女貞子多糖提取工藝、結(jié)構(gòu)及藥理作用研究進(jìn)展

廖 杰，桑貞琦，秦路平*，趙琦明*

(1.浙江華才檢測技術(shù)有限公司，浙江 紹興 311899；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310053)

木犀科女貞屬植物約45種[1]。其中，女貞LigustrumlucidumAit.最早記載于《山海經(jīng)》，云：“又東北二百里，曰太山，上多金玉楨木?！痹凇渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中，女貞被列為上品，并以女貞實(shí)入藥，功效為“主補(bǔ)中，安五藏，養(yǎng)精神，除百疾，久服肥健，輕身不老”[2]。女貞實(shí)又稱女貞子、冬青子等，是《中國藥典》中記載的常用中藥，性味甘、苦、涼，歸肝、腎經(jīng)，主要功效為滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)[3]?！稘?jì)急仙方》中記載冬青子搗汁熬膏可用于治療風(fēng)熱赤眼，此用法在《本草綱目》木部女貞中亦有記載?，F(xiàn)代藥理研究表明，女貞子具有保肝、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗炎和降低高膽固醇血癥等多種藥理活性[4]。

多糖作為中藥的重要組成部分，在中藥藥效的發(fā)揮中起到了重要作用，中藥多糖的結(jié)構(gòu)及其藥理作用已成為中醫(yī)藥領(lǐng)域的一個研究熱點(diǎn)[5]。女貞子中含有豐富的多糖成分，這些成分具有良好的抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等活性作用[6-7]。對女貞子多糖(Ligustrum lucidum polysaccharide，LLP)研究已取得了一系列進(jìn)展，但目前尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于LLP的文獻(xiàn)綜述報道。本文歸納了近年來國內(nèi)外文獻(xiàn)，對LLP的提取純化技術(shù)、結(jié)構(gòu)特征及藥理作用等方面進(jìn)行了全面總結(jié)，以期對LLP的研究有一定的指導(dǎo)意義。

文獻(xiàn)已對不同產(chǎn)地、不同部位、不同炮制方法、不同采收期的LLP含量進(jìn)行研究。其中，不同產(chǎn)地或者同一省份不同地區(qū)的LLP含量差異均較大，最低1.525%，廣東深圳最高9.891%，變化幅度極大[8]。女貞各部位的多糖含量順序從高到低為：種子、外果皮、中果皮、全果實(shí)、內(nèi)果皮[9]。女貞子各類炮制品的多糖含量從生品、清蒸、鹽蒸、醋蒸、酒炙品、黃酒蒸、白酒蒸依次降低，為7.82%～6.06%[10]。侯杰等[11]深入研究了酒制法對女貞子中多糖含量的影響，發(fā)現(xiàn)隨著酒燉時間從4～24 h不斷延長，女貞子中多糖含量逐漸減少，而女貞子中的5-羥甲基糠醛(5-HMF)含量逐漸增多，可能在加熱燉煮的條件下，女貞子多糖水解導(dǎo)致其含量的下降。從8月到12月，不同月份采收的女貞子中多糖含量呈先下降、再緩慢上升趨勢，至12月達(dá)到最高含量0.73%[12]。綜上，女貞子最佳采收期應(yīng)該在冬至前后，取女貞子生品來提取其多糖的含量最高，不同產(chǎn)地的女貞子中多糖含量的差異可能是由于環(huán)境因素引起。

近年來，國內(nèi)外已報道了多種提取純化LLP的方法。多糖的提取純化程序較為復(fù)雜，簡言之，先將藥材烘干，研磨成粉末，經(jīng)過石油醚脫脂后(脫脂有時會在提取之后進(jìn)行)，在不同提取方式下選定提取條件處理藥材。得到提取液后，對提取液以Sevage法等方法去除蛋白、活性炭等脫去色素，再以一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液沉淀，并依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀等方式除去水分，最后將濾渣冷凍干燥得粗多糖。粗多糖再經(jīng)過陰離子交換色譜柱和凝膠色譜柱分離純化為精制多糖，整個過程如圖1所示。

