毛白楊雌、雄花蕾總黃酮含量及抗氧化活性的比較

李卓俊，吳翠，徐博，宋平平，劉震營(yíng)，巢志茂（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700）

毛白楊（Populus tomentosaCarrière）為楊柳科楊屬落葉大喬木，在華北地區(qū)有大量的種植，屬于常見(jiàn)的造林綠化樹(shù)種，其葉、樹(shù)皮和雄花序均可作為中藥使用。1977年版《中國(guó)藥典》中記載毛白楊干燥雄花序是中藥楊樹(shù)花的植物來(lái)源，具有化濕止痢的功效，用于治療細(xì)菌性痢疾和急性腸炎[1]。在《中藥大辭典》中記載，毛白楊樹(shù)皮具有清熱利濕的功效，主要用于治療赤白痢疾、日久不止、淋濁白帶、急性肝炎、支氣管炎、肺炎、蛔蟲(chóng)、習(xí)慣性便秘等[2]。臨床上使用毛白楊花、葉和樹(shù)皮用于治療急性菌痢、骨肉瘤、外傷感染[3-4]。楊樹(shù)花目前還用作獸藥，用于治療牛羊豬等的痢疾、腹瀉等疾病，并在山東等地有食用的歷史[5-7]。毛白楊的化學(xué)成分主要有黃酮類(lèi)、甾醇類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、酚及其苷類(lèi)[8-10]，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腹瀉、抑菌、抗氧化等藥理活性[11-13]。

雌雄異株植物是指在具有單性花的種子植物中，雌花和雄花長(zhǎng)在不同的植株中[14]。對(duì)于雌雄異株植物性別之間存在的理化性質(zhì)和藥效活性的差異的研究，早期僅見(jiàn)極少的報(bào)道[15]。有研究通過(guò)高效液相色譜指紋圖譜方法結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)毛白楊的樹(shù)皮進(jìn)行雌雄的比較發(fā)現(xiàn)，雌株中micranthoside 的含量高于雄株，而siebolside B、櫻花苷、異櫻花苷、isograndidentatin A 的含量低于雄株[16]。有研究通過(guò)頂空進(jìn)樣固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法對(duì)毛白楊花蕾的揮發(fā)性成分進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，雌株中2-環(huán)己烯-1-酮、苯甲酸芐酯和苯甲酸甲酯的含量高于雄株，而苯甲酸乙酯的含量低于雄株[17]。通過(guò)磁共振技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)毛白楊雌雄花蕾進(jìn)行化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)，雌雄花蕾間主要差異成分有胡蘿卜苷、β-谷甾醇、熊果酸和白樺脂酮酸，均為雄株中的含量高于雌株[18]。盡管存在一些成分含量高低不等的現(xiàn)象，但對(duì)于雌雄異株植物毛白楊的花蕾尚未見(jiàn)總黃酮含量及抗氧化活性差異的研究報(bào)道。

本文收集了成年毛白楊雌株和雄株的花蕾，通過(guò)亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測(cè)定了總黃酮的含量，通過(guò)DPPH 和ABTS 自由基清除法評(píng)價(jià)了體外抗氧化活性，并進(jìn)行了雌雄組之間的比較，為毛白楊的開(kāi)發(fā)利用了提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

于2020年2月23日至28日在北京市東城區(qū)東直門(mén)北大街、通教寺、民安小區(qū)、安定門(mén)東大街、青龍胡同和朝陽(yáng)區(qū)黃金苑等地點(diǎn)（東經(jīng)116°22'53'' ～116°26'57''， 北緯39°52'36'' ～39°57'17''）采集了成年毛白楊的花蕾，陰干。性別是通過(guò)該植株之后形成的花序和果實(shí)確認(rèn)。雌株花蕾標(biāo)記為F1 ～F11，雄株花蕾標(biāo)記為M1 ～M11。經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所巢志茂研究員鑒定為楊柳科植物毛白楊的干燥花蕾，樣品貯藏于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所。

