采用專屬性強、靈敏度高的鑒別和含量測定方法,設(shè)置合理的含量限度。

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