圖1 女貞子多糖的提取純化工藝

1 女貞子多糖的提取工藝

傳統(tǒng)的多糖提取方法主要包括浸提、回流提取和輔助提取方法(如超聲提取法和微波提取法)。另有新興的酶解提取法能更溫和且穩(wěn)定地解離細(xì)胞壁，提高藥材內(nèi)活性成分的溶出效率。多糖提取效率的影響因素包括提取料液比、提取溫度、提取時間、次數(shù)和提取方法自帶的參數(shù)如超聲頻率、酶濃度等。表1總結(jié)了已有文獻(xiàn)中提取參數(shù)和純化步驟對多糖產(chǎn)率的影響。

表1 女貞子多糖的提取純化工藝

目前，提取所得的多糖含量測定方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、改良-差示酚硫法三種，其中苯酚-硫酸法簡單、高效、靈敏、重復(fù)性好，主要用于甲基化的糖、戊糖、寡糖類以及多聚糖的測定，但苯酚具有毒性，且可能誘導(dǎo)某些多糖發(fā)生副反應(yīng)。蒽酮-硫酸法毒性小、副反應(yīng)少，能測定絕大部分碳水化合物，但穩(wěn)定性較差，需要現(xiàn)配現(xiàn)用和避光操作[13]。改良-差示酚硫法是一種苯酚-硫酸法的改良方法，此方法減去了多糖以外干擾成分所產(chǎn)生的吸光度，再計(jì)算相對吸收系數(shù)，能更準(zhǔn)確地檢測多糖含量，目前已有研究用此方法檢測LLP的提取率[14]。此外，ALBALASMEH等[15]利用糖類與濃硫酸反應(yīng)生成的糠醛衍生物的紫外吸收，建立一種多糖測定的新方法，對廣泛使用的苯酚-硫酸方法進(jìn)行了重大改進(jìn)，能消除著色步驟并避免與苯酚使用相關(guān)的健康和環(huán)境危害。

1.1 溶劑提取法

溶劑提取法主要選用水作為溶劑提取多糖，有回流提取和浸提兩種方式。邱蓉麗等[16]采取回流提取，分別研究了水提工藝與醇沉工藝，通過浸膏得率和其中多糖含量的比值來評價工藝的優(yōu)劣，最終確定最佳參數(shù)為料液比1∶16，提取2次，每次2 h，濾液濃縮比為1∶3，再以70%體積分?jǐn)?shù)的乙醇沉淀，靜置時間6 h，驗(yàn)證所得結(jié)果浸膏得率為10.47%，多糖含量52.8%。張明月等[17]以料液比1∶10，提取3次，每次3 h，回流提取粗多糖，通過計(jì)算女貞子樣品中多糖質(zhì)量比較工藝參數(shù)，最終提取率為1.24%?；亓魈崛儆趥鹘y(tǒng)方式，安全簡便且應(yīng)用廣泛，但水提回流溫度較高，可能會導(dǎo)致部分多糖分解，使得多糖提取率較低。

浸提比回流提取溫度低，能更好地保留藥材中熱敏感的成分，但是浸出效率較低。王陽陽等[18]采取熱水浸提的方式對女貞子多糖進(jìn)行提取，最佳提取工藝條件為料液比1∶20，提取溫度75 ℃，提取時間3 h，次數(shù)1次，提取率為3.18%。