亞硝酸鈉、氫氧化鈉（分析純，北京化工廠），硝酸鋁[分析純，福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司]，兒茶素對(duì)照品（批號(hào)：154-23-4，純度：98%，成都埃法生物科技有限公司），6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸[Trolox，貨號(hào)：238813，Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司，純度≥97%]，2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH，批號(hào)：D1915107，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度≥97%），2，2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽[ABTS，貨號(hào)：A1888，純度≥98%，Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司]；無(wú)水乙醇（分析純，天津市鼎盛鑫化工有限公司），甲醇（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司），純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

1.2 儀器

TU-1810 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Ohaus CP224C 型電子天平[精度：0.1 mg，奧豪斯（上海）儀器有限公司]；ME155DU型電子天平[精度：0.01 mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；DFT-50A 型手提式高速粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；DFD-700 型雙列四孔電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 將樣品粉碎，過(guò)40目篩。精密稱(chēng)取2.0 g 粉末，置于50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量后，水浴鍋上加熱回流30 min，放置室溫后，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。

2.1.2 顯色溶液的制備 精密稱(chēng)取亞硝酸鈉5.0 g，加水溶解并定容至100 mL 量瓶中，搖勻即得5%NaNO2溶液。精密稱(chēng)取硝酸鋁10.0 g，加水溶解并定容至100 mL 量瓶中，搖勻即得10%Al（NO3）3溶液。精密稱(chēng)取氫氧化鈉4.0 g，加水溶解并定容至100 mL 量瓶中，搖勻即得1 mol·L-1NaOH 溶液。精密稱(chēng)取DPPH 7.00 mg，加甲醇溶解并定容至100 mL 棕色量瓶中，搖勻即得0.07 mg·mL-1DPPH 溶液。精密稱(chēng)取ABTS 0.10 g，加水溶解并定容至25 mL 棕色量瓶中，搖勻即得7 mmol·L-1ABTS 溶液。精密稱(chēng)取過(guò)硫酸鉀0.19 g，加水溶解并定容至5 mL 棕色量瓶中，搖勻即得140 mmol·L-1K2S2O8溶液。

2.2 總黃酮的含量測(cè)定

參考相關(guān)文獻(xiàn)[19-20]并對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱(chēng)取兒茶素10.80 mg，加水溶解并定容至100 mL 量瓶中，搖勻，即得0.11 mg·mL-1兒茶素對(duì)照品溶液。精密吸取0.11 mg·mL-1兒茶素對(duì)照品溶液1.4、1.6、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于25 mL 量瓶中，加入6 mL 水，搖勻，加入5%NaNO21 mL，搖勻，靜置6 min，加入10%Al（NO3）31 mL，搖勻，靜置6 min，加入1 mol·L-1NaOH 溶液10 mL，加水至刻度線，搖勻，放置10 min 后測(cè)定，以70%甲醇為空白，在510 nm 的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以兒茶素對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 供試品溶液的測(cè)定 精密吸取毛白楊雌、雄花蕾的供試品溶液20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算毛白楊雌、雄花蕾中總黃酮的含量。

2.3 DPPH 自由基清除能力測(cè)定

參考相關(guān)文獻(xiàn)[21-22]并對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化。

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱(chēng)取Trolox 對(duì)照品10.14 mg，加甲醇溶解并定容至50 mL 棕色量瓶中，搖勻，即得0.20 mg·mL-1Trolox 對(duì)照品溶液。精密吸取Trolox 對(duì)照品溶液20、40、60、80、100、120 μL，置于5 mL 棕色量瓶中，加入0.07 mg·mL-1DPPH 溶液2 mL，搖勻，加甲醇至刻度線，搖勻，避光靜置30 min，在517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度為A0，計(jì)算DPPH 自由基清除率，以Trolox 對(duì)照品溶液的濃度（μmol·L-1）為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

DPPH 清除率（%）＝[1-（A1-A0）/A2]×100%

式中：A1為70%甲醇空白組的吸光度；A2為DPPH 溶液對(duì)照組的吸光度。

2.3.2 供試品溶液的測(cè)定 將“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液稀釋10 倍，精密吸取20 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度A0，平行測(cè)定3 次，取平均值，計(jì)算DPPH 自由基清除率。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合稀釋程度計(jì)算TEAC 值。TEAC 值是指在對(duì)DPPH 自由基相同的清除率情況下，樣品所對(duì)應(yīng)的Trolox 濃度。

