CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)煙草CENH3基因突變體的獲得

韓平安 ，孫瑞芬 ，常 悅 ，唐寬剛 ，王 良 ，聶利珍 ，張自強 ，梁亞暉 ，吳新榮 ，李曉東

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)甜菜品種遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

CENH3是組蛋白H3的一個變體，其特異性定位于著絲粒上[1]，可募集其他著絲粒蛋白并與之形成復(fù)合體，在有絲分裂和減數(shù)分裂時參與著絲粒的組裝并和紡錘絲連接，對染色體的正常分離與傳遞有決定作用[2-4]。編碼著絲粒特異性組蛋白基因CENH3是近年來利用誘導(dǎo)系誘導(dǎo)單倍體的一個研究熱點[5]。RAVI等[6]通過對擬南芥染色體著絲粒的突變體研究，開發(fā)出了通過著絲粒介導(dǎo)使父本或母本染色體選擇性丟失，從而獲得單倍體的方法。擬南芥CENH3突變體具有致死性，利用組蛋白H3的N末端尾部替換CENH3的N末端尾部，同時將綠色熒光蛋白（GFP）添加到N端終點，形成的GFPtailswap蛋白，定位于著絲粒上，該結(jié)構(gòu)克服了CENH3突變體的致死表型。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得GFPtailswap Cenh3-/-基因型植株，該植株雄性不育但是能夠產(chǎn)生少量花粉，作為父本與野生型進行雜交能夠產(chǎn)生5%的母本單倍體，作為母本與野生型進行雜交能夠產(chǎn)生25%～50%的父本單倍體[7]。CENH3在不同物種都具有高度進化保守性，對CENH3基因進行修飾獲得單倍體誘導(dǎo)系同樣適用于其他作物[8-11]。CRISPR/Cas9技術(shù)是一種有效的基因組編輯工具[12-16]，可以直接改良農(nóng)藝性狀控制基因，具有精準(zhǔn)高效、構(gòu)建簡單、操作簡便、成本低廉等特點，現(xiàn)已成功應(yīng)用于模式植物擬南芥、煙草以及水稻、小麥、玉米、大豆、高粱等作物[17-21]。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為不同作物沉默著絲粒特異性組蛋白CENH3創(chuàng)造單倍體誘導(dǎo)系提供了可能。對玉米CENH3進行遺傳修飾，成功獲得單倍體，證明了CENH3-tailswap互補系統(tǒng)可以在玉米上作為單倍體誘導(dǎo)系[22-23]。通過篩選被基因組編輯的TaCENH3α-異等位基因組合，獲得了可用于小麥商業(yè)化的父系單倍體誘導(dǎo)系，誘導(dǎo)率達7%[24]。對擬南芥CENH3進行點突變可以獲得單倍體誘導(dǎo)系[7]。本研究以煙草CENH3基因為編輯目標(biāo)，構(gòu)建CRISPR/Cas9編輯載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行煙草遺傳轉(zhuǎn)化獲得CENH3突變株系，從而為采用CRISPR/Cas9-CENH3技術(shù)體系創(chuàng)建甜菜等作物的單倍體誘導(dǎo)系奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本氏煙草（Nicotiana benthamiana）無菌苗、載體pBWA（V）K和 pBWA（V）-Cas9、EHA105農(nóng)桿菌菌株由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院甜菜分子育種課題組保存。試驗所用試劑（盒）為TaKaRa產(chǎn)品。6 000 bp DNA marker、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶Eco31Ⅰ、LguⅠ、EcoRⅤ等均購自武漢伯遠生物科技有限公司，大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α購自天根生化科技（北京）有限公司；農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞EHA105購自北京華越洋生物有限公司，其他常規(guī)試劑主要購自TaKaRa公司。引物由南京金斯瑞公司合成，其序列見表1。

1.2 CENH3基因靶位點序列的設(shè)計及載體構(gòu)建

1.2.1 CENH3基因靶標(biāo)序列

根據(jù)煙草 CENH3基因（LOC107795199）cDNA保守序列設(shè)計2個靶標(biāo)以提高編輯效率，靶標(biāo)1序列：agagcactgagctgttgatcagg，靶標(biāo) 2序列：gcttgttcgtgaaattgcacagg。擴增含2個靶標(biāo)序列的sgRNA引物（1F/1R和2F/2R，并引入Eco31Ⅰ酶切位點），序列見表1。

表1 引物信息

1.2.2 sgRNA1和sgRNA2獲得

靶標(biāo)序列較短，故通過引物變性退火就可以得到目的序列。sgRNA1 反應(yīng)體系（50 μL）：ddH2O 40 μL，引物 1F 5 μL，引物 1R 5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，55℃10 min，14℃5 min，同樣方法獲得sgRNA2片段。