1.2 輔助提取法

現(xiàn)有的女貞子多糖相關(guān)文獻(xiàn)中，輔助提取法有微波輔助和超聲波輔助兩種。微波和超聲波能有效加速胞內(nèi)有效物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解，增加多糖的提取效率。李彬等[19]利用微波輔助提取，以正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化女貞子中多糖的提取工藝，并對各因素影響多糖提取率的強(qiáng)度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)提取時間對多糖提取率的影響最大，其次是提取溫度、料液比，最次是乙醇的體積分?jǐn)?shù)。最佳工藝參數(shù)：微波處理50 s，料液比1∶20，浸提溫度50 ℃，時間50 min，乙醇的體積分?jǐn)?shù)25%，經(jīng)純化后提取率達(dá)到5.6%。徐平平等[20]采取超聲波輔助提取，在超聲功率600 W，液料比為60 mL/g，超聲時間為10.44 min條件下，平行3次實(shí)驗(yàn)，所得平均提取率為3.15%。微波輔助和超聲輔助提取法的提取時間均明顯低于溶劑提取法，但此類輔助提取法還存在提取力度不均勻的現(xiàn)狀，受儀器影響較大。

1.3 酶解提取法

酶法提取由于反應(yīng)條件相對溫和，不會破壞多糖的結(jié)構(gòu)，具有效率高、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，近年來得到廣泛關(guān)注。酶解提取的步驟一般為將藥材烘干，粉碎，加入酶溶液，充分混勻后提取，沸水浴滅活，抽濾，定容即得。影響因素包括酶解時間、溫度、酶量和pH值。酶解的方法分單一酶解法和復(fù)合酶解法。周旋等[21]利用單一纖維素酶提取女貞子多糖，酶解2 h、溫度40 ℃、酶量1%和pH=5.2，優(yōu)化條件后提取率高達(dá)6.58%，此提取率明顯高于輔助提取法和溶劑提取法。另有研究使用復(fù)合酶(纖維素酶∶木瓜蛋白酶=1∶2)，酶量2%，料液比1∶50，pH值為4，溫度為50 ℃，提取1 h，最終得到女貞子多糖提取率15.93%[22]，是目前所有提取方法中的提取率最高者。但是以上兩種酶法均未對多糖除雜，其提取率僅供參考，而且酶法為保護(hù)酶活性對操作要求較高，存在貯存不易等缺陷。

1.4 超臨界萃取法

超臨界萃取(Supercritical fluid extraction，SFE)是利用溶劑(流體)在超臨界狀態(tài)與非超臨界狀態(tài)下對溶質(zhì)溶解能力的巨大差異來實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)成分的提取和分離的方法，具有時間短、選擇性好、適應(yīng)性廣、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。有研究將女貞子粉末在萃取壓力240 MPa、溫度45 ℃、時間1 h的條件下進(jìn)行超臨界流體萃取，能除去女貞子粉末中含有的大量非極性成分，再經(jīng)過回流提取(料液比1∶10，50 ℃水浴提取1.5 h，提取2次)，所得女貞子多糖雜質(zhì)少、純度高，其提取率為3.614%[23]。

2 女貞子多糖的分離純化

粗多糖中含有蛋白質(zhì)、色素、水等雜質(zhì)，需要進(jìn)一步除雜純化。脫蛋白作為粗多糖純化的重要步驟之一，會造成多糖的損耗，對多糖的最終產(chǎn)率有較大影響。目前多糖脫蛋白過程主要采用Sevage法和三氯乙酸法。Sevage法是通過在粗多糖溶液中加入氯仿-正丁醇(4∶1)混合溶液，將游離蛋白變性沉淀，經(jīng)離心除去沉淀，但是部分多糖也會被沉淀，同時此法難以洗脫少量與多糖結(jié)合牢固或被多糖包裹的蛋白質(zhì)[12]。Sevage法能避免多糖降解，但是效率低下，會消耗大量有機(jī)試劑，不適用于高蛋白含量的女貞子多糖。相比之下，三氯乙酸法除蛋白效率較高，但由三氯乙酸的酸性較強(qiáng)，容易導(dǎo)致多糖的降解。萬琴等[24]比較了Sevage法、三氯乙酸法和三氯乙酸-Sevage法的脫蛋白效果，兼顧女貞子多糖損失率和蛋白質(zhì)清除率后，選擇三氯乙酸法，所得女貞子粗多糖的多糖含量38.23%、蛋白清除率82.81%。

粗多糖除雜后，經(jīng)一系列吸附劑和洗脫液進(jìn)一步收集、透析、濃縮和凍干，可分離成單一多糖，進(jìn)而研究多糖的平均分子量、單糖組成和結(jié)構(gòu)特征。女貞子多糖的分離多使用DEAE-52等陰離子交換柱和Sephadex G、Sepharose CL-2B、Superdex系列分子篩凝膠柱，經(jīng)水或不同濃度氯化鈉溶液洗脫，得到精制多糖。其原理在于多糖可在水溶液中發(fā)生一定程度的電離，離子交換樹脂能吸引水中離子化的多糖，交換常數(shù)K值愈高，被吸附愈牢；洗脫時，通過增加溶液的離子強(qiáng)度，如改變pH、增加鹽濃度，多糖就會被取代而解吸下來，按照洗脫劑的K值不同，分不同區(qū)帶，得到電離程度不同的多糖。而在分子篩凝膠柱中，大于孔徑的多糖分子被阻隔在外水層最早被洗脫，而進(jìn)入孔徑的多糖分子按分子量大小分離成不同的區(qū)帶，從而得到分子量大小不同的多糖成分[25]。LIU等[26]用Sephadex G-200柱層析分離從金葉女貞LigustrumvicaryiL.中提取的女貞子粗多糖，得到純化的LVFP。此外，女貞花中也含有大量多糖成分，YIN等[27]將女貞花粗多糖通過DEAE-52纖維素柱層析法初步純化，分別用0.1、0.2、0.3 mol/L NaCl分離出三種多糖LL-1/2/3。再經(jīng)過Sephadex G-100柱層析得到LLP-1a、LLP-1b、LLP-2、LLP-3。

3 女貞子多糖的組分分析

多糖是一種重要的生物高分子化合物，分為由同一單糖分子縮合而成的均一多糖和由不同單糖分子縮合而成的非均一多糖。由于多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，對多糖組分的精細(xì)結(jié)構(gòu)分析仍然十分困難。目前對女貞子中不同類型多糖的研究主要涉及平均分子量、單糖組成和糖鏈構(gòu)型。一般采用紫外可見光譜(Ultraviolet absorption detector，UV)、高效液相色譜(High performance liquid chromatography，HPLC)、氣-質(zhì)聯(lián)用色譜(Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)、毛細(xì)管電泳(Capillary electrophoresis，CE)、氣相色譜(GC)和纖維素板檢測多糖的純度和單糖組成。液相色譜法(Liquid chromatography，LC)、高效凝膠色譜(High-performance gel filtration chromatography，HPGFC)分析平均分子量。通過傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)、核磁共振(Nuclear magnetic resonance，NMR)、原力顯微鏡(Atomic force microscope，AFM)等技術(shù)進(jìn)行分析檢測多糖構(gòu)型。表2總結(jié)了已報道的女貞子多糖的單糖組成和平均分子量。

表2 女貞子多糖的組分分析

3.1 平均分子量

多糖分子量檢測在過去一般使用滲透壓法、端基法、黏度法和光散射法[31]，但操作復(fù)雜，容易產(chǎn)生誤差。目前的常用方法是HPGFC、LC和HPLC，需使用分子量已知的標(biāo)準(zhǔn)多糖作為對照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。早期，方玉春[32]使用HPLC測定多糖分子量，將分離得到的LL-1進(jìn)樣后得到一個單一的對稱峰，再以標(biāo)準(zhǔn)多糖系列繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得該多糖分子量為15 000 Da。戰(zhàn)興曉等[33]采用凝膠色譜法，以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)多糖，得重均相對分子質(zhì)量(Weight-average molecular weight，Mw)為10 673 Da及數(shù)均相對分子質(zhì)量(Number-average molecular weight，Mn)為10 721 Da，實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算所得Mw/Mn值約為1.0。Mw/Mn越接近1代表多糖純度高、相對分子質(zhì)量集中，由此可知該女貞子多糖為均一多糖。平均分子量的測定會受到原藥材、提取分離方法、儀器等的影響，依托譜圖及Mw/Mn計(jì)算有助于辨別多糖屬于均一多糖還是非均一多糖。

3.2 結(jié)構(gòu)特征

多糖具有比蛋白質(zhì)更復(fù)雜的大分子結(jié)構(gòu)，而單糖所具備的多樣性、連接方式以及支鏈的復(fù)雜性都是分析路上的重點(diǎn)難題。目前，多糖的主要結(jié)構(gòu)是鑒定的目標(biāo)，研究主要分析多糖的平均分子量、單糖的類型、比例和連接順序，以及糖苷鍵的構(gòu)型?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中LLP的單糖種類有甘露糖(Mannose，Man)、鼠李糖(Rhamnose monohydrate，Rha)、阿拉伯糖(Arabinose，Ara)、葡萄糖(Glucose，Glu)、巖藻糖(Fucose，F(xiàn)uc)、半乳糖(Galactose，Gal)、木糖(Xylose，Xyl)、果糖(Fructose，F(xiàn)ru)七種，其中Glu、Ara、Rha為主要單糖。常用的多糖結(jié)構(gòu)分析方法有高碘酸氧化、Smith降解法和甲基化反應(yīng)[32]。方玉春[32]從女貞子中分離得到的白色粉末狀女貞子多糖LL-1，經(jīng)多種方式分析，包括甲基化反應(yīng)GM-SM分析、過碘酸鹽氧化UV法測定、Smith降解反應(yīng)GC分析、13C-NMR測定，得LL-1的化學(xué)結(jié)構(gòu)為α-D-(1→3)Manp和1、4、6三取代的α-D-Galp組成主鏈的多糖，側(cè)鏈上的α-L-Araf位于末端位置，通過分枝點(diǎn)三取代的Gal同主鏈相聯(lián)。CE是在高壓直流電場作用下，在熔融石英毛細(xì)管中根據(jù)不同的電泳速度進(jìn)行分離的一種分析方法。WANG等[34]將1 g LLPS用2 mol/L硫酸在沸水浴和氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流10 h，水解為單糖的混合物，稀釋至250 mL，再稀釋200倍，得20 μg/mL LLPS進(jìn)行CE分析，發(fā)現(xiàn)LLPS中含有Fuc、Glu、Ara和Rha，摩爾比為1.80∶4.58∶2.55∶1.91。徐平平等[35]將粗多糖經(jīng)Sephadex G-150柱層析并用水洗脫，得到白色粉末狀女貞子多糖，再AFM分析，結(jié)果顯示，分離得到的LL-Ⅰ1、LL-Ⅰ2、LL-Ⅲ分別不同程度地聚集成股，且具有螺旋結(jié)構(gòu)。這種現(xiàn)象可能與聚集體的分子間相互作用和糖鏈間的氫鍵締合有關(guān)。

4 藥理作用

現(xiàn)代研究表明，LLP具有各種生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗炎、保肝、抗衰老、降血糖等。表3選取了有代表性的文獻(xiàn)，對多糖提取方式、動物模型、藥理作用及作用機(jī)制進(jìn)行了整理歸納。

表3 女貞子多糖的藥理研究

4.1 抗氧化作用

脂質(zhì)過氧化是氧自由基損傷組織的重要方式，氧自由基會使細(xì)胞膜脂質(zhì)成為過氧化脂質(zhì)，從而分泌出丙二醛(Malondialdehyde，MDA)與細(xì)胞成分結(jié)合產(chǎn)生脂褐質(zhì)(Lipofuscin，LF)，而脂褐質(zhì)會表現(xiàn)在人皮膚表面，是一種衰老的象征。在D-半乳糖衰老小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，女貞子多糖可以通過清除·OH、提高肝腎組織中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)及谷胱甘肽過氧化物(Glutathione peroxidase，GSH-Px)活力，從而發(fā)揮抗脂質(zhì)過氧化作用[37]。

朱琪等[39]研究了仔豬肝臟相關(guān)基因，結(jié)果顯示女貞子多糖可以提高仔豬肝臟中過氧化氫酶(Catalase，CAT)和CuZnSOD的轉(zhuǎn)錄水平，從而清除體內(nèi)過量的氧自由基。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路中的Ras/Raf/MEK/ERK信號通路是目前較為認(rèn)可的一條通路，它由細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular-signal regulated protein kinase，ERK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)四種重要的蛋白激酶組成，其中ERK調(diào)控細(xì)胞生長和分化能夠起到保護(hù)細(xì)胞的作用，而P38和JNK在炎癥和細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，所以抑制ERK信號通路之后，可以緩解氧化損傷對細(xì)胞的損害，如圖2。研究發(fā)現(xiàn)，仔豬大腸桿菌+女貞子多糖組的肝臟mRNA轉(zhuǎn)錄水平ERK1與大腸桿菌組相比顯著降低，而女貞子多糖組與對照組相比無明顯差異，但P38和JNK基因表達(dá)相對較低。綜上所述，女貞子多糖對感染大腸桿菌的斷奶仔豬起到了保護(hù)作用，且對正常仔豬沒有不良影響，其作用機(jī)制可能與下調(diào)MAPK相關(guān)信號轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)。

圖2 女貞子多糖抗氧化作用機(jī)制相關(guān)的MAPK信號通路

4.2 免疫調(diào)節(jié)作用

免疫系統(tǒng)是一套疾病防御系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn)有多種疾病是由于免疫系統(tǒng)紊亂導(dǎo)致的[40]。LIU等[26]利用環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX/CY)誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠模型，發(fā)現(xiàn)金葉女貞子多糖可顯著提高脾/胸腺指數(shù)(Spleen indexes/thymus indexes，SI/TI)，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的吞噬功能，激活B、T淋巴細(xì)胞，上調(diào)血清白細(xì)胞介素10(Interleukin-10，IL-10)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平,提高SOD和GSH-px水平，從而緩解CY誘導(dǎo)的肝損傷。近年，JING等[6]研究觀察了女貞子多糖對氫化可的松免疫抑制小鼠模型免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)其明顯增強(qiáng)了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力。巨噬細(xì)胞在女貞子多糖對脾T、B細(xì)胞的增殖反應(yīng)中也起一定的輔助作用[41]。李璘等[42]研究表明女貞子多糖能增強(qiáng)荷瘤小鼠單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)荷瘤小鼠脾B、T淋巴細(xì)胞的增殖，提高其自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cell，NK)活性，從而增強(qiáng)免疫抑制狀態(tài)小鼠的細(xì)胞免疫作用，但對正常小鼠的特異性細(xì)胞免疫無明顯影響。

硒(Se)和維生素E都是抗氧劑，具有活化免疫系統(tǒng)、預(yù)防癌癥的功效。目前采用葉面噴施Na2SeO3的方法培養(yǎng)出了一種富硒的女貞子，Se在女貞子中含量從原植物的0.03 μg/g提高到0.93 μg/g[43]。鄒慧等[44]研究結(jié)果顯示，Se含量為1.88 μg/g女貞子的多糖成分與普通女貞子對比，SI/TI更高，脾淋巴細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)，IL-2/4、γ-干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)生成更多，但對特異性卵清抗體的生成影響不大。勞雪芬等[45-46]通過體內(nèi)小鼠實(shí)驗(yàn)和體外山羊外周血淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)富硒女貞子(1.88 μg/g)多糖能促使細(xì)胞分泌的IL-2/4、IFN-γ數(shù)量增多或活性增強(qiáng)，進(jìn)而發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用。

4.3 抗衰老作用

衰老是一個正常的生理過程，在衰老的過程中，機(jī)體會逐漸破壞自身的高分子、細(xì)胞、組織、器官等[47]。張振明等[48]利用D-半乳糖造模衰老小鼠，通過檢測SI/TI、LF、MDA、SOD和GSH-px水平判斷女貞子多糖的抗衰老作用，發(fā)現(xiàn)女貞子多糖能顯著抑制SI/TI、SOD和GSH-px活性的下降,抑制心肝腎組織中MDA和腦組織中LF含量的升高，其機(jī)制可能與增強(qiáng)免疫功能、清除氧自由基和活性氧、提高機(jī)體抗氧化酶活力有關(guān)。這與上文抗氧化作用和免疫調(diào)節(jié)作用中含量變化一致，故而推測女貞子多糖的抗衰老作用可能是通過抗氧化和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)。

4.4 抗腫瘤作用

目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種從植物中分離得到的多糖具有良好的抗腫瘤活性，而且無明顯毒副作用[49]。李璘等[50-52]研究報道了女貞子多糖的抗腫瘤活性，通過檢測瘤重、T淋巴細(xì)胞增殖情況、NK細(xì)胞活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示女貞子多糖能提高機(jī)體免疫、改善機(jī)體免疫能力，抑制小鼠肉瘤(S180)和肝癌(H22)生長，抑制黑色素瘤細(xì)胞B16BL6黏附能力，提高淋巴瘤細(xì)胞膜抗原性，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。馬秀梓等[7]對比了枸杞多糖、當(dāng)歸多糖和女貞子多糖的抗腫瘤活性，以用于人白血病K562細(xì)胞48 h后的抑瘤效果，其中女貞子多糖的作用最為顯著。

4.5 保肝作用

女貞子作為補(bǔ)益肝腎的養(yǎng)陰藥，其多糖的保肝作用得到了初步研究。肝細(xì)胞變性或壞死、細(xì)胞膜破裂或膜通透性升高都會導(dǎo)致谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT/ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT/AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)及堿性磷酸酶(AP)進(jìn)入血液系統(tǒng)，使得血清中此類酶濃度升高。呂娟濤等[53]以CCl4致肝損傷小鼠為模型，發(fā)現(xiàn)女貞子多糖可對抗肝損傷小鼠血清ALT、AST、γ-GT、AP和肝指數(shù)(Hepatic Index，HI)的升高，具有明顯的對抗肝損傷作用。在同種小鼠模型下，朱琪等[54]研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，女貞子多糖不僅可以緩解肝損傷，而且對小鼠生長性能無顯著影響。同時，朱琪團(tuán)隊(duì)在對女貞子多糖信號通道的研究中發(fā)現(xiàn)，女貞子多糖不會影響仔豬肝臟TNF-α的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而且能降低大腸桿菌攻毒后的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，這表明女貞子多糖對肝組織的保護(hù)機(jī)理與其抑制急性炎癥因子作用相關(guān)[39]。

4.6 抗炎作用

許多疾病的發(fā)病機(jī)制都是由炎癥引起的，例如無精子癥。在睪丸受到炎癥等的侵害時，睪丸支持細(xì)胞(Sertoli cell)能通過改變細(xì)胞因子的分泌為睪丸提供保護(hù)。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是一種主要的致炎因子，能誘導(dǎo)Sertoli細(xì)胞分泌炎癥因子，造成炎癥損傷。余亮亮等[55]發(fā)現(xiàn)女貞子多糖的含藥血清可減少細(xì)胞的凋亡，對抗LPS造成的SOD、CAT 和 GSH-Px 活性均明顯降低和MDA 濃度明顯增加，對炎癥損傷有保護(hù)作用，而且對Sertoli細(xì)胞分泌的炎癥因子也具有調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，女貞子多糖的含藥血清可以明顯減輕LPS對Sertoli細(xì)胞能量代謝關(guān)鍵酶，琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase，SDH)和乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)的活性損傷，進(jìn)而有效提高乳酸(Lactic acid，LD)和三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)的含量，這可能是女貞子多糖提高細(xì)胞增殖、減少細(xì)胞凋亡的原因之一[56]。