2.4 ABTS 自由基清除能力測(cè)定

參考相關(guān)文獻(xiàn)[23-24]并對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化。精密吸取140 mmol·L-1K2S2O8溶液176 μL 置于具塞錐形瓶中，加入7 mmol·L-1ABTS 溶液10 mL，搖勻，室溫且黑暗條件下反應(yīng)16 h，即得ABTS 儲(chǔ)備液。使用前量取一定量的ABTS 儲(chǔ)備液，加無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)?34 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，直至稀釋后的吸光度為（0.70±0.02），即得ABTS 工作液。

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密稱(chēng)取Trolox 對(duì)照品0.24、1.02、1.50、2.14、2.60、3.16 mg 置于5 mL 棕色量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并定容，搖勻，即得0.048、0.204、0.300、0.428、0.520、0.632 mg·mL-1Trolox 對(duì)照品溶液。精密吸取各質(zhì)量濃度的Trolox 對(duì)照品溶液20 μL，置于5 mL 棕色量瓶中，加入ABTS 工作液3 mL，搖勻，避光反應(yīng)4 min，在734 nm 的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度為Aa，計(jì)算ABTS 自由基清除率，以Trolox 對(duì)照品溶液的濃度（mmol·L-1）為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

ABTS 清除率（%）＝[1-（Ab-Aa）/Ac]×100%

式中：Ab為70%甲醇空白組的吸光度；Ac為ABTS 工作液對(duì)照組的吸光度。

2.4.2 供試品溶液的測(cè)定 將“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液稀釋10 倍，精密吸取20 μL，按“2.4.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度Aa，平行測(cè)定3 次，取平均值，計(jì)算ABTS 自由基清除率。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合稀釋程度計(jì)算TEAC 值。TEAC 值是指在對(duì)ABTS 自由基相同的清除率情況下，樣品所對(duì)應(yīng)的Trolox 濃度。

3 結(jié)果

3.1 總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

按“2.2.1”項(xiàng)下方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為Y＝31.50X-0.01（r2＝0.9995），線性范圍為0.0069 ～0.0259 mg·mL-1。 按“2.2.2”項(xiàng)下方法對(duì)22 個(gè)毛白楊花蕾樣品進(jìn)行總黃酮含量的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 毛白楊花蕾的總黃酮含量的測(cè)定結(jié)果(n ＝3)Tab 1 Total flavonoid content of flower buds of Populus tomentosa(n ＝3)

3.2 DPPH 自由基清除法

按“2.3.1”項(xiàng)下方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為Y＝1.187×104X+2.53（r2＝0.9990），線性范圍為0.0081 ～0.0049 mg·mL-1。按“2.3.2”項(xiàng)下方法對(duì)22 個(gè)毛白楊花蕾樣品的DPPH 自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定，其TEAC 值結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 ABTS 自由基清除法

按“2.4.1”項(xiàng)下方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為Y＝105.25X+1.22（r2＝0.9998），線性范圍為0.0480 ～0.6320 mg·mL-1。按“2.4.2”項(xiàng)下方法對(duì)22 個(gè)毛白楊花蕾樣品的ABTS 自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定，TEAC 值結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 毛白楊花蕾的體外抗氧化活性(n ＝3)Tab 2 In vitro antioxidant activity of flower buds of Populus tomentosa (n ＝3)

3.4 總黃酮含量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用IBM SPSS Statistics 25 對(duì)毛白楊花蕾的總黃酮含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果呈明顯的正態(tài)分布（P＞0.05）；對(duì)其進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示雌雄花蕾之間的總黃酮含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中雌花蕾的總黃酮含量為24.30 ～27.56 mg·g-1，雄花蕾的總黃酮含量為25.54 ～32.55 mg·g-1。雌雄花蕾之間的結(jié)果比較顯示，雄花蕾中的總黃酮含量高于雌花蕾，說(shuō)明毛白楊的總黃酮含量與性別有關(guān)。