1.2.3 CENH3靶標(biāo)中間載體構(gòu)建

1.2.3.1 pBWA（V）-Cas9/CENH3-B1 構(gòu)建

用Eco31Ⅰ分別酶切目的片段sgRNA1和空載體pBWA（V）-Cas9（細菌抗性為卡納霉素，植物抗性為潮霉素）并用T4連接酶連接酶切片段。酶切連接反應(yīng)體系（10.0 μL）：10×buffer 1.0 μL，空載體 1.5 μL，sgRNA1 片段 2.0 μL，Eco31 Ⅰ 0.5 μL，T4-ligase 0.5 μL，ddH2O 4.5 μL?；靹蚝螅?7 ℃反應(yīng)2 h。取5 μL連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，37℃培養(yǎng)16 h后獲得白色單菌落，抽提質(zhì)粒，測序檢測目的片段，重組載體命名為pBWA（V）-CAS9/CENH3-B1。

1.2.3.2 pBWD/CENH3-B2構(gòu)建

用Eco31Ⅰ分別酶切目的片段sgRNA2和空載體pBWD（LB）DNAi（AT），并用T4連接酶連接酶切片段。酶切連接反應(yīng)體系（10.0 μL）：10×buffer 1.0 μL，空載體 1.5 μL，sgRNA2 片段 2.0 μL，Eco31 Ⅰ0.5 μL，T4-ligase 0.5 μL，ddH2O 4.5 μL。反應(yīng)條件和轉(zhuǎn)化大腸桿菌同1.2.3.1，測序合格后，重組載體命名為pBWD-CENH3-B2。

1.2.4 雙靶標(biāo)載體CRISPR-Cas9/CENH3構(gòu)建

用LguⅠ酶切2個中間載體pBWA（V）-Cas9/CENH3-B1和pBWD/CENH3-B2，并用T4連接酶進行連接。酶切連接反應(yīng)體系（10.0 μL）：10×T4 buffer 1.0 μL，pBWA（V）-Cas9/CENH3-B1 1.0 μL，pBWD/CENH3-B2 1.5 μL，Lgu I 0.5 μL，T4-ligase 0.5 μL，ddH2O 5.5 μL。均勻后，37℃反應(yīng) 2 h。將 pBWD/CENH3-B2的酶切目的片段插入pBWA（V）-Cas9/CENH3-B1，獲得含有雙靶標(biāo)的重組載體命名為CRISPR-Cas9/CENH3。將雙靶標(biāo)重組載體CRISPRCas9/CENH3轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，用引物3F和3R進行菌落PCR擴增載體上的M13片段以檢測重組質(zhì)粒。提取1個PCR檢測陽性質(zhì)粒，用EcoRⅤ酶切進一步進行酶切鑒定。

1.3 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測

用含有編輯載體CRISPR-Cas9/CENH3的農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化煙草無菌苗葉片并誘導(dǎo)叢生芽產(chǎn)生，經(jīng)Zmpl篩選獲得抗性植株。提取抗性植株幼葉DNA，并以此為模板，用引物4F和4R擴增Cas9基因片段以檢測陽性植株。PCR反應(yīng)體系：2×PCR Mix 6.25 μL，4F/4R 引物各 0.50 μL，模板 DNA（50 ng/μL）1.00 μL，ddH2O 4.25 μL；反應(yīng)程序：94 ℃3 min；94 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。

1.4 目的基因拷貝數(shù)檢測

利用數(shù)字PCR（ddPCR）技術(shù)，檢測轉(zhuǎn)基因植株中CENH3基因的拷貝數(shù)。首先對CENH3基因的擴增引物5F/5R（表1）和內(nèi)參基因RNR2（拷貝數(shù)為1）的擴增引物6F/6R（表1）的特異性進行檢測。之后用特異引物5F和5R對PCR檢測陽性植株進行CENH3基因插入拷貝數(shù)檢測。ddPCR擴增體系（25.0 μL）：2×PerfeCTa Qpcr ToughMix UNG 5.0 μL，AlexaFluorTM6471.0 μL，EvaGreen20×inwater2.0 μL，上、下游引物各 0.4 μL，模板 2.0 μL，ddH2O 14.2 μL。數(shù)字 PCR擴增程序為94℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。每個樣品進行3個平行重復(fù)試驗。外源基因拷貝數(shù)=外源基因濃度/內(nèi)參基因濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 CENH3基因編輯載體構(gòu)建

提取2個中間載體pBWA（V）-Cas9/CENH3-B1和pBWD/CENH3-B2質(zhì)粒DNA，通過測序證實目的片段已正確插入。2個中間載體通過LguⅠ酶切并用T4連接酶后，獲得的雙靶標(biāo)編輯載體CRISPRCas9/CENH3經(jīng)PCR檢測M13片段，獲得條帶大小為857 bp（圖1a），符合預(yù)期。提取1個PCR檢測陽性質(zhì)粒進一步進行EcoRⅤ酶切鑒定，獲得5條大小正確的條帶，分別為 7 023、3 570、2 625、2 200、279 bp（圖1b），表明雙靶標(biāo)編輯載體CRISPR-Cas9/CENH3構(gòu)建成功。

圖1 CRISPR-Cas9/CENH3的PCR檢測（a）和酶切鑒定（b）

2.2 轉(zhuǎn)基因植株獲得及PCR檢測

用含有編輯載體CRISPR-Cas9/CENH3的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草獲得Zmpl抗性植株，隨機提取11株抗性植株葉片基因組DNA進行Cas9基因的PCR檢測，擴增片段大小均為577 bp，符合預(yù)期（圖2），初步判斷目的基因已整合到煙草基因組染色體上。

圖2 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測

2.3 CENH3突變體檢測

為了驗證靶標(biāo)序列是否發(fā)生突變，對轉(zhuǎn)基因煙草T0代植株和野生型CENH3基因靶序列進行擴增并測序分析。測序結(jié)果表明，11株轉(zhuǎn)基因植株中有6株為編輯植株（表2），編輯效率為54.5%。進一步分析表明，靶標(biāo)1未發(fā)生突變，靶標(biāo)2序列上發(fā)生4種突變類型，分別為單堿基插入純合突變（兩條染色體均插入1個堿基“T”，如1號和5號株系），一條染色體單堿基插入雜合突變（插入1個堿基“A”，如2號株系），單堿基插入雜合突變（其中一條染色體插入1個堿基“T”，另一條染色體插入1個堿基“C”，如4號株系），單堿基插入和多堿基缺失的雜合突變（其中一條染色體插入1個堿基“T”，另一條染色體缺失6個堿基“CAATTT”，如3號和6號株系）。

表2 轉(zhuǎn)基因株系突變類型

2.4 目的基因拷貝數(shù)檢測

利用ddPCR技術(shù)對6株突變體進行插入拷貝數(shù)檢測。首先以煙草RNR2為內(nèi)參基因，對目的基因CENH3的擴增引物（5F/5R）的特異性進行檢測。由圖3可知，2個基因?qū)?yīng)引物的陽性微滴（藍色帶）與陰性微滴（黑色帶）都能明顯區(qū)分，表明CENH3引物的特異性較好。其次，對ddPCR的重復(fù)性進行分析，所有樣品CENH3和RNR2基因的試驗有效微滴總數(shù)平均為24 050～27 924（表3），滿足微滴數(shù)字PCR微滴的分析要求，試驗中生成微滴的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.8%～3.6%（表3），小于25%，符合歐盟核酸定量檢測的要求，說明試驗中建立的微滴數(shù)字PCR體系微滴生成穩(wěn)定，重復(fù)性良好，數(shù)據(jù)可靠性高。對6株突變體進行拷貝數(shù)分析，結(jié)果表明，所有突變體均為低拷貝轉(zhuǎn)基因植株，CENH3基因的插入拷貝數(shù)均在 0.3～1.2（表 4）。

圖3 ddPCR引物特異性檢測

表3 引物ddPCR重復(fù)性檢測

表4 轉(zhuǎn)基因株系CENH3基因拷貝數(shù)檢測

3 討論和結(jié)論

基因編輯是探究基因功能的重要技術(shù)之一，通過對目的基因的定點敲除、添加或修飾探究特定基因的功能[25]。CRISPR/Cas9技術(shù)是目前主流基因編輯技術(shù)，因其具有載體構(gòu)建簡單易行、特異性好、打靶效率高等特點，該系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于作物改良育種[26]。

獲得單倍體的方法有很多，如體外誘導(dǎo)（雄配子體誘導(dǎo)和雌配子體誘導(dǎo)）、種間或種內(nèi)的選擇性雜交、對著絲粒特異性組蛋白編碼基因CENH3進行基因組編輯（CRISPR/Cas9）等均用于誘導(dǎo)單倍體的產(chǎn)生[27]。單倍體育種利用染色體加倍產(chǎn)生完全純合的雙單倍體，相比傳統(tǒng)育種是一種高效快速的植物育種方法[28-29]。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)直接修飾CENH3 在擬南芥[6]、玉米[30-31]和小麥[24]、甘藍[32]等植物上均獲得了單倍體植株。研究表明，擬南芥CENH3無效突變體具有致死性，將經(jīng)過遺傳修飾的CENH3導(dǎo)入該擬南芥突變體，可恢復(fù)植株的野生表型，轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株雜交可產(chǎn)生只含野生型基因組的單倍體[6]。

本研究以煙草CENH3為編輯目標(biāo)，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對CENH3進行定點編輯獲得了編輯植株，編輯效率為54.5%。從編輯效率來看，本研究設(shè)計的靶標(biāo)及構(gòu)建的編輯載體是合理有效的，實現(xiàn)了對煙草CENH3的定點編輯，為利用CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)進行甜菜CENH3基因編輯，為獲得甜菜單倍體誘導(dǎo)系奠定了基礎(chǔ)。