4.7 其他藥理作用

女貞子多糖除了上述活性作用外，還有補(bǔ)血、抗肥胖、降血糖的作用[57-59]。另外，女貞子多糖和菟絲子多糖具有協(xié)同抗衰老作用，其機(jī)制與調(diào)節(jié)免疫和抗氧化作用相關(guān)[60]。同時，女貞子多糖還可與西藥聯(lián)用增強(qiáng)藥效，如吳振奎等[61]發(fā)現(xiàn)女貞子多糖與布地奈德聯(lián)用可顯著降低哮喘幼鼠的支氣管高反應(yīng)性，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞數(shù)量，減輕肺部炎癥反應(yīng)，抑制氧化應(yīng)激，具有治療哮喘的潛力。除女貞果實(shí)外，YIN等[27]研究了女貞花多糖對體外血漿凝血的參數(shù)：活化部分凝血活酶時間(Activated partial thromboplastin time，APTT)、血漿凝血酶原時間(Prothrombin time，PT)、凝血酶時間(Thrombin time，TT)和纖維蛋白原(Fibrinogen，F(xiàn)IB)，實(shí)驗(yàn)分離得到4個多糖，結(jié)果顯示在體外LLp-1a和LLp-3具有良好的抗凝活性，而LLp-1b具有促凝效果。

5 討論與展望

女貞子是一種歷史悠久，用法多樣，療效卓著的補(bǔ)益類中藥，從中提取得到的多糖類成分在畜禽養(yǎng)殖業(yè)和醫(yī)藥業(yè)中具有良好的應(yīng)用前景。目前，LLP的研究主要集中于提取分離、純化、結(jié)構(gòu)分析和藥理作用。綜合LLP的提取工藝，其中復(fù)合酶法提取的效率最高，但也有缺陷，如操作復(fù)雜、儲存不易等，而其純化方法繁雜且多糖損失率較大。LLP的結(jié)構(gòu)研究主要在初級結(jié)構(gòu)，對空間構(gòu)象研究較少。藥理作用的研究中LLP具有多種生物活性，包括抗氧化性、抗腫瘤性、抗炎性、保肝作用、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、補(bǔ)血、降血糖、抗肥胖作用。然而，大多數(shù)研究只報告了LLP的細(xì)胞或動物體內(nèi)藥理活性，對單個多糖的完整結(jié)構(gòu)研究不足，大部分都處于初步探討階段，缺乏對均一性多糖活性的研究，而且其多糖與生物活性之間的關(guān)系尚不清楚，仍有許多值得探討的方面。

因此，為了更好地研究LLP，可采取的措施包括：①通過協(xié)同提取的方式平衡各方法的優(yōu)缺點(diǎn)，提高提取純化效果，得到量大且優(yōu)的LLP；②利用網(wǎng)絡(luò)模型模擬空間構(gòu)象，更直觀地描繪出LLP的立體結(jié)構(gòu)，為研究其高級構(gòu)象提供思路；③從基因調(diào)控、蛋白表達(dá)、代謝組學(xué)角度等角度探求LLP對疾病的作用機(jī)制，為深入研究LLP在動物及人體的生物學(xué)作用提供科學(xué)依據(jù)，有助于進(jìn)行體內(nèi)觀察和臨床研究。綜上，本文系統(tǒng)地闡述了LLP提取工藝、結(jié)構(gòu)及藥理作用的研究進(jìn)展，以期為LLP的深入開發(fā)和研究提供一些有益借鑒。