3.5 體外抗氧化活性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用IBM SPSS Statistics 25 分別對(duì)毛白楊雌雄花蕾的TEAC 值（DPPH 法和ABTS 法）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果認(rèn)為均呈明顯的正態(tài)分布（P＞0.05）；對(duì)DPPH 法和ABTS 法各自的TEAC 值分別進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示這兩種方法的TEAC 值在雌雄花蕾之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中DPPH 法毛白楊雌、雄花蕾的TEAC 值分別為15.62 ～24.22 mmol·L-1和20.13 ～29.03 mmol·L-1；ABTS 法毛白楊雌、雄花蕾的TEAC 值分別為19.08 ～21.61 mmol·L-1和20.90 ～26.34 mmol·L-1。雌雄差異之間的結(jié)果比較顯示，雄花蕾的TEAC 值（DPPH 法和ABTS 法）均大于雌花蕾。TEAC 值越大，對(duì)DPPH 和ABTS 自由基的清除能力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)，即雄花蕾的抗氧化活性高于雌花蕾。

3.6 毛白楊花蕾總黃酮含量與其抗氧化活性的相關(guān)性分析

運(yùn)用IBM SPSS Statistics 25 軟件，將22 個(gè)毛白楊花蕾的總黃酮含量與其對(duì)應(yīng)的DPPH 法和ABTS 法所測(cè)定的TEAC 值分別進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表3。兩種活性方法測(cè)定的TEAC 值均與總黃酮含量成正相關(guān)，說(shuō)明毛白楊花蕾的抗氧化活性與其總黃酮含量成正相關(guān)。

表3 毛白楊花蕾總黃酮含量與其抗氧化活性的相關(guān)性Tab 3 Correlation between total flavonoid content and antioxidant activity of flower buds of Populus tomentosa

4 討論

本研究通過(guò)亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測(cè)定了毛白楊雌雄花蕾的總黃酮含量，結(jié)果顯示雌花蕾的總黃酮平均含量為25.60 mg·g-1，雄花蕾的為30.39 mg·g-1，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雄花蕾的黃酮含量高于雌花蕾。黃酮類(lèi)成分多具有抗氧化、抗菌、抗炎等活性[25]，這可能是選擇雄花序入藥的理由之一。此外，通過(guò)DPPH 和ABTS 自由基清除法評(píng)價(jià)和比較毛白楊雌雄花蕾的體外抗氧化活性，認(rèn)為雌雄花蕾均具有一定的抗氧化活性，雌花蕾的平均TEAC 值（DPPH 法和ABTS 法）分別為19.99 mmol·L-1和19.97 mmol·L-1，雄花蕾的平均TEAC 值（DPPH 法和ABTS 法）分別為23.91 mmol·L-1和23.44 mmol·L-1，雌雄花蕾的比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雄花蕾兩種方法的TEAC 值均高于雌花蕾，表明雄花蕾的抗氧化活性高于雌花蕾。兩種方法測(cè)得的毛白楊花蕾的體外抗氧化活性均與其總黃酮含量成正相關(guān)，表明黃酮類(lèi)成分可能是楊樹(shù)花的重要有效成分。

與毛白楊一樣來(lái)源于雌雄異株植物的中藥還有杜仲、天花粉、桑葉等，毛白楊的花蕾入藥是有明確的性別限制，但是，其他品種在實(shí)際的中醫(yī)臨床應(yīng)用中并未進(jìn)行性別的區(qū)別和限制。毛白楊花蕾的抗氧化活性與雌雄有關(guān)，其他品種的中藥是否也存在性別間活性大小的差異，臨床上是否需要進(jìn)行性別的區(qū)分，本研究的結(jié)果給出了一個(gè)新的啟發(fā)。雌雄異株植物在外觀性狀上是存在一定差異的，開(kāi)展化學(xué)成分含量、藥效活性以及臨床效果的差異的研究，不僅將揭示雌雄異株植物的性別本質(zhì)，還將有可能在提高中醫(yī)藥的臨床療效提供新的思考